李笑梅，馬慧玲

（哈爾濱商業(yè)大學 黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

兩株素食者腸道菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶考察及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

李笑梅，馬慧玲

（哈爾濱商業(yè)大學 黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

采用對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷法，與黑曲霉相比較考察素食者腸道菌LJ-G1、LJ-Q2產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力，再經(jīng)單因素、響應面試驗對菌種的產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明：LJ-G1、LJ-Q2菌株均能產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，且LJ-Q2產(chǎn)酶能力高于LJ-G1，與黑曲霉相比較，在發(fā)酵時間短于64 h時LJ-G1、LJ-Q2產(chǎn)酶能力高于黑曲霉；LJ-Q2菌種的最優(yōu)產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)基pH 8.0、培養(yǎng)溫度38 ℃、培養(yǎng)時間38 h。在最優(yōu)條件下進行驗證實驗，酶活力達到1.70 IU/mL。加入大豆異黃酮原料進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到游離大豆異黃酮轉(zhuǎn)化率為39.4%。

素食者；腸道菌；β-葡萄糖苷酶；產(chǎn)酶條件

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）又叫β-D-葡萄糖苷水解酶，可以將結(jié)合型的大豆異黃酮水解為糖基和游離型的大豆苷元[1-2]。在人體內(nèi)糖苷型的異黃酮不能直接被吸收，而是先被小腸的β-葡萄糖苷酶水解后脫去糖基進入血液中，才能發(fā)揮各種生理作用[3]。腸道細菌在異黃酮的代謝中起到了關鍵的作用[4]，部分益生菌還可以將大豆苷元進一步代謝為雌馬酚，與苷元相比它與雌激素受體的結(jié)合力更強[5]。

現(xiàn)今產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌種研究主要集中在酵母[6]、曲霉、木霉以及細菌內(nèi)[7]。其中曲霉被普遍認為是產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的優(yōu)良菌種，尤以黑曲霉的效率最高[5]。但是黑曲霉發(fā)酵到達產(chǎn)酶高峰期要96～144 h[8-9]，工業(yè)化生產(chǎn)周期較長成本較大。近幾年益生菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶發(fā)酵大豆異黃酮呈現(xiàn)研究熱，有些益生菌[10-11]不僅可以轉(zhuǎn)化糖苷型大豆異黃酮，還有維持腸道、生殖系統(tǒng)、皮膚等正常菌群，抗感染、助降低膽固醇、抑制癌細胞和增強免疫功能等[12]。LJ-G1、LJ-Q2兩株菌是從素食者糞便中分離出來的具有代謝大豆異黃酮產(chǎn)雌馬酚的能力[13-14]，大豆苷元是此代謝過程的中間產(chǎn)物之一[1]，所以推測兩種菌株可能有產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力，而且兩種腸道菌的生長曲線表明[15]，指數(shù)生長期6～24 h、穩(wěn)定期24～39 h活菌數(shù)達到最大值。據(jù)此研究探討LJ-G1、LJ-Q2腸道菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶特性及產(chǎn)酶條件優(yōu)化，旨在為豐富產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌種理論知識，也為后續(xù)開發(fā)以復合生物發(fā)酵法制備大豆苷元提供適宜的菌株資源和工藝技術(shù)參數(shù)，具有實際應用意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

對照菌株：黑曲霉（Aspergillus niger）由哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院微生物實驗室提供；菌株LJ-G1、LJ-Q2從素食者糞便中分離獲得。

對硝基苯酚、檸檬酸 天津市光復精細化工研究所；對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷 上海金穗生物科技有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

腦心浸出液培養(yǎng)基（brain heart influsion broth，BHI）青島海博生物技術(shù)有限公司。

麩皮培養(yǎng)基：麩皮0.5%、(NH4)2SO40.4%、K2HPO40.3%、MgSO40.05%、CaCl20.05%、FeSO40.005%、ZnCl20.000 14%、吐溫-80 20 μL，pH 4.8。

1.3 儀器與設備

Agilent 1200LC高效液相色譜 美國安捷倫公司；722型光柵分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；超凈操作臺 上海凈化設備有限公司；YQX-II型培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療機械有限公司。

1.4 方法

1.4.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的初篩方法

采用顯色反應[16]，判斷是否產(chǎn)β-葡萄糖苷酶。用0.1%的剛果紅對形成單菌落的平板染色處理10 min，再用1 mol/L的NaCl溶液脫色20 min，如果菌落周圍產(chǎn)生透明圈說明該菌有產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力。

1.4.2 3 種菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活力比較

采用以對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenylβ-D-glucopyranoside，pNPG）為底物測定酶活力[17-19]。

1.4.2.1 對硝基苯酚標準曲線的繪制

用pH 5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液配制濃度為0、10、20、30、40、50、60 μmol/L的對硝基苯酚溶液，分別取2 mL上述稀釋后的溶液至10 mL比色管中，于45 ℃水浴鍋中水浴30 min后，加入4 mL 0.5 mol/L的碳酸鈉溶液，混合均勻，于試管架中冷卻至室溫。在400 nm波長處測定吸光度（A400nm），繪制標準曲線。

1.4.2.2 培養(yǎng)基中酶活力的測定

將所試菌種黑曲霉接種于麩皮液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24～144 h；LJ-G1、LJ-Q2腸道菌分別接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24～144 h，每12 h測一次酶活力。各培養(yǎng)時段的培養(yǎng)基經(jīng)3 000 r/min離心20 min，得3 種粗酶液，各吸取2 mL于比色管中，再分別加入10 mL pH 5.0的緩沖液，2 mL 50 mmol/L對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液。其余實驗過程同1.4.2.1節(jié)。參比溶液：以2 mL未發(fā)酵培養(yǎng)基代替發(fā)酵培養(yǎng)基。

酶活力定義：每分鐘水解生成1 μmol/L對硝基苯酚所需要的酶量為一個酶活力單位。按公式（1）計算酶活力[20-23]。

式中：X為發(fā)酵培養(yǎng)基中粗酶液酶活力/（IU/mL）；c為根據(jù)實際樣液的吸光度計算出的對硝基苯酚濃度/（μmol/L）；N為試樣溶液反應前的總稀釋倍數(shù)；t為反應時間/min；V為酶反應液用量/mL。

1.4.3 產(chǎn)酶條件單因素試驗

在篩選出產(chǎn)酶優(yōu)勢菌株的前提下，進行產(chǎn)酶單因素試驗。固定因素水平設定為培養(yǎng)基pH 7.0、接種量5%、培養(yǎng)溫度37 ℃、培養(yǎng)時間36 h，在此基礎條件下，以酶活力為評價指標，選出適宜因素水平范圍。

1.4.3.1 培養(yǎng)基初始pH值對菌種產(chǎn)酶酶活力的影響

在接種量5%、培養(yǎng)溫度37 ℃、培養(yǎng)時間36 h條件下，分別考察培養(yǎng)基初始pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0對菌種產(chǎn)酶活力的影響。

1.4.3.2 培養(yǎng)時間對菌種產(chǎn)酶酶活力的影響

在培養(yǎng)基初始pH 7.0、接種量5%、培養(yǎng)溫度37 ℃條件下，分別考察培養(yǎng)時間在24、36、48、60、72 h時對菌種產(chǎn)酶活力的影響。

1.4.3.3 培養(yǎng)溫度對菌種產(chǎn)酶酶活力的影響

在培養(yǎng)基初始pH 7.0、接種量5%、培養(yǎng)時間36 h條件下，分別考察培養(yǎng)溫度為33、35、37、39、41 ℃時對菌種產(chǎn)酶活力的影響。

1.4.3.4 接種量對菌種產(chǎn)酶酶活力的影響

在培養(yǎng)基初始pH 7.0、培養(yǎng)溫度37 ℃、培養(yǎng)時間36 h條件下，分別考察1%、3%、5%、7%、9%接種量對菌種酶活力的影響。

1.4.4 響應曲面優(yōu)化產(chǎn)酶條件

以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，設計培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間三因素做響應曲面試驗。以培養(yǎng)基中的酶活力為指標，確定最佳產(chǎn)酶條件。

1.4.5 最優(yōu)產(chǎn)酶條件下大豆苷元轉(zhuǎn)化率的測定

采用高效液相色譜法測定，固定相為Agilent1200 LC C18柱（250 mmh4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水，0 min 20∶80（V/V，下同），40 min 60∶40，進行梯度洗脫，流速為1.2 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測波長為259 nm。將配制成的0.048、0.096、0.144、0.192、0.24 mg/mL系列質(zhì)量濃度大豆異黃酮混合標準溶液[18]依次進樣。利用峰面積繪制標準曲線。根據(jù)公式（2）計算大豆異黃酮含量。

式中：ρ為由各類型大豆異黃酮回歸方程得出其質(zhì)量濃度/（μg/mL）；m為樣品質(zhì)量/g；V為定容體積/mL。

將菌液接種培養(yǎng)基中，再加入0.3 g大豆異黃酮粉，在最優(yōu)條件下發(fā)酵培養(yǎng)，然后培養(yǎng)液經(jīng)3 000 r/min離心30 min，吸取上清液進入高效液相色譜進行檢測，與未接菌培養(yǎng)基進行比較，計算游離型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化率。

式中：m1為原料中游離型異黃酮含量/mg；m2為發(fā)酵后游離型異黃酮含量/mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力顯色反應結(jié)果

LJ-G1桿菌、LJ-Q2球菌均產(chǎn)生透明圈，說明兩種菌具有產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力。

2.2 3 種菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力比較

圖1 3 種菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活力的比較Fig.1 Comparison of β-glucosidase activities from three strains

由圖1可知，3 種菌在培養(yǎng)36 h時均產(chǎn)酶，酶活力最高的是LJ-Q2，達到1.60 IU/mL。此時黑曲霉產(chǎn)酶能力最低，隨著培養(yǎng)時間的增加，黑曲霉產(chǎn)酶能力逐漸增加，而LJ-Q2、LJ-G1產(chǎn)酶能力逐漸降低，當培養(yǎng)時間達到64 h時，3 種菌產(chǎn)酶能力相同，之后產(chǎn)酶能力從大到小順序為黑曲霉＞LJ-Q2＞LJ-G1。故以下優(yōu)化試驗均用LJ-Q2菌種。

2.3 產(chǎn)酶條件單因素試驗

2.3.1 培養(yǎng)基初始pH值對菌種產(chǎn)酶活力的影響

一銨國內(nèi)市場高位盤整，出廠報價受成本支撐，仍處高位，價格暫無下滑風險。二銨方面，秋季節(jié)市場需求釋放，出口市場較為穩(wěn)定，內(nèi)銷市場仍在加大，估計后期冬儲市場價格仍會有所上揚。

圖2 培養(yǎng)基初始pH值對菌種產(chǎn)酶活力的影響Fig.2 Effect of initial medium pH on β-glucosidase activity

如圖2所示，當培養(yǎng)基初始pH值為4.0時菌株產(chǎn)酶能力較低，當pH值為8.0時產(chǎn)酶能力達到最高，之后酶活力開始下降，表明LJ-Q2在培養(yǎng)基初始pH值為7.0～9.0時產(chǎn)酶能力相對較強。

2.3.2 培養(yǎng)時間對菌種產(chǎn)酶活力的影響

圖3 培養(yǎng)時間對菌種產(chǎn)酶活力的影響Fig.3 Effect of incubation time on β-glucosidase activity

如圖3所示，菌株在培養(yǎng)時間達到36 h時產(chǎn)酶能力達到最高，之后酶活力隨培養(yǎng)時間的延長而下降，表明該菌的最適培養(yǎng)時間在24～48 h。

2.3.3 培養(yǎng)溫度對菌種產(chǎn)酶活力的影響

圖4 培養(yǎng)溫度對菌種產(chǎn)酶活力的影響Fig.4 Effect of culture temperature on β-glucosidase activity

如圖4所示，培養(yǎng)溫度為33 ℃時，菌株產(chǎn)酶能力較低，當培養(yǎng)溫度達到39 ℃時菌株產(chǎn)酶能力達到最高，此后隨著溫度升高酶活力下降，表明該菌最適培養(yǎng)溫度為37～41 ℃。

2.3.4 接種量對菌種產(chǎn)酶活力的影響

圖5 接種量對菌種產(chǎn)酶活力的影響Fig.5 Effect of inoculum amount on β-glucosidase activity

如圖5所示，接種量1%時，菌株產(chǎn)酶能力較低，隨著接種量的增加，菌株產(chǎn)酶能力隨之增大，當接種量達到5%時，菌株產(chǎn)酶能力達到最高，此后隨著接種量升高酶活力變化不顯著（P＞0.05），表明該菌種最適接種量為5%。

2.4 響應面試驗結(jié)果分析

表1 培養(yǎng)條件響應面試驗方案設計及結(jié)果Table 1 Response surface design and results for the optimization of culture conditions

培養(yǎng)條件響應面試驗各因素和水平見表1，酶活力最高為1.60 IU/mL。產(chǎn)酶條件響應面回歸方程及顯著性分析見表2。利用Design-Expert軟件對表2的響應曲面法試驗設計結(jié)果的數(shù)據(jù)進行了多元回歸擬合分析，得到回歸方程：

表2 響應面回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗Table 2 Significance test of all coefficients in the regression model

由表2可知，試驗所選用的模型高度顯著（P＜0.000 1），模型的校正決定系數(shù)=0.951 1，說明該模型能解釋95.11%響應值的變化，相關系數(shù)R=0.993 0，說明該模型擬合程度良好，試驗誤差小，該模型是合適的。從回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，模型一次項A、B極顯著（P＜0.01），C顯著（P＜0.05）；二次項AB、AC極顯著（P＜0.01），BC不顯著（P＞0.05），各因素對酶活力的影響程度排序為A＞B＞C。

圖6 培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度間的交互作用對酶活力影響的響應面圖Fig.6 Response surface plots for the effect of time， initial medium pH and temperature on β-glucosidase activity

由圖6a可知，當培養(yǎng)溫度為39 ℃時，隨培養(yǎng)時間的延長，酶活力逐漸增加，當培養(yǎng)時間在38 h左右時酶活力達到最大，之后又慢慢下降。隨著培養(yǎng)基初始pH值的增加，酶活力增大，在培養(yǎng)基初始pH值為8左右時，酶活力為最大，之后又呈下降趨勢。

由圖6b可知，當培養(yǎng)時間為39 h時，隨著培養(yǎng)基初始pH值的增大，酶活力逐漸增大，當培養(yǎng)基初始pH值在8左右時酶活力達到最大，之后又慢慢下降。隨著培養(yǎng)溫度的增加，酶活力增大，在培養(yǎng)溫度為38 ℃左右時，酶活力為最大，之后又呈下降趨勢。

由圖6c可知，當培養(yǎng)基初始pH值為8時，隨培養(yǎng)時間的延長，酶活力逐漸增大，當培養(yǎng)時間在38 h左右時酶活力達到最大，之后又慢慢下降。隨著培養(yǎng)溫度的增加，酶活力增大，在培養(yǎng)溫度為38 ℃左右時，酶活力為最大，之后又呈下降趨勢。

響應面產(chǎn)酶條件優(yōu)化結(jié)果為：培養(yǎng)基初始pH 8.04、培養(yǎng)溫度38.31 ℃、培養(yǎng)時間38.21 h。根據(jù)實際情況校正值為：培養(yǎng)基pH 8.0、培養(yǎng)溫度38 ℃、培養(yǎng)時間38 h，在此條件下測得酶活力為1.7 IU/mL，比未優(yōu)化前酶活力1.60 IU/mL提高了6.2%。

2.5 發(fā)酵培養(yǎng)游離型大豆異黃酮苷元轉(zhuǎn)化率結(jié)果

表3 3 種游離型大豆異黃酮含量Table 3 Contents of three soybean isoflavone aglycons before and after fermentation mg

由表3可知，發(fā)酵后3 種游離型大豆異黃酮含量比發(fā)酵前高，共增加了1.89 mg，根據(jù)公式（3）計算游離型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化率為39.4%。

3 結(jié) 論

素食者糞便分離到的腸道菌LJ-G1和LJ-Q2有產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力，在38 ℃培養(yǎng)36 h時、產(chǎn)酶能力比黑曲霉高。LJ-Q2菌株響應面試驗產(chǎn)酶條件優(yōu)化結(jié)果為：培養(yǎng)基初始pH 8.0、培養(yǎng)溫度38 ℃、培養(yǎng)時間38 h。在此條件下酶活力達到1.70 IU/mL，比未優(yōu)化前酶活力提高了6.2%。此條件應用于發(fā)酵大豆異黃酮其轉(zhuǎn)化率為 39.4%。近幾年對腸道菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶多有研究。Raimondi等[24]研究了雙歧桿菌屬8 個菌種的22 個菌株轉(zhuǎn)化大豆苷的能力，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵7 d內(nèi)，除Bifidobacteria longum MB220和Bifidobacteria longum MB224外，其他菌株都能水解大豆苷，其中Bifidobacteria adolescentis MB116在生長穩(wěn)定期的早期就有最高的酶活力，酶活力達0.92 U/mg。也有研究表明鏈球菌[25]等細菌可轉(zhuǎn)化結(jié)合型大豆異黃酮。LJ-Q2腸道菌與黑曲霉相比雖然產(chǎn)酶活力低，但是達到峰值的時間短于黑曲霉108 h，以進一步轉(zhuǎn)化成雌馬酚，因此，LJ-Q2腸道菌具有很好的應用前景。接下來的工作將探討LJ-Q2腸道菌與其他產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的腸道益生菌進行復合，以提高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力，應用于大豆苷元的制備，這對今后雌馬酚的轉(zhuǎn)化也有著重要的意義。

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Comparison of Two β-Glucosidase-Producing Strains from the Intestinal Tract of Vegetarians and Optimizaiton of Fermentation Conditions for β-Glucosidase Production

LI Xiaomei, MA Huiling
(Key Laboratory of Food Science and Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

The β-glucosidase-producing capacity of strains LJ-G1 and LJ-Q2 isolated from the feces of vegetarians was measured using 4-nitrophenol-β-D-glucoside (pNPG) as substrate and compared with that of Aspergillus niger. The fermentation conditions for β-glucosidase production by the selected strain were optimized using combination of single factor method and response surface methodology. The results showed that both intestinal strains were able to produce β-glucosidase, and LJ-Q2 had higher β-glucosidase-producing capacity than LJ-G1. LJ-G1 and LJ-Q2 had higher β-glucosidase-producing capacity than Aspergillus niger in 64 h of fermentation. The optimal fermentation conditions for β-glucosidase production were determined as follows: culture medium pH, 8.0; temperature, 38 ℃； and time, 38 h. The experimental value of β-glucosidase activity produced under the optimized conditions was 1.70 IU/mL. The fermentation process could convert 39.4% of soybean isoflavones into aglycones.

vegetarians; intestinal bacteria; β-glucosidase; fermentation conditions for β-glucosidase production

10.7506/spkx1002-6630-201607023

TS201.3

A

1002-6630（2016）07-0123-05

李笑梅, 馬慧玲. 兩株素食者腸道菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶考察及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J]. 食品科學, 2016, 37(7): 123-127.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607023. http://www.spkx.net.cn

LI Xiaomei, MA Huiling. Comparison of two β-glucosidase-producing strains from the intestinal tract of vegetarians and optimizaiton of fermentation conditions for β-glucosidase production[J]. Food Science, 2016, 37(7): 123-127. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607023. http://www.spkx.net.cn

2015-06-18

黑龍江省科技廳應用技術(shù)項目（G013B203）；黑龍江省自然科學基金項目（C201201）；黑龍江省高校科技創(chuàng)新團隊建設計劃項目（2010td04）

李笑梅（1960—），女，教授，本科，研究方向為食品科學。E-mail：lixm0451@163.com