王曉丹，班世棟，周鴻翔，胡寶東，邱樹(shù)毅,

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

貴州省遵義地區(qū)3 個(gè)醬香型大曲細(xì)菌群落的比較分析

王曉丹1,2,3，班世棟1,2，周鴻翔1,3，胡寶東1,3，邱樹(shù)毅1,3,*

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

研究醬香型大曲主要產(chǎn)地遵義地區(qū)的細(xì)菌類(lèi)群組成，并利用主成分分析法對(duì)這些細(xì)菌的類(lèi)群和大曲的關(guān)系進(jìn)行評(píng)定。樣品采用454 FLX+平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，樣品中所測(cè)微生物為細(xì)菌，測(cè)序片段為16S rDNA V3～V5區(qū)，所有樣品的優(yōu)質(zhì)序列按97%的相似度進(jìn)行聚類(lèi)，計(jì)算這些細(xì)菌類(lèi)群的相對(duì)含量。用主成分分析法對(duì)細(xì)菌類(lèi)群和大曲樣品進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：從3 個(gè)大曲樣品中共檢測(cè)出6 個(gè)門(mén)49 個(gè)屬細(xì)菌，主要是厚壁菌門(mén)；樣品MT01以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）34.40%、芽孢桿菌屬（Bacillus）31.40%、Scopulibacillus 13.60%為主，占總量的79.40%，樣品ZJ01以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）34.80%、芽孢桿菌屬Bacillus 49.00%為主，占總量的84.80%，樣品ZX01以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）66.10%為主；對(duì)3 個(gè)大曲樣本進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、魏斯氏菌屬（Weissella）是影響樣品MT01與ZJ01距離最近，ZX01相對(duì)距離較遠(yuǎn)的細(xì)菌類(lèi)群。

醬香型大曲；細(xì)菌；高通量測(cè)序；類(lèi)群；主成分分析

高溫制曲工藝是大曲醬香白酒釀制所獨(dú)有的制曲方式。曲料被制成曲塊，其品溫達(dá)到60～65 ℃，先經(jīng)過(guò)40 d的發(fā)酵，再經(jīng)過(guò)6 個(gè)月以上貯藏才能使用。在整個(gè)制曲過(guò)程中形成了復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)，主要有細(xì)菌、霉菌和酵母，其中細(xì)菌的數(shù)量最多，特別是耐高溫細(xì)菌的量最多[1]。目前對(duì)高溫大曲細(xì)菌種類(lèi)和功能的研究包括：翁慶北等[2-3]從茅臺(tái)酒曲中分離出8 株產(chǎn)A2淀粉酶的優(yōu)良菌株，經(jīng)鏡檢和生化鑒定為芽孢桿菌屬，其中1 株能產(chǎn)最適溫度為80 ℃的高溫型淀粉酶；從習(xí)酒酒曲中分離出16 株產(chǎn)A2淀粉酶菌株，經(jīng)常規(guī)法鑒定均為革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌。廖建民等[4]從瀘州幾個(gè)名優(yōu)酒廠的曲中分離出125 株細(xì)菌并依據(jù)形態(tài)學(xué)和生理特征進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌數(shù)量和種類(lèi)均較多，球菌數(shù)量較少。胡桂林等[5]從大曲中分離到1 株細(xì)菌，利用 Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)鑒定為地衣芽孢桿菌。莊名揚(yáng)等[6]從高溫大曲中分離到一株地衣芽孢桿菌醬香B3-1菌，實(shí)驗(yàn)表明，該功能菌能增加游離氨基酸的種類(lèi)和數(shù)量，促進(jìn)美拉德反應(yīng)迅速發(fā)生，利于白酒香味物質(zhì)的形成。因此，大曲中細(xì)菌的類(lèi)群組成對(duì)大曲的品質(zhì)和功能影響至關(guān)重要。但是，自然界能培養(yǎng)的微生物只有1%，絕大部分微生物不可培養(yǎng)，所以用不可培養(yǎng)方法研究微生物能比較客觀地反映環(huán)境中微生物組成。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction- denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）分析福矛高溫大曲貯藏過(guò)程的群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，原核生物多樣性豐富，以芽孢桿菌最多，成品大曲中的微生物主要是耐熱的細(xì)菌、放線菌和少量霉菌[7]，研究酒曲中微生物時(shí)，檢測(cè)到傳統(tǒng)培養(yǎng)方法未發(fā)現(xiàn)的嗜麥芽窄食單胞菌、假單胞菌、Uncultured Propionibacteriaceae bacterium、Uncultured Weissella、Uncultured Cyanobacterium，并檢測(cè)到了工業(yè)釀酒重要的非釀酒酵母[8-9]。說(shuō)明用免培養(yǎng)方法可以檢測(cè)到未發(fā)現(xiàn)的微生物，更加全面地了解大曲中的微生物。

隨著第二代測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，科學(xué)界也開(kāi)始越來(lái)越多地應(yīng)用第二代測(cè)序技術(shù)來(lái)解決生物學(xué)問(wèn)題，能一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定而廣泛被一些專(zhuān)家學(xué)者用于土壤、腸道等微生物菌群豐富樣品的檢測(cè)[10-12]。作為中國(guó)傳統(tǒng)釀造的醬香型白酒大曲，其微生物菌群的豐富度是不言而喻的，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物技術(shù)——高通量測(cè)序技術(shù)，采用免培養(yǎng)的方法來(lái)檢測(cè)大曲中微生物的組成成為更高效、準(zhǔn)確的方法。

主成分分析（principal component analysis，PCA）是將多個(gè)變量通過(guò)線性變換以選出較少個(gè)數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法。其優(yōu)點(diǎn)在于可以把樣本和變量同時(shí)做到一張圖解上，將樣品的大類(lèi)及其屬性在圖上直觀表示。并且能對(duì)樣品直觀的分類(lèi)指示分類(lèi)主要參數(shù)及分類(lèi)的依據(jù)。因此采用主成分分析法能直接展示對(duì)于大曲樣品以及復(fù)雜的微生物類(lèi)群的關(guān)系。如采用主成分分析法確定貢獻(xiàn)率較大的細(xì)菌類(lèi)群[13]。主成分分析法把原來(lái)眾多具有一定相關(guān)的多個(gè)指標(biāo)（比如P 個(gè)指標(biāo)）重新組合成一組新的互相無(wú)關(guān)的綜合指標(biāo)來(lái)代替原來(lái)的指標(biāo)，使復(fù)雜的問(wèn)題簡(jiǎn)單化，便于抓住主要矛盾進(jìn)行分析[14-15]。

本研究對(duì)選取的3 個(gè)醬香型大曲樣本進(jìn)行針對(duì)16S rDNA V3～V5區(qū)高通量測(cè)序，并對(duì)這些細(xì)菌的物種豐度信息利用主成分分析法對(duì)檢測(cè)的菌落組成及其含量和3 個(gè)醬香型大曲樣本分別進(jìn)行分析，對(duì)本實(shí)驗(yàn)大曲樣中的優(yōu)勢(shì)菌群給以確認(rèn)，也對(duì)大曲樣品與細(xì)菌種群的關(guān)系進(jìn)行評(píng)定。這對(duì)今后研究大曲乃至大曲酒中微生物提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

本實(shí)驗(yàn)采集3 組樣品。由于生產(chǎn)用高溫大曲為成品曲貯藏6 個(gè)月的陳曲，傳統(tǒng)的釀酒方法特別強(qiáng)調(diào)用陳曲，陳曲可使制曲過(guò)程中進(jìn)入的大量產(chǎn)酸多的細(xì)菌在比較干燥的條件下死去或失去繁殖能力，釀酒時(shí)酸度降低。同時(shí)，在貯藏過(guò)程中，酶活力下降，在同等條件下，發(fā)酵溫度上升平緩，釀出來(lái)的酒，香味較好[16]。因此采集樣品為貯藏6 個(gè)月的陳曲，生產(chǎn)車(chē)間使用粉碎待用。樣品產(chǎn)地為貴州遵義地區(qū)，尤其是茅臺(tái)鎮(zhèn)域內(nèi)是“世界醬香型白酒主產(chǎn)區(qū)”、“中國(guó)酒都核心區(qū)”，這里生產(chǎn)的貴州茅臺(tái)酒是大曲醬香型白酒的鼻祖，擁有悠久的歷史。

MT01樣品：來(lái)源于貴州茅臺(tái)酒股份有限公司茅臺(tái)酒生產(chǎn)車(chē)間生產(chǎn)用曲，產(chǎn)地位于黔北遵義地區(qū)赤水河畔的茅臺(tái)鎮(zhèn)。地處東經(jīng) 106°22′，北緯27°51′，海拔423 m。

ZJ01樣品：來(lái)源于貴州珍酒釀酒有限公司珍酒釀造車(chē)間生產(chǎn)用曲，前身是始建于1975年的“貴州茅臺(tái)酒易地試驗(yàn)廠”，產(chǎn)地位于貴州省遵義市北郊十字鋪，東經(jīng)106°54′、北緯27°44′海拔933 m。這里地形與茅臺(tái)酒廠所在地十分相似，年平均氣溫、濕度等也比較相近。

ZX01樣品：來(lái)源于貴州中心釀酒集團(tuán)釀造車(chē)間生產(chǎn)用曲。是由茅臺(tái)酒前身“衡昌燒坊”發(fā)展而來(lái)。產(chǎn)地位于黔北遵義地區(qū)赤水河畔的茅臺(tái)鎮(zhèn)，與貴州茅臺(tái)酒股份有限公司直線距離300 m。

采集后的樣品迅速放入無(wú)菌保鮮袋中，－20 ℃保存。

1.2 試劑

DNA提取試劑盒 美國(guó)MP Biomedicals公司；MinElute PCR純化試劑盒 德國(guó)Qiagen公司；羅氏454 FLX+平臺(tái) 美國(guó)羅氏公司。

1.3 方法

大曲總DNA是用DNA提取試劑盒提取，所有過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。所有樣品采用454 FLX+平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，樣品中所測(cè)微生物為細(xì)菌，測(cè)序片段為16SrDNA V3～V5區(qū)，rDNA通用引物序列：正向引物5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′，反向引物5′-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3′[17]。融合引物：正向引物5′-454adapter-mid-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′，反向引物5′-454adapter-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3′。PCR體系為25 μL，包括8.75 μL超純水、5.00 μL 5hQ5 Buffer、5.00 μL 5hGC Enhancer、2.00 μL dNTP（2.5 mmol/L）、2.00 μL DNA（2 ng/μL）、1.00 μL引物F（10 μmol/L）、1.00 μL引物R（10 μmol/L）、0.25 μL Q5 DNA聚合酶，反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27 個(gè)循環(huán)后，72 ℃保持7 min。PCR產(chǎn)物用MinElute PCR純化試劑盒純化，再用1%的瓊脂糖凝膠電泳，所得樣品送上海佩森諾公司用GS-FLX（454 Life Sciences）測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)根據(jù)Index完全匹配統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品中的有效序列的數(shù)量，對(duì)有效序列整理和質(zhì)量控制，修剪、去除低質(zhì)量（堿基模糊大于1、引物堿基含2 個(gè)以上錯(cuò)配、單堿基高度重復(fù)超過(guò)6、非特異性擴(kuò)增、序列長(zhǎng)度在200～1 000 bp外的序列）的序列，最終獲得供精準(zhǔn)分析的優(yōu)質(zhì)序列。依據(jù)序列相似性，用軟件Qiime調(diào)用uclust[18]對(duì)所有樣品的優(yōu)質(zhì)序列按97%的相似度進(jìn)行聚類(lèi)，將序列歸為1 個(gè)操作分類(lèi)單元（operational taxonomic unit，OTU），去除無(wú)法分類(lèi)的OTU，選取每一類(lèi)中最長(zhǎng)的序列作為OTU的代表序列。采用BLAST的方法在Silva數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋。

1.5 PCA分析

通過(guò)PCA可以觀察個(gè)體或群體間的差異。將細(xì)菌豐度數(shù)據(jù)錄入SPSS 19.0軟件，根據(jù)相關(guān)系數(shù)列出相關(guān)矩陣，求出特征根及其相應(yīng)的特征向量，從特征根中選出幾個(gè)較大的特征根及其特征向量，對(duì)累積貢獻(xiàn)率在85%以上的前幾個(gè)成分作為主成分進(jìn)行分析[13,19]，找出主要貢獻(xiàn)的細(xì)菌類(lèi)群。課題組進(jìn)一步利用SPSS 19.0軟件做主成分分析，對(duì)3 個(gè)樣品屬水平上的分類(lèi)及物種豐度進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 個(gè)大曲樣品細(xì)菌物種和群落結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)454 FLX+平臺(tái)測(cè)序技術(shù)檢測(cè)醬香型高溫大曲中微生物細(xì)胞內(nèi)特定遺傳物質(zhì)，原核微生物16S rDNA這些遺傳物質(zhì)都具有一定的進(jìn)化保守性，保守區(qū)序列為所有同類(lèi)微生物所共有，在保守序列之間存在由于進(jìn)化造成的物種之間序列差異的可變區(qū)域，因此通過(guò)這些序列可變區(qū)域的測(cè)定和對(duì)比，研究醬香型高溫大曲中細(xì)菌物種和群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大曲樣品中細(xì)菌的種群及相對(duì)含量Table 1 Bacterial populations and relative contents in Daqu %

由表1可知，利用高通量測(cè)序技術(shù)的16S V3～V5區(qū)測(cè)序技術(shù)，對(duì)3 種大曲的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定和解析。從3 個(gè)大曲樣品檢測(cè)出6 個(gè)門(mén)49 個(gè)屬細(xì)菌，主要厚壁菌門(mén)為主，共有細(xì)菌種群為：高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、Scopulibacillus、Thermoactinomycetaceae_G、Leuconostocaceae_G、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、Planococcaceae_G、乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、Enterococcaceae_G、直絲菌屬（Planifilum）、Streptomycetaceae_G、紅球菌屬（Rhodococcus）、糖多孢菌（Saccharopolyspora）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、Actinopolysporaceae_G、短桿菌屬（Brevibacterium）、Enterobacteriaceae_G、歐文氏菌屬（Erwinia）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、Streptophyta_F_G。其中MT01主要以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）34.40%、芽孢桿菌屬（Bacillus） 31.40%、Scopulibacillus 13.60%為主，占總含量的79.40%，ZJ01主要以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）34.80%、芽孢桿菌屬（Bacillus）49.00%為主，占總含量的84.80%，ZX01以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）66.10%為主，它們的總和占細(xì)菌總量的80%以上。表明它們是大曲細(xì)菌微生物區(qū)系中的核心功能細(xì)菌微生物類(lèi)群，通過(guò)長(zhǎng)期馴化和發(fā)展，逐漸形成了以高溫放線菌為主的特定的細(xì)菌微生物種群結(jié)構(gòu)。

從整體來(lái)看MT01樣品中兩種優(yōu)勢(shì)菌屬高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）與芽孢桿菌屬（Bacillus）約各占總量的1/3，其他細(xì)菌屬約占1/3，微生物相對(duì)豐度分布均勻。ZX01樣品中高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）占總量的2/3，其他細(xì)菌屬占1/3。ZJ01樣品中芽孢桿菌屬（Bacillus）占總量的一半，高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）占1/3。3 個(gè)樣品的細(xì)菌種群分布存在明顯的差異，優(yōu)勢(shì)菌屬的含量差異很大。

在屬的層次下對(duì)3 個(gè)樣品的物種進(jìn)行序列數(shù)統(tǒng)計(jì)并對(duì)屬的物種豐度統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1。從種群類(lèi)別到相對(duì)豐度的對(duì)比分析來(lái)看，MT01樣品的細(xì)菌物種豐富，種類(lèi)繁多，含量均衡。ZJ01樣品中細(xì)菌物種比較豐富，優(yōu)勢(shì)菌屬的含量較MT01樣品有較大差異。ZX01樣品細(xì)菌物種較少，含量差異很大。

從醬香型大曲制作工藝分析，其突出特點(diǎn)是高溫制曲，品溫在60 ℃以上，最高可達(dá)到65 ℃，制曲時(shí)間長(zhǎng)，在曲房發(fā)酵培養(yǎng)40 d左右，并貯藏3 個(gè)月以上。制曲前期原料加水后，曲塊水分、氧氣充足，溫度適宜，此時(shí)細(xì)菌、酵母菌和霉菌均呈現(xiàn)一定程度的增長(zhǎng)，同時(shí)隨著濕度增加，孢子開(kāi)始萌芽[20-22]；升溫期曲塊入房培養(yǎng)2 d左右，品溫升至45 ℃，濕度也有所改變，各類(lèi)微生物已適應(yīng)環(huán)境，細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖開(kāi)始活躍，并且增長(zhǎng)幅度較大，可達(dá)100～1 000 倍[23]；培養(yǎng)5～6 d后，曲塊品溫升至50 ℃以上。高溫環(huán)境影響了微生物的生長(zhǎng)，大部分微生物數(shù)量從第3～4天開(kāi)始下降，而耐高溫芽孢桿菌在該環(huán)境下數(shù)量有所增加[24]，細(xì)菌中耐熱菌株增加，不耐熱菌株減少，細(xì)菌總數(shù)下降。高溫期，在品溫維持55 ℃時(shí)，大多數(shù)微生物不能生長(zhǎng)，各類(lèi)微生物由于耐熱性不同，其下降趨勢(shì)也有所差別，在這個(gè)溫度下的固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，部分芽孢桿菌出現(xiàn)代謝產(chǎn)酸的現(xiàn)象。傳統(tǒng)分析認(rèn)為細(xì)菌群體主要由芽孢桿菌組成，呈緩慢下降的趨勢(shì)，但在高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)高溫放線菌與芽孢桿菌一樣為主要的優(yōu)勢(shì)菌群，甚至在發(fā)酵溫度超過(guò)60 ℃時(shí)，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于芽孢桿菌；降溫期，溫度降至45 ℃之前，微生物總數(shù)依然下降。當(dāng)溫度降到45 ℃以下時(shí)，存活的微生物活性提高，數(shù)量明顯增加。此階段大多數(shù)的芽孢細(xì)菌在此時(shí)形成了芽孢，乳酸菌數(shù)量下降[25]；成熟期，當(dāng)品溫逐漸接近環(huán)境溫度時(shí)，微生物的死亡率與繁殖率基本平衡，數(shù)量趨于穩(wěn)定。當(dāng)曲塊水分降到15%以下時(shí)，各類(lèi)微生物數(shù)量變化越來(lái)越慢，最后基本保持穩(wěn)定。

從地理位置分析來(lái)看黔北赤水河畔的茅臺(tái)鎮(zhèn)地區(qū)生產(chǎn)的醬香大曲的優(yōu)勢(shì)微生物豐度較高，這與歷史上長(zhǎng)期進(jìn)行醬香型白酒生產(chǎn)對(duì)于微生物積累和馴化有關(guān)。但整體看來(lái)，ZJ01與MT01的微生物多樣性更相近，這與ZJ01在母曲、生產(chǎn)工藝等與MT01相同有關(guān)。

通過(guò)高通量測(cè)序?qū)?xì)菌多樣性的分析，結(jié)合制曲工藝特點(diǎn)，不難分析出制曲各個(gè)階段的控制對(duì)微生物菌群的影響；并且還可以通過(guò)特定的培養(yǎng)方法（如高溫放線菌的培養(yǎng)方法、乳桿菌的培養(yǎng)方法），分離篩選除芽孢桿菌之外的優(yōu)勢(shì)菌，分析其功能性，為解釋傳統(tǒng)高溫大曲的發(fā)酵機(jī)理和微生物的代謝提供科學(xué)依據(jù)。

2.2 3 個(gè)大曲樣品種群主成分分析

表2 主成分的特征值及其貢獻(xiàn)率Table 2 Eigenvalues and contribution rates of principal components

利用軟件SPSS 19.0對(duì)3個(gè)大曲樣品的49 個(gè)屬的細(xì)菌進(jìn)行主成分分析，得到主成分的特征值和貢獻(xiàn)率，如表2所示。主成分確定一般根據(jù)因子的累計(jì)貢獻(xiàn)率、特征值的大小以及碎石圖拐點(diǎn)的變化趨勢(shì)等因素來(lái)確定[15]。根據(jù)表2，前2 個(gè)主成分特征值分別為32.55、16.51，方差貢獻(xiàn)率分別為66.43%、33.57%，其累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到100%，根據(jù)主成分分析一般提取主成分包含85%以上信息原理，前2 個(gè)主成分包含了49 個(gè)屬的絕大部分信息；根據(jù)圖1，前2 個(gè)主成分折線趨勢(shì)很陡，在第3個(gè)主成分開(kāi)始折線開(kāi)始變的平緩；由此可以確定取前2 個(gè)主成分說(shuō)明49 個(gè)屬物種相對(duì)含量的變化趨勢(shì)，根據(jù)貢獻(xiàn)率的大小，依次定為第1、2主成分。

表3 主成分載荷矩陣Table 3 Factor load matrix of principal components

由表3可知，第1主成分反映的指標(biāo)主要有Thermoactinomyces、Bacillus、Leuconostocaceae_G、Bacillaceae_G、Lactobacillales_F_G、Planococcaceae_G、Lactobacillus、Leuconostoc、Lactococcus、Enterococcaceae_G、Weissella、Sporanaerobacter、 Planifilum、Lactobacillaceae_G、Streptomycetaceae_G、Corynebacterium、Rhodococcus、Saccharopolyspora、Actinopolysporaceae_G、Brevibacterium、Micrococcaceae_G、Sciscionella、Enterobacteriaceae_G、Caulobacteraceae_G、Acinetobacter、Aeromonadaceae_G、Acetobacter、Streptophyta_F_G、Leptotrichiaceae_G，主要指向厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、梭桿菌門(mén)；第2主成分反映的指標(biāo)主要有Scopulibacillus、Thermoactinomycetacea_G、Sporolactobacillus、Bacillus、Virgibacillus、Bacillales_F_G、Nocardiopsaceae_G、Thiococcus、Rhodospirillales_F_G、Pseudomonadaceae_G、Sphingobacteriales_F_G，主要指向厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)。因此可以初步判斷以上細(xì)菌屬為大曲的主要細(xì)菌類(lèi)群，主要指向厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)。

圖1 主成分分析碎石圖Fig.1 Scree plot of principal components

通過(guò)圖1主成分分析方法對(duì)3 種大曲的物種和群落結(jié)構(gòu)關(guān)系的解析，綜合圖2、3可知，3 個(gè)樣品的位置都在第一象限，距離相差不大。影響3 個(gè)樣品的細(xì)菌種群主要集中在第一象限，離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的位置，按影響力大小依次為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、Thermoactinomycetaceae_G、棒狀桿菌屬Corynebacterium、魏斯氏菌屬（Weissella）、Leuconostocaceae_G、乳球菌屬（Lactococcus）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、Caulobacteraceae，為影響醬香大曲種群結(jié)構(gòu)的主要細(xì)菌種群。發(fā)現(xiàn)棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、魏斯氏菌屬（Weissella）是影響樣品MT01與ZJ01距離最近，ZX01相對(duì)距離較遠(yuǎn)的細(xì)菌類(lèi)群。

圖2 3 個(gè)大曲樣品的主成分散點(diǎn)圖Fig.2 Scattering plot of principal components for three Daqu

圖3 49 個(gè)屬的主成分散點(diǎn)圖Fig.3 Scattering plot of principal components for 49 genera

采用主成分分析的方法不僅能夠客觀地分析出大曲的主要類(lèi)群，而且通過(guò)圖2、3可以直觀詳細(xì)地看出影響各個(gè)樣品差距的微生物類(lèi)群及類(lèi)群的影響力。這進(jìn)一步說(shuō)明了MT01大曲在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的生產(chǎn)過(guò)程中，微生物充分馴化，成為最適應(yīng)醬香型白酒釀造的微生物生態(tài)系統(tǒng)，各類(lèi)群達(dá)到一定的平衡，其種群、組成結(jié)構(gòu)決定了最終醬香型白酒形成的風(fēng)格。

ZX01的產(chǎn)地與生產(chǎn)工藝與MT01相同，同屬于茅臺(tái)鎮(zhèn)赤水河谷，ZX01的大曲生產(chǎn)是采用醬香型高溫大曲制作工藝，由于地理位置與MT01生產(chǎn)車(chē)間的位置相差不多，其在生產(chǎn)環(huán)境、氣候、用水與MT01高溫大曲生產(chǎn)非常相似，但是大曲樣品中的微生物多樣性仍存在較大差異。

ZJ01的生產(chǎn)是沿襲了正宗的MT01工藝，酒廠前身是始建于1975年的“貴州茅臺(tái)酒易地試驗(yàn)廠”，建廠初期使用了MT01大曲曲房的建筑材料、生產(chǎn)原、輔料，母曲，生產(chǎn)工具等。雖然ZJ01的生產(chǎn)地理位置不在赤水河附近，也有不同的氣候條件，但亦可生產(chǎn)與MT01微生物多樣性相近的大曲。

綜上所述，在不同地理位置、不同氣候條件時(shí)，可以采用人工馴化生產(chǎn)環(huán)境，強(qiáng)化培養(yǎng)，選擇生產(chǎn)原、輔料等辦法，使用MT01大曲作為母曲，增加優(yōu)勢(shì)菌數(shù)量，可以使一般醬香型大曲微生物種群類(lèi)別及數(shù)量上盡量接近MT01大曲的微生物豐富度和均勻度。

3 結(jié) 論

采用454 FLX+平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，樣品中所測(cè)微生物為細(xì)菌，測(cè)序片段為16S V3～V5區(qū)，檢測(cè)3 個(gè)大曲中的細(xì)菌類(lèi)群組成，共檢測(cè)出細(xì)菌屬49 種，包含厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)、梭桿菌門(mén)。同時(shí)所有樣品的優(yōu)質(zhì)序列按97%的相似度進(jìn)行聚類(lèi)，計(jì)算這些細(xì)菌類(lèi)群的相對(duì)含量，利用OTU分析，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門(mén)含量比較高，高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、芽孢桿菌屬（Bacillus）占總含量的60%以上。

對(duì)檢測(cè)出的49 種細(xì)菌屬進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)葡萄球菌屬（Staphylococcus）、Thermoactinomycetaceae_G、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、魏斯氏菌屬（Weissella）、Leuconostocaceae_G、乳球菌屬（Lactococcus）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、Caulobacteraceae_G，為影響醬香大曲的主要細(xì)菌種群。

對(duì)3 個(gè)大曲樣本進(jìn)行主成分分析，MT01以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）34.40%、芽孢桿菌屬（Bacillus）31.40%、Scopulibacillus 13.60%為主，占總含量的79.40%，ZJ01以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）34.80%、芽孢桿菌屬Bacillus 49.00%為主，占總含量的84.80%，ZX01以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）66.10%為主；主成分分析發(fā)現(xiàn)棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、魏斯氏菌屬（Weissella）是影響3 個(gè)樣品的細(xì)菌類(lèi)群。

本研究對(duì)3 個(gè)大曲樣本的細(xì)菌類(lèi)群結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定分析，對(duì)大曲中的細(xì)菌類(lèi)群有一定的認(rèn)識(shí)，同時(shí)利用主成分分析法對(duì)大曲細(xì)菌類(lèi)群對(duì)大曲微生物多樣性的影響進(jìn)行了分析，為今后利用大曲微生物區(qū)系評(píng)價(jià)大曲質(zhì)量也提供了一種新的方法。但對(duì)于大曲中微生物數(shù)據(jù)庫(kù)的完善還需進(jìn)一步摸索研究。

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Comparative Analysis of Bacterial Populations of Three Maotai-Flavored Daqus in Zunyi, Guizhou

WANG Xiaodan1,2,3, BAN Shidong1,2, ZHOU Hongxiang1,3, HU Baodong1,3, QIU Shuyi1,3,*
(1. Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. College of Life Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 3. School of Liquor-Making and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

Bacterial populations of three samples of Maotai-flavored Daqu in Zunyi， Guizhou province were studied. Principal component analysis was used to evaluate the relationship between bacterial population and Daqu. The 454 FLX+ platform was used to sequence the 16S rDNA gene V3-V5 region of the bacteria. The high quality sequences were clustered by similarity （0.97）， and used to calculate the relative content of bacteria. Through principal component analysis， we analyzed the bacterial population of Daqu. Results showed that 6 phyla and 49 genera were detected from three samples，and the Firmicutes were the most dominant phylum. Thermoactinomyce (34.40%), Bacillus (31.40%） and Scopulibacillus (13.60%） were dominant in Daqu MT01， accounting for 79.40% of the total bacterial population. Thermoactinomyce (34.80%) and Bacillus (49.00%） were dominant in Daqu ZJ01， accounting for 84.80%. Only Thermoactinomyce (66.10%） was dominant in Daqu ZX01. Principal component analysis （PCA） suggested that MT01 and ZJ01 were the nearest in distance，and ZX01 was a little far. This study can provide a theoretical basis for the judgment of Daqu quality.

Maotai-flavored Daqu； bacteria； high-throughput sequence； population； principal component analysis

10.7506/spkx1002-6630-201607021

Q938.15

A

1002-6630（2016）07-0110-07

王曉丹, 班世棟, 周鴻翔, 等. 貴州省遵義地區(qū)3 個(gè)醬香型大曲細(xì)菌群落的比較分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(7): 110-116. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607021. http://www.spkx.net.cn

WANG Xiaodan, BAN Shidong, ZHOU Hongxiang, et al. Comparative analysis of bacterial populations of three Maotaiflavored Daqus in Zunyi， Guizhou［J］. Food Science， 2016， 37（7）： 110-116. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201607021. http://www.spkx.net.cn

2015-11-05

科技部科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAC06B12）；貴州省科技廳工業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合GZ字[2014]3012）；貴州省科技廳重大專(zhuān)項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合重大專(zhuān)項(xiàng)字[2013]6009號(hào)）；貴州省省校合作計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合LH字[ 2014]7672）

王曉丹（1980—），女，實(shí)驗(yàn)師，博士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用生物技術(shù)。E-mail：wangxiaodan0516@126.com

*通信作者：邱樹(shù)毅（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：syqiu@gzu.edu.cn