王 穎，何 禾，胡發(fā)根，齊 斌，王立梅，朱益波,

（1.常熟理工學(xué)院 蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常熟 215500；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

響應(yīng)面法優(yōu)化重組大腸桿菌全細(xì)胞合成D-苯基乳酸

王 穎1,2，何 禾1，胡發(fā)根1，齊 斌1，王立梅1，朱益波1,*

（1.常熟理工學(xué)院 蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常熟 215500；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

研究利用重組大腸桿菌Escherichia coli BL21（DE3）/pET-28a-ldhD全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化苯丙酮酸（phenylpyruvic acid，PPA）合成D-苯基乳酸（D-phenyllactic acid，D-PLA）的條件。通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從影響細(xì)胞轉(zhuǎn)化的6 種因素中篩選得出轉(zhuǎn)化溫度、底物濃度和磷酸鈉緩沖液pH值對底物PPA摩爾轉(zhuǎn)化率有顯著影響；采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面優(yōu)化，對該重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成D-PLA的條件進(jìn)行了優(yōu)化。最佳分批轉(zhuǎn)化條件：轉(zhuǎn)化溫度為38 ℃、底物濃度為42 mmol/L、磷酸鈉緩沖液pH 7.0、菌體質(zhì)量濃度20 g/L、葡萄糖質(zhì)量濃度20 g/L。在該條件下反應(yīng)0.5 h，底物摩爾轉(zhuǎn)化率為65.32%。根據(jù)此最佳轉(zhuǎn)化條件，經(jīng)4 h的間歇補(bǔ)加底物轉(zhuǎn)化獲得D-PLA最終濃度為119 mmol/L（19.75 g/L），生產(chǎn)率為4.94 g/（Lgh）。

D-苯基乳酸；苯丙酮酸；重組大腸桿菌；生物轉(zhuǎn)化；響應(yīng)面優(yōu)化

苯基乳酸（phenyllactic acid，PLA），即2-羥基-3-苯基丙酸，是一種小分子的天然防腐劑，存在于蜂蜜和乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)物中[1-3]。近年來，PLA作為一種新穎的天然抑菌物質(zhì)，引起食品行業(yè)普遍關(guān)注[4]。PLA具有兩種手性對映異構(gòu)體[5]，D-PLA和L-PLA，可以作為手性中間體廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥和生物合成等領(lǐng)域[6]。大量研究表明，PLA具有廣譜而高效的抗菌活力，對引起食物腐敗的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌等多種微生物具有抑制作用[7-10]。PLA作為乳酸菌苯丙氨酸的代謝產(chǎn)物，對人體和動(dòng)物細(xì)胞均無毒性[11-12]。此外，PLA具有水溶性和熱穩(wěn)定性好、有效pH值范圍寬、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，有利于其未來在食品工業(yè)中的普遍應(yīng)用[13]。

目前，PLA的制備方法有化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和酶催化法。化學(xué)合成法雖然具有較高的生產(chǎn)效率，但存在合成過程復(fù)雜、大量使用有機(jī)溶劑、產(chǎn)物為內(nèi)消旋混合物等缺點(diǎn)[14]。酶催化法存在酶分離純化過程繁瑣、酶穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)化過程中需要添加昂貴的輔因子等問題，尚不能大規(guī)模應(yīng)用。利用微生物法合成PLA具有條件溫和、底物轉(zhuǎn)化率高和產(chǎn)物光學(xué)純度高等優(yōu)點(diǎn)，受到了相關(guān)研究者的重視。

已報(bào)道多種微生物具有催化苯丙酮酸（phenylpyruvic acid，PPA）合成PLA的能力，主要有真菌（Geotrichum candidum ATCC 204307[15]）、乳酸菌（Lactobacillus[16-19]、Enterococcus faecalis TH10[20]、Weissella cibaria FMF4B16[21]、Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ITMY30[22]）、丙酸菌（Propionibacterium jensenii DSMZ 20535、P. acidipropionici DSMZ 4900）[23]等。其中，乳酸脫氫酶是微生物合成PLA的一種關(guān)鍵酶，但由于微生物細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，限制苯基乳酸合成[24]。因此，利用基因工程手段獲得高效過表達(dá)乳酸脫氫酶的重組菌是提高苯基乳酸產(chǎn)量的有效途徑。

在前期工作中，本實(shí)驗(yàn)室從Lactobacillus pentosus中克隆得到了D-乳酸脫氫酶（D-lactate dehydrogenase，D-ldh）的編碼基因，并利用原核表達(dá)載體pET-28a（+）構(gòu)建一株能夠高效表達(dá)D-ldh的基因工程菌E. coli BL21（DE3）/pET-28a-ldhD[24]。此重組菌具有較高的還原PPA生產(chǎn)PLA能力，但是對于底物的轉(zhuǎn)化率還需要進(jìn)一步提高。

采用高效表達(dá)D-乳酸脫氫酶的微生物全細(xì)胞合成D-PLA，可避免酶的分離純化，保證酶的活性，無需添加輔因子，簡化后處理工序，縮短生產(chǎn)周期，保證產(chǎn)物光學(xué)純度。本研究擬在Plackett-Burman試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對重組大腸桿菌E. coli BL21（DE3）/ pET-28a-ldhD全細(xì)胞合成D-PLA的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為進(jìn)一步提高微生物合成PLA的生產(chǎn)率和底物轉(zhuǎn)化率提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

D-苯基乳酸和一水苯丙酮酸鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

酵母提取物和胰蛋白胨 英國Oxoid公司；卡那霉素 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 菌株和培養(yǎng)基

重組大腸桿菌Escherichia coli BL21（DE3）/pET-28a-ldhD[24]為蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L。根據(jù)需要，在培養(yǎng)基中添加50 μg/mL的卡那霉素。

基礎(chǔ)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系為含全細(xì)胞重組大腸桿菌20 g/L、葡萄糖20 g/L、苯丙酮酸鈉40 mmol/L和體積分?jǐn)?shù)1%吐溫-80的磷酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）。

1.3 儀器與設(shè)備

CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；SC100水浴控制器 德國Thermo公司；CTO-20AC高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本島津公司；HZQ-F280恒溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市華美生化儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 重組大腸桿菌培養(yǎng)及D-PLA合成

菌體活化：從固體培養(yǎng)基上挑取E. coli BL21（DE3）/pET-28a-ldhD單菌落接種至裝有10 mL新鮮LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）的100 mL三角瓶中培養(yǎng)，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。

重組菌誘導(dǎo)及D-PLA合成[24]：將活化好的重組菌E. coli BL21（DE3）/pET-28a-ldhD按1%的接種量接種至裝有100 mL新鮮LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）的500 mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、37 ℃培養(yǎng)至OD600nm值為1.2，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）至0.2 mmol/L，25 ℃誘導(dǎo)4 h后，4 ℃、6 000 r/min離心10 min收集菌體。菌體用pH值為7.0的磷酸鈉緩沖液洗滌2 次，重懸于10 mL磷酸鈉緩沖液中，反應(yīng)0.5 h后取樣用高效液相色譜檢測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物D-PLA和底物PPA。

1.4.2 轉(zhuǎn)化液樣品制備

取500 μL轉(zhuǎn)化液于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液100 μL，與流動(dòng)相按1∶9的體積比混合均勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后用HPLC法檢測。轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中的菌體濃度以O(shè)D600nm值表示。

1.4.3 高效液相色譜條件

色譜柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H；流動(dòng)相為5.0 mmol/L稀硫酸；流速0.6 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積5.0 μL，檢測波長210 nm。

1.4.4 Plackett-Burman試驗(yàn)優(yōu)化

前期工作中，對此重組大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行了初步研究，得到最佳誘導(dǎo)條件[25]：將過夜培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液按1%的體積比接種至含100 mL新鮮LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min，培養(yǎng)至OD600nm值為1.2時(shí)添加IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，25 ℃誘導(dǎo)4 h后收集菌體。此外，還對全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件的各影響因素進(jìn)行了單因素試驗(yàn)[25]，結(jié)果表明：磷酸鈉緩沖液pH 7.0、轉(zhuǎn)化溫度為37 ℃，底物濃度為40 mmol/L，菌體質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，D-PLA產(chǎn)量較高[25]。

為進(jìn)一步優(yōu)化全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件，利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇菌體質(zhì)量濃度（X1）、轉(zhuǎn)化溫度（X2）、轉(zhuǎn)化時(shí)間（X4）、葡萄糖質(zhì)量濃度（X5）、底物濃度（X7）和緩沖液pH值（X8）6 個(gè)因素，并設(shè)置X3和X6兩個(gè)空白作為誤差分析項(xiàng)。每個(gè)因素分別選取低（－1）和高（1）兩個(gè)水平，共12 個(gè)試驗(yàn)組合，以全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)中PPA摩爾轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值。

1.4.5 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了確定影響重組大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成D-PLA的各參數(shù)的水平以及不同參數(shù)之間的交互作用，將PPA有效地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，因此，在相同誘導(dǎo)條件[24]下，并且給定轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間為0.5 h、搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min、菌體質(zhì)量濃度為20 g/L和葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L，本試驗(yàn)采用三因素三水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以磷酸鈉緩沖液pH值、轉(zhuǎn)化溫度和底物濃度為自變量，通過Design-Expert軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測全細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程的最佳反應(yīng)條件。

1.4.6 PPA分批補(bǔ)料合成D-PLA

將過夜培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液按1%的體積比接種至含100 mL新鮮LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min，培養(yǎng)至OD600nm值為1.2時(shí)添加IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，25 ℃誘導(dǎo)4 h后收集菌體。將適量菌體懸浮于含1%吐溫-80和20 g/L葡萄糖的50 mL磷酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0），在250 mL三角瓶中37 ℃、200 r/min進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。分別在0、0.5、1、1.5、2、3 h補(bǔ)加2 mol/L苯丙酮酸鈉母液1、1、0.75、0.75、0.5、0.5 mL。每次補(bǔ)料前后各取200 μL菌液經(jīng)10 000 r/min、4 ℃離心2 min，上清進(jìn)行PPA和D-PLA的濃度檢測，菌泥沉淀進(jìn)行OD600nm值檢測。

1.4.7 PPA摩爾轉(zhuǎn)化率計(jì)算

PPA摩爾轉(zhuǎn)化率按如下公式計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表1。每個(gè)處理重復(fù)3 次，取平均值為試驗(yàn)結(jié)果。采用Design-Expert 8.0.6軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，比較各因素的F值和可信度，選擇可信度＞95%的因素作為顯著影響因素，采用Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

影響全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成D-PLA的因素有菌體濃度、轉(zhuǎn)化溫度、轉(zhuǎn)化時(shí)間、葡萄糖質(zhì)量濃度、底物濃度，確定各影響因素水平，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并對Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。可知，轉(zhuǎn)化溫度、底物濃度和緩沖液pH值對PPA摩爾轉(zhuǎn)化率有顯著影響，采用響應(yīng)面分析法中Box-Behnken設(shè)計(jì)法建立多元二次模型方程，對其關(guān)鍵因子進(jìn)一步研究。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Plackett-Burman design and experimental response obtained for PPA conversion efficiency

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析Table 2 Analysis of variance （ANOVA） of Plackett-Burman design

2.2 重組大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成D-PLA的多元二次模型方程的建立

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表3，列出了Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果，其中第13～17次試驗(yàn)為5 次重復(fù)的中心點(diǎn)試驗(yàn)，用于考察模型的誤差。以PPA摩爾轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)指標(biāo)，利用Design-Expert 8.0.6軟件對表3進(jìn)行二次多元回歸擬合，結(jié)果見表4。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-Behnken design and experimental response obtained for PPA conversion efficiency

表4 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance （ANOVA） of regression equation

經(jīng)二次多項(xiàng)回歸擬合后，得到以全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)中PPA摩爾轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值（Y）的回歸方程預(yù)測模型為：Y=64.28+1.98A+2.17B－4.40C+0.41AB－0.23AC－0.95BC－10.62A2－10.78B2－7.00C2。

表4方差分析表明，對摩爾轉(zhuǎn)化率所建立的回歸模型達(dá)到顯著水平（P＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.345 0），回歸方程可用。各因素對摩爾轉(zhuǎn)化率影響大小順序：底物濃度＞轉(zhuǎn)化溫度＞緩沖液pH值。一次項(xiàng)C極顯著，二次項(xiàng)A2、B2、C2極顯著?；貧w方程決定系數(shù)R2=0.976 1，說明該回歸方程擬合程度高，能準(zhǔn)確地反映各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以用于分析和預(yù)測最佳全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件。

圖1 轉(zhuǎn)化溫度、底物PPA濃度和緩沖液pH值對摩爾轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.1 Response surface plots for the effects of temperature， PPA concentration and phosphate buffer pH on PPA conversion efficiency

結(jié)合圖1和Design-Expert 8.0.6軟件分析得到的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)最佳條件是磷酸鈉緩沖液pH7.05、轉(zhuǎn)化溫度37.59 ℃、底物濃度41.77 mmol/L，此時(shí)PPA摩爾轉(zhuǎn)化率為65.21%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，對預(yù)測反應(yīng)條件進(jìn)行如下修正：磷酸鈉緩沖液pH值為7.0、轉(zhuǎn)化溫度為38 ℃、底物濃度為42 mmol/L。

在以上優(yōu)化條件下進(jìn)行了4 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值為65.32%，預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值的相對偏差為0.17%。說明采用響應(yīng)面優(yōu)化全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件是可行的，為進(jìn)一步提高底物利用效率提供了依據(jù)。

2.3 底物分批補(bǔ)料強(qiáng)化D-PLA合成

通過響應(yīng)面試驗(yàn)獲得最適轉(zhuǎn)化條件，在此條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行底物分批補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)（圖2）。經(jīng)4 h轉(zhuǎn)化，D-PLA最終濃度為119 mmol/L，生產(chǎn)率達(dá)到4.94 g/（Lgh），平均摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)62.96%。相比Bacillus coagulans SDM[25]全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成PLA（轉(zhuǎn)化時(shí)間20 h，轉(zhuǎn)化率70%，產(chǎn)量37.3 g/L），此重組大腸桿菌在合成D-PLA的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率上有所不足，但是在生產(chǎn)率上有顯著提高。

圖2 底物分批補(bǔ)料轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-PLA的時(shí)間曲線Fig.2 Time course of D-PLA production in fed-batch fermentation with intermittent PPA feeding

3 結(jié) 論

本研究通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出影響重組大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化PPA合成D-PLA的關(guān)鍵因素，以二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型的響應(yīng)面法優(yōu)化獲得分批最佳反應(yīng)條件為：磷酸鈉緩沖液pH 7.0、轉(zhuǎn)化溫度38 ℃、底物濃度42 mmol/L，菌體質(zhì)量濃度20 g/L、葡萄糖質(zhì)量濃度20 g/L。在該條件下反應(yīng)0.5 h，底物的分批摩爾轉(zhuǎn)化率為65.32%，較優(yōu)化前提高了約9%。底物分批補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)獲得D-PLA最終濃度為119 mmol/L，即19.75 g/L，生產(chǎn)率達(dá)4.94 g/（Lgh），平均摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)62.96%，較優(yōu)化前D-PLA產(chǎn)量提高了2.5 g/L，底物的平均摩爾轉(zhuǎn)化率提高了接近9%。底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物生產(chǎn)率較優(yōu)化前均有顯著提高，為進(jìn)一步提高D-PLA產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

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Optimization of D-Phenyllactic Acid Production by Whole Cells of Recombinant Escherichia coli Using Response Surface Methodology

WANG Ying1,2, HE He1, HU Fagen1, QI Bin1, WANG Limei1, ZHU Yibo1,*
(1. Key Laboratory of Food and Biotechnology of Suzhou, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China; 2. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

The bioconversion conditions for the production of D-3-phenyllactic acid from phenylpyruvic acid (PPA) using whole cells of Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhD were studied. Using Plackett-Burman design, buffer pH, substrate concentration and temperature were selected as the factors with significant influence on substrate conversion efficiency out of 6 factors. Subsequently, the optimization of the three factors was carried out using Box-Behnken design and response surface analysis. Results indicated that the optimal bioconversion conditions that provided the maximum molar conversion efficiency of PPA （65.32%) during 30 min were buffer pH 7.0, substrate concentration 42 mmol/L, and temperature 38 ℃, cell concentration 20 g/L and glucose concentration 20 g/L. Under these conditions, 119 mmol/L (19.75 g/L) of D-PLA with a productivity of 4.94 g/(L·h) was obtained after 4 h transformation with intermittent PPA feeding.

D-phenyllactic acid; phenylpyruvic acid; recombinant Escherichia coli; biotransformation; response surface optimization

10.7506/spkx1002-6630-201607017

TS201.2

A

1002-6630（2016）07-0088-05

王穎, 何禾, 胡發(fā)根, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化重組大腸桿菌全細(xì)胞合成D-苯基乳酸[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(7): 88-92.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607017. http://www.spkx.net.cn

WANG Ying, HE He, HU Fagen, et al. Optimization of D-phenyllactic acid production by whole cells of recombinant Escherichia coli using response surface methodology[J]. Food Science, 2016, 37(7): 88-92. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607017. http://www.spkx.net.cn

2015-04-30

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31470092）；江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（BK20130380）；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（13KJB550002）；江蘇省“六大高峰人才”資助計(jì)劃項(xiàng)目（NY-021）；蘇州市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（SNG201354）；常熟市科技計(jì)劃項(xiàng)目（CN201412）；科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2013GB2C100176）

王穎（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。E-mail：278478330@qq.com

*通信作者：朱益波（1980—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：centuryrain@126.com