孟春英，王茂劍，張 健,，王共明，劉 昕，井月欣，王 婷

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 200000；2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東 煙臺 264006；3.山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺 264006）

MENG Chunying1,2, WANG Maojian2,3, ZHANG Jian2,3,*, WANG Gongming2, LIU Xin2, JING Yuexin2, WANG Ting1,2(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 200000, China; 2. Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China; 3. Shandong Provincial Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology, Yantai 264006, China)

仿刺參體壁中抗菌肽的分離及抑菌活性

孟春英1,2，王茂劍2,3，張 健2,3,*，王共明2，劉 昕2，井月欣2，王 婷1,2

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 200000；2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東 煙臺 264006；3.山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺 264006）

從仿刺參體壁中分離純化出抗菌肽并研究其抑菌活性。以鮮活仿刺參體壁為原料，采用5%乙酸浸提法進(jìn)行粗提，以抑菌活性為指標(biāo)進(jìn)行分離。經(jīng)超濾系統(tǒng)超濾，大孔吸附樹脂柱層析分離純化，采用酶標(biāo)儀比濁法檢測各組分對大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、腸炎沙門氏菌（Salmonella eternitidis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的抑菌活性。采用Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，Tricine-SDS-PAGE）檢測抗菌肽分子質(zhì)量。結(jié)果表明：通過超濾分離，分別得到分子質(zhì)量＜1、1～5 kD和5～10 kD組分，其中分子質(zhì)量＜1 kD組分的抑菌活性最高，選用該組分繼續(xù)進(jìn)行大孔吸附樹脂柱層析分離，得抑菌活性最高的組分，其Tricine-SDS-PAGE結(jié)果表現(xiàn)為單一條帶，分子質(zhì)量約為4.35 kD。

仿刺參體壁；抗菌肽；分離純化；抑菌活性；酶標(biāo)儀比濁法

抗菌肽是指具有抵御外界微生物侵害、清除體內(nèi)突變細(xì)胞能力的一類小分子肽，廣泛存在于生物體內(nèi)，抑菌活性高，對部分病毒也有抑制作用，對真核細(xì)胞幾乎無影響[1-2]。天然抗菌肽通常是由小于50 個(gè)氨基酸殘基組成的堿性小分子肽，水溶性好，大多具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性[3]。從20世紀(jì)80年代在天蠶中首次分離出抗菌肽以來，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)800余種抗菌肽[3]。目前，所發(fā)現(xiàn)的海洋生物抗菌肽主要來源于魚類和海洋無脊椎動物，其中海洋無脊椎動物包括刺胞動物、環(huán)節(jié)動物、軟體動物、甲殼動物、棘皮動物、原索動物[4]。Beauregard等[5]從大西洋海參（Cucumaria frondosa）中分離得到一種分子質(zhì)量約為6 kD的抗菌肽。

仿刺參蛋白含量高，糖類豐富，不含膽固醇，具有極高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值，是我國北方近海養(yǎng)殖中非常重要的經(jīng)濟(jì)品種之一。研究表明海參體壁真皮結(jié)締組織、體腔、內(nèi)腺管及內(nèi)臟中均含有生物活性物質(zhì)，并具有藥理活性，如抗凝血、抗腫瘤、抗血栓、降血脂，降血黏度，免疫調(diào)節(jié)及促進(jìn)細(xì)胞生長等作用[6-7]。近年來，由于種質(zhì)的退化和養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，仿刺參養(yǎng)殖病害問題不斷發(fā)生[8]。目前流行病學(xué)研究報(bào)告，仿刺參的主要病害是以細(xì)菌性疾病為主，并且傳播范圍廣、危害性大[9]，其中口圍腫脹癥、腐皮綜合征均是仿刺參養(yǎng)殖中較常見的疾病，致死率達(dá)30%以上[8,10-12]。由于仿刺參生活在含菌較多的底質(zhì)中，其機(jī)體內(nèi)具有很強(qiáng)的抗感染能力[12]。有關(guān)仿刺參體內(nèi)抗菌活性物質(zhì)的研究報(bào)道目前較少[13]。以仿刺參體壁為原材料，研究仿刺參體壁抗菌肽的分離純化方法及抗菌特性，了解仿刺參的先天免疫系統(tǒng)作用機(jī)制，是通過免疫方法合理預(yù)防和治療仿刺參細(xì)菌病害的基礎(chǔ)。將為仿刺參體內(nèi)抗菌活性物質(zhì)、生物學(xué)特性的深入研究積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

仿刺參（Apostichopus japonicas），健康無傷，體質(zhì)量80～100 g，購買自煙臺山水海產(chǎn)有限公司。

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 25922、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）ATCC 13076、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ATCC 11774均由農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心（煙臺）提供。

大孔吸附樹脂DA201-C 鄭州勤實(shí)科技有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA） 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；營養(yǎng)肉湯 青島高科因博海生物技術(shù)有限公司；冰乙酸、乙醇均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M臺式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀儀器有限公司；Pall Minimate切向流超濾系統(tǒng)及膜包 美國PALL公司；電子天平 美國Ohaus公司；TU-1810SPC紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；T18高速分散器、RV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA公司；生化培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；微孔板分光光度計(jì) 美國MARK公司；JMF-365膠體磨 上?？苿跈C(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 仿刺參體壁抗菌肽的分離

1.3.1.1 材料預(yù)處理

鮮活仿刺參用過濾海水沖洗后，去腸道，稱質(zhì)量，剪碎，用膠體磨磨碎，再用高速組織搗碎機(jī)搗碎3 次，每次3 min，備用。

1.3.1.2 提取方法

采用乙酸浸提法[14]，將搗碎后的仿刺參體壁組織按體積比1∶1加入5%的乙酸，用高速分散器混勻，置于4 ℃冰箱浸提24 h。然后將混合物放入高速冷凍離心機(jī)，4 ℃、8 000 r/min條件下離心20 min，取上清液，4 ℃保存。沉淀物按體積比1∶1加入5%的乙酸，再次4 ℃浸提24 h，重復(fù)上述離心過程，取上清液。合并2 次上清液，過0.45 μm濾膜除去雜質(zhì)，減壓旋蒸后真空冷凍干燥，得粗提物。

1.3.2 仿刺參體壁抗菌肽的純化

1.3.2.1 超濾工藝分離粗提物[15-17]

將冷凍干燥后的粗提物用蒸餾水復(fù)溶后，分別過0.45、0.22 μm的微孔濾膜除雜質(zhì)除菌后，用Pall Minimate超濾系統(tǒng)進(jìn)行超濾。依次選用截留分子質(zhì)量為10、5、1 kD的切向流膜包，壓力12 Pa的條件下開始超濾，當(dāng)超濾杯中液體的體積剩余1/5時(shí)，停止超濾，收集濾過液，超濾杯中用蒸餾水補(bǔ)充至原體積，再次超濾。重復(fù)5 次。收集每次的濾過液和截留液，用雙縮脲法測定截留液和濾過液中蛋白質(zhì)或多肽含量。

1.3.2.2 大孔吸附樹脂柱層析

大孔吸附樹脂的分離機(jī)理為吸附原理和分子篩原理。它主要通過分子間作用力如范德華力或氫鍵等進(jìn)行吸附，吸附劑表面的親水性或疏水性決定了其具有不同的吸附特性；同時(shí)，本身的多孔性結(jié)構(gòu)亦決定其具有一定的分子篩作用[18]。

大孔吸附樹脂經(jīng)無水乙醇浸泡24 h后，用去離子水洗至無醇味。采用濕法裝柱[19]，實(shí)驗(yàn)條件：DA201-C大孔吸附樹脂；層次柱規(guī)格：1.5 cmh30 cm；樣品質(zhì)量濃度：10 mg/mL；檢測波長：214 nm。將樣品溶液以1 BV/h流速流經(jīng)層析柱，上樣結(jié)束后，用去離子水以1 BV/h的流速洗滌層析柱至無吸收峰[20]，之后分別用25%、50%、75%和95%的乙醇以2 BV/h的流速流經(jīng)層析柱，收集各洗脫峰，經(jīng)真空旋蒸濃縮后真空冷凍干燥得到各組分。

1.3.3 抗菌肽抑菌活性的檢測

1.3.3.1 超濾后各組分抑菌活性的檢測

以大腸埃希氏菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌為受試菌。將加熱融化的PCA培養(yǎng)基15 mL注入無菌平皿中，待凝固后，用接種環(huán)刮取保存在斜面培養(yǎng)基上的單菌落，劃線培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h。然后再取單菌落接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)20 h。用平板計(jì)數(shù)法確定菌液濃度，根據(jù)菌液濃度將菌液稀釋至104CFU/mL。

采用酶標(biāo)儀比濁法[21-22]檢測抗菌肽的抑菌活性。取真空冷凍干燥后的各組分，加無菌蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為16 000 μg/mL樣品溶液。將菌液濃度調(diào)整至104CFU/mL。利用無菌96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，向2～12孔中加入100 μL無菌營養(yǎng)肉湯，取已配好的樣品溶液加入孔1孔2各100 μL，混勻孔2，然后從中吸取100 μL加入孔3，依次采用梯度稀釋的方法稀釋，混勻至孔11，最后從孔11中吸出100 μL棄除。然后，向每孔中接入備用菌液100 μL，使每孔中樣品的最終質(zhì)量濃度依次為8 000、4 000、2 000、1 000、500 3.9、0 μg/mL。每個(gè)樣品做3 個(gè)平行，利用酶標(biāo)儀中測定其初始OD630nm值。然后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，間隔2 h測一次OD630nm值。樣品抑菌活性用培養(yǎng)前后OD630nm差值表示，差值越小，表明培養(yǎng)后細(xì)菌數(shù)越少，樣品的抑菌作用越強(qiáng)。

1.3.3.2 大孔吸附樹脂柱層析后各峰抑菌活性的檢測

取柱層析后所得各峰的真空冷凍干燥組分，用無菌蒸餾水稀釋至質(zhì)量濃度為8 000 μg/mL。其余步驟同1.3.3.1節(jié)。

1.3.3.3 各峰處組分最低抑菌質(zhì)量濃度的測定

按1.3.3.1節(jié)方法制作96 孔平板，利用酶標(biāo)儀在630 nm波長處測光密度（OD）值后，37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)24 h后，再次測定96 孔平板各孔吸光度，計(jì)算各孔培養(yǎng)前后的OD630nm差值。培養(yǎng)前后OD630nm差值小于0.05的各峰組分溶液，結(jié)合肉眼觀察澄清者[20-23]，即可判定為最低抑菌質(zhì)量濃度（minimun inhibitory concentration，MIC）。

1.3.3.4 各峰半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）的測定

IC50指在用藥后存活的細(xì)胞數(shù)量減少一半時(shí)所需的藥物濃度。選用SPSS 22.0軟件計(jì)算各峰的IC50。

1.3.4 Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，Tricine-SDS-PAGE）檢測

分離膠和濃縮膠的制備與一般SDS-PAGE制膠方法相同，分離膠和濃縮膠的配制見表1。

表1 分離膠和濃縮膠的組成Table 1 Composition of separating and stacking gels

將冷凍干燥后的樣品用適量蒸餾水溶解，與等體積的上樣緩沖液混合，100 ℃水浴加熱10 min后，冷卻至室溫。在內(nèi)槽中倒入陰極緩沖液，外槽中倒入陽極緩沖液，在50 V恒壓電泳1 h，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，電壓升到100 V（約1.5 h時(shí)）染料前沿遷移至距硅膠橡膠框底邊1～1.5 cm處，停止電泳。將凝膠放入固定液中固定20 min，45 ℃染色30 min，脫色，直至條帶清晰。

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對遷移率為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知抗菌肽的相對遷移率計(jì)算出其分子質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理均采用Microsoft Excel軟件計(jì)算及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾結(jié)果分析

圖1 超濾次數(shù)與多肽含量的關(guān)系Fig.1 Relationship between number of ultrafiltration cycles and peptide concentration

由圖1A可知，粗提物復(fù)溶液通過10 kD膜包時(shí)，截留液和濾過液中蛋白質(zhì)及多肽含量隨超濾次數(shù)的增加逐漸下降[24]，超濾3 次后，其含量趨于穩(wěn)定，即分子質(zhì)量大于10 kD的多糖及蛋白質(zhì)等留在截留液中，小于10 kD的多肽絕大部分已通過膜包，達(dá)到初步分離的目的。取通過截留分子質(zhì)量10 kD膜包的濾過液過5 kD膜包，同理取通過5 kD膜包的濾過液過1 kD膜包。由圖1B、C可知，截留液和濾過液中蛋白及多肽含量隨超濾次數(shù)的增加逐漸降低，超濾4 次后趨于穩(wěn)定，初步分離出分子質(zhì)量小于5 kD和1 kD的組分，最后得到各組分的分子質(zhì)量分別是5～10、1～5 kD及＜1 kD。

2.2 超濾后各組分抑菌活性檢測結(jié)果及分析

采用酶標(biāo)儀比濁法測各組分的OD630nm值，再計(jì)算得到樣品抑菌的OD630nm差值，結(jié)果見圖2。

圖2 各組分對4 種菌株生長的影響Fig.2 Effects of various ultra-filtration components on the growth of four kinds of bacteria

由圖2可知，分子質(zhì)量在5～10 kD的多肽組分對大腸埃希氏菌、腸炎沙門氏菌和金黃色葡萄球菌無抑制作用，反而促進(jìn)其生長，對枯草芽孢桿菌有微弱的抑制作用，說明分子質(zhì)量在5～10 kD的組分抗菌肽含量很少，而且大部分組分可能是大分子蛋白，給細(xì)菌的生長提供了營養(yǎng)物質(zhì)。分子質(zhì)量在1～5 kD的多肽組分對腸炎沙門氏菌的抑菌活性最高，但對金黃色葡萄球菌的生長無抑制作用，分子質(zhì)量＜1 kD對除腸炎沙門氏菌外的其他3 種菌株的抑菌活性最強(qiáng)。因此，綜合考慮，選用分子質(zhì)量＜1 kD的多肽組分進(jìn)行下一步大孔吸附樹脂柱層析實(shí)驗(yàn)。

2.3 大孔吸附樹脂層析結(jié)果分析

取分子質(zhì)量＜1 kD的組分10 mg，加1 mL蒸餾水復(fù)溶，離心上樣。依次選用體積分?jǐn)?shù)25%、50%、75%和95%的乙醇做洗脫劑，各自得到一個(gè)洗脫峰，分別記為F1、F2、F3和F4。由于25%、50%、75%和95%乙醇的吸光度依次增大，所以F1、F2、F3和F4的基線依次增高，結(jié)果如圖3所示。

圖3 大孔吸附樹脂柱層析分離結(jié)果Fig.3 Chromatographic separation of antimicrobial peptides on macroporous resin column

2.4 酶標(biāo)儀比濁法測抑菌活性結(jié)果分析

采用酶標(biāo)儀比濁法檢測各峰的OD630nm值，計(jì)算樣品抑菌的OD630nm差值、MIC、IC50，結(jié)果分別見圖4、表2及表3。

圖4 各峰組分對4 種菌株的抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of various components of the < 1 kD fraction on four kinds of bacteria

表2 F1、F2、F3和F4組分對4 種菌株的MICTable 2 MICs of various components of the<1 kD fraction against four kinds of bacteriaμg/mL

表3 F1、F2、F3和F4組分對4 種菌株的IC50Table 3 IC50values of various components of the<1 kD fraction against four kinds of bacteriaμg/mL

由圖4可知，低質(zhì)量濃度時(shí)，F(xiàn)1、F2、F3和F4組分對4 種菌株均無抑菌活性，隨樣品質(zhì)量濃度的增加OD630nm差值逐漸減小，抑菌活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2 000 μg/mL時(shí)，F(xiàn)3的OD630nm差值接近0，說明在此質(zhì)量濃度下，F(xiàn)3組分可完全抑制4 種菌株的生長。F1組分對4種菌株的抑菌活性最差，F(xiàn)4組分次之。F2組分和F3組分對大腸埃希氏菌的抑制作用相差不大，F(xiàn)3組分對其余3 種菌株的抑菌活性高于F2組分。周祥敏等[25]采用大孔吸附樹脂法純化菝葜中皂苷類成分，用蒸餾水、30%乙醇和70%乙醇依次洗脫，發(fā)現(xiàn)抑菌活性部位菝葜皂苷富集于70%乙醇洗脫液中。傅勇等[26]研究無患子皂苷及其抑菌活性發(fā)現(xiàn)，抑菌活性部位無患子皂苷富集于70%乙醇洗脫液中。本實(shí)驗(yàn)中F3組分是由75%的乙醇洗脫得到的峰，其抑菌活性最強(qiáng)，與前人的研究結(jié)果一致。由不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫得到的峰具有不同的疏水性，乙醇體積分?jǐn)?shù)越高得到的峰疏水性越強(qiáng)。因此，各洗脫組分疏水性大小順序?yàn)镕4＞F3＞F2＞F1。過振宇[20]研究家蠅抗菌肽時(shí)，考察了15%、35%、55%乙醇洗脫組分抑菌活性與其疏水性的關(guān)系，結(jié)果表明隨洗脫組分疏水性的增加，抑菌活性增強(qiáng)。不同物種來源的抗菌肽一級結(jié)構(gòu)具有相似之處，C端含較多疏水殘基，N端富含親水氨基酸，具有雙親結(jié)構(gòu)[3]。F4組分疏水性過大，可能含親水性氨基酸較少，且F4組分的水溶性較F2和F3組分差，所以F4組分的抑菌活性比F2、F3組分差。由表2可知，F(xiàn)3組分對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好。由表3可知，F(xiàn)3組分對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌及枯草芽孢桿菌的IC50均比F2組分的小，因此，綜合來說F3組分的抑菌活性最強(qiáng)。

十八大報(bào)告明確指出：“加大非公有制經(jīng)濟(jì)組織、社會組織黨建工作力度”“擴(kuò)大黨組織和黨的工作覆蓋面”“創(chuàng)新基層黨建工作，夯實(shí)黨執(zhí)政的組織基礎(chǔ)”。因此，正確把握新形勢下非公有制經(jīng)濟(jì)組織黨組織建設(shè)現(xiàn)狀，分析其面臨的新情況新特點(diǎn)，及時(shí)跟進(jìn)黨組織設(shè)置，加大在非公有制經(jīng)濟(jì)組織中黨建工作的力度，仍然是當(dāng)前各級黨委面臨的重要課題。

2.5 Tricine-SDS-PAGE檢測結(jié)果

將F3組分進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE，并根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其分子質(zhì)量。

圖5 F3組分的Tricine-SDS-PAGE圖Fig.5 Tricine-SDS-PAGE of F3separated from the < 1 kD fraction

由圖5可知，F(xiàn)3組分在分離膠上表現(xiàn)為單一條帶，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對遷移率為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=－0.742 2x+1.257 6（R2=0.988 5），計(jì)算出仿刺參體壁抗菌肽的分子質(zhì)量為4.35 kD。由于多肽多呈現(xiàn)為線性結(jié)構(gòu)在膜附近自身的可變形范圍較大，再加上跨膜壓力的驅(qū)動作用，從而使部分高于理論截留分子質(zhì)量的多肽進(jìn)入濾過液[27]。所以濾過液部分組分的分子質(zhì)量大于截留分子質(zhì)量。

3 結(jié) 論

抗菌肽多為堿性小分子多肽，且具有分子質(zhì)量小、抗菌譜廣等特點(diǎn)。提取小分子活性多肽的方法主要有：有機(jī)溶劑浸提法、水浸提法、有機(jī)酸浸提法等。由于大多數(shù)抗菌肽含正電荷氨基酸，是陽離子型，采用5%乙酸浸提，既可避免強(qiáng)酸，強(qiáng)堿對其的破壞，又可以獲得較高含量的抗菌肽粗提物[28]。王斌等[8]研究了仿刺參不同組織液的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)仿刺參體腔液、體腔液上清液和體腔細(xì)胞懸液對哈氏孤菌（Vibrio harveyi H06091）、白色葡萄球菌（Staphylococcus）和遲鈍愛德華菌（Edwardsiella tarda）均無明顯抑制作用，而體壁組織勻漿液對3 種菌均有抑制作用。叢聰?shù)萚13]發(fā)現(xiàn)仿刺參體腔液在自然狀態(tài)下的抗菌能力有限，而體壁內(nèi)皮組織等在直接抑菌、抗菌應(yīng)答中扮演十分重要角色。在本實(shí)驗(yàn)中從仿刺參體壁組織勻漿液中分離得到的抗菌肽對大腸埃希氏菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有較強(qiáng)的抑制作用，與上述研究結(jié)果一致。此外，在其他種類的海參中也分離得到了抗菌肽。如：Haug等[29]研究Cucumaria frondosa的多處組織和細(xì)胞中含抗菌活性物質(zhì)，但體壁組織提取物和體腔細(xì)胞中的抗菌活性物質(zhì)含量最高。Beauregard等[5]從Cucumaria frondosa中分離得到1 種分子質(zhì)量約為6 kD的抗菌肽，此外，還發(fā)現(xiàn)在Cucumaria frondosa中存在更小分子的多肽，可抑制金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的生長。Li等[30]從綠球海膽中發(fā)現(xiàn)2 種陽離子抗菌肽，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和棒狀桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用。

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Isolation and Activity of Antimicrobial Peptide from Body Wall of Apostichopus japonicas

The antimicrobial peptide was obtained from the body wall of Apostichopus japonicas and its activity was evaluated. The crude peptide was extracted from the body wall with 5% acetic acid and subjected to bioassay-guided fractionation for antimicrobial activity. The purification was completed by ultra-filtration and chromatographic separation with macroporous resin. A turbidimetric method was applied to evaluate the inhibitory activity of each sample against bacteria including Escherichia coli, Salmonella eternitidis, Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis. By using Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (Tricine-SDS-PAGE), the molecular weight of the purified antimicrobial peptide was measured. The results showed that three components with different molecular weights < 1 kD, 1–5 kD and 5–10 kD were obtained after ultra-filtration. The component with molecular weight of ＜ 1 kD had the strongest antibacterial activity， and then it was chosen for further chromatographic separation with macroporous resin column. The subcomponent F3 with the highest antimicrobial activity was obtained and its molecular weight was identified as 4.35 kD.

Apostichopus japonicas body wall； antimicrobial peptides； separation and purification； antimicrobial activity；turbidimetric method

MENG Chunying1,2, WANG Maojian2,3, ZHANG Jian2,3,*, WANG Gongming2, LIU Xin2, JING Yuexin2, WANG Ting1,2
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 200000, China; 2. Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China; 3. Shandong Provincial Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology, Yantai 264006, China)

10.7506/spkx1002-6630-201607007

TS254.1

A

1002-6630（2016）07-0033-06

孟春英, 王茂劍, 張健, 等. 仿刺參體壁中抗菌肽的分離及抑菌活性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(7): 33-38. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201607007. http://www.spkx.net.cn

MENG Chunying, WANG Maojian, ZHANG Jian, et al. Isolation and activity of antimicrobial peptide from body wall of Apostichopus japonicas[J]. Food Science, 2016, 37(7): 33-38. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607007. http://www.spkx.net.cn

2015-06-04

國家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201205027；201105029）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系刺參產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（SDAIT-08）；山東省2014年農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目；煙臺市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2014ZH081）；水生動物營養(yǎng)與飼料泰山學(xué)者崗位經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（TS 200651036）；山東省自然科學(xué)基金培養(yǎng)基金項(xiàng)目（ZR2014CP030）

孟春英 （1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：1181401663@qq.com

*通信作者：張?。?980—），男，助理研究員，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笫称房茖W(xué)。E-mail：zjsd408@163.com