李亞娟，王東升，張世棟，嚴(yán)作廷，楊志強(qiáng)，杜玉蘭，董書偉，何寶祥

?

基于GC-MS技術(shù)的蹄葉炎奶牛血漿代謝譜分析

李亞娟1,2，王東升1，張世棟1，嚴(yán)作廷1，楊志強(qiáng)1，杜玉蘭2，董書偉1，何寶祥2

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，蘭州 730050；2廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南寧 530005）

【目的】利用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatograph tandem mass spectrometer technology, GC-MS）對(duì)奶牛血漿進(jìn)行代謝組學(xué)分析，以明確奶牛發(fā)生蹄葉炎時(shí)血漿中代謝物的變化，進(jìn)一步揭示其發(fā)病機(jī)制?！痉椒ā扛鶕?jù)蹄葉炎奶牛的臨床癥狀和活動(dòng)量情況，選取蹄葉炎患病組S和健康對(duì)照組C奶牛各10頭，采集血漿樣品，經(jīng)衍生化處理后，利用GC-MS方法對(duì)兩組奶牛的血漿進(jìn)行全部代謝物檢測(cè)。用SIMCA-P 11.5軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis, PCA）和偏最小二乘法分析（supervised partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA），對(duì)蹄葉炎組奶牛和健康組奶牛檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別分析，篩選差異代謝物,并利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行代謝通路富集分析。為進(jìn)一步驗(yàn)證代謝組學(xué)的試驗(yàn)結(jié)果，檢測(cè)了與差異代謝通路相關(guān)的脂質(zhì)代謝指標(biāo)和抗氧化能力指標(biāo)。【結(jié)果】利用GC-MS方法，在奶牛血漿中共檢測(cè)到242種代謝物，通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)合t-檢驗(yàn)篩選出37種差異代謝物(VIP＞1，＜0.05)，其中在蹄葉炎奶牛血漿中3種物質(zhì)含量上調(diào)（FC＞1），分別是氨基氧乙酸、油酸、乳糖，34種物質(zhì)含量下調(diào)（FC＜1），包括脂肪酸、氨基酸等。經(jīng)代謝通路富集分析，發(fā)現(xiàn)變化顯著(＜0.05)的代謝通路包括脂肪酸生物合成通路，甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路，不飽和脂肪酸生物合成通路，嘌呤代謝通路，甲烷代謝通路，苯丙氨酸代謝通路和氰基氨基酸代謝通路。在驗(yàn)證試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)兩組奶牛血漿中脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)差異顯著，且蹄葉炎患病牛血漿抗氧化能力顯著低于健康牛，與代謝組學(xué)結(jié)果一致?！窘Y(jié)論】利用GC-MS技術(shù)分析了蹄葉炎患病牛與健康奶牛血漿代謝譜的變化，發(fā)現(xiàn)兩組間代謝物存在顯著差異，并篩選出了37種差異代謝物，而這些差異分子可能成為奶牛蹄葉炎早期診斷或群體監(jiān)測(cè)的潛在生物標(biāo)記物。本結(jié)果全面揭示了奶牛蹄葉炎發(fā)生后血漿代謝物的代謝規(guī)律，為進(jìn)一步闡明其發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

代謝組學(xué)；蹄葉炎；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；奶牛

0 引言

【研究意義】隨著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，奶牛蹄病已成為繼乳房炎和繁殖疾病之后危害奶牛健康的重要疾病，而蹄葉炎是最為常見(jiàn)的一種蹄病[1]。蹄葉炎是蹄壁真皮的乳頭層和血管層發(fā)生的彌漫性、漿液性和無(wú)菌性炎癥[2]，可導(dǎo)致蹄變形、蹄底潰瘍病及白線病等多種蹄病，引起奶牛疼痛不安，嚴(yán)重影響了動(dòng)物福利，造成奶牛生產(chǎn)性能明顯下降，帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，制約了奶業(yè)的健康發(fā)展。因此，開(kāi)展對(duì)奶牛蹄葉炎病因、發(fā)病機(jī)理、診斷和防治等方面的研究，對(duì)防治奶牛蹄葉炎、提高奶牛生產(chǎn)性能具有重要的實(shí)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。【前人研究進(jìn)展】有人認(rèn)為奶牛蹄葉炎是機(jī)體全身代謝紊亂的局部表現(xiàn)，也與營(yíng)養(yǎng)、遺傳和管理等綜合因素有關(guān)，還可繼發(fā)于瘤胃酸中毒、乳房炎、胎衣不下、酮病和子宮內(nèi)膜炎等[3-4]。如當(dāng)奶牛攝入過(guò)多精料，發(fā)生瘤胃酸中毒時(shí)，瘤胃內(nèi)微生物異常發(fā)酵，釋放出內(nèi)毒素、組胺等有害物質(zhì)，隨血液循環(huán)作用于蹄部，引發(fā)蹄葉炎，而乳酸、內(nèi)毒素和組織胺正是引發(fā)該病的主要因素[5]。THOEFNER等[6]利用過(guò)量飼喂低聚果糖建立了奶牛急性蹄葉炎的病理模型，齊長(zhǎng)明等[7]通過(guò)給奶牛皮下注射二磷酸組織胺后，牛蹄部出現(xiàn)了蹄葉炎的臨床癥狀。因此，奶牛發(fā)生蹄葉炎時(shí)，機(jī)體的碳水化合物代謝[8]和脂質(zhì)代謝[9]發(fā)生了紊亂，但其他物質(zhì)的代謝是否發(fā)生了變化？這些變化在蹄葉炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中是什么角色，尚無(wú)人知曉。因此，對(duì)奶牛蹄葉炎發(fā)病時(shí)體內(nèi)整體代謝變化的全面了解，將有助于揭示其發(fā)病機(jī)制。【本研究切入點(diǎn)】代謝組學(xué)是研究生物在內(nèi)外因素影響下，機(jī)體代謝輪廓變化規(guī)律的學(xué)科[10]，通過(guò)代謝組學(xué)的方法，對(duì)患病和健康動(dòng)物進(jìn)行代謝物的全譜檢測(cè)，對(duì)比分析代謝輪廓的改變，有助于認(rèn)識(shí)疾病過(guò)程中體內(nèi)物質(zhì)代謝途徑的改變[11]。因此，代謝組學(xué)已被廣泛地應(yīng)用于疾病的診斷[12]和生物標(biāo)記物的篩選[13-14]。目前，代謝組學(xué)常用的技術(shù)平臺(tái)包括核磁共振波譜法（NMR）,高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS），傅里葉變換紅外光譜法（FT-IR)和氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[15]，其中由于GC-MS具有較高的分辨度和靈敏度以及良好的重現(xiàn)性而被廣泛使用[16-17]。但是，關(guān)于奶牛蹄葉炎的代謝譜研究還尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，對(duì)奶牛蹄葉炎發(fā)病時(shí)體內(nèi)代謝變化的全面了解，將有助于了解其發(fā)病機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】擬采用GC-MS技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法，分析健康和患蹄葉炎病牛的血漿代謝譜，旨在找出疾病過(guò)程中變化顯著的內(nèi)源性代謝物和代謝通路，為進(jìn)一步闡明該病的發(fā)病機(jī)理提供理論依據(jù)，為早期診斷與防治蹄葉炎提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2014年9月至2015年5月執(zhí)行，其中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩選和血樣采集在甘肅省奶牛繁育中心完成,，GC-MS檢測(cè)由上海博苑生物科技有限公司完成，樣品處理、保存和后期的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所完成。

1.2 試劑與儀器

安捷倫7890B GC/5977A MS聯(lián)用儀（Agilent，USA），配有非極性的DB-5毛細(xì)管柱（30 m×250 μm I.D.，J&W Scientific，F(xiàn)olsom，CA）；高速低溫離心機(jī)；快速離心濃縮儀；渦旋混合器。

甲氧胺鹽酸吡啶溶液，N,O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA），三甲基氯硅烷（TMCS）均為Sigma色譜純。冷甲醇，L-2-氯-苯丙氨酸和正己烷等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。牛組織胺（Histamine，His）ELISA試劑盒，購(gòu)自上海橋杜生物技術(shù)公司，內(nèi)毒素檢測(cè)使用鱟試劑的終點(diǎn)顯色法（Chromogenic End- point Tachypleus Amebocyte Lysate，CETAL），購(gòu)自廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司。血漿生化指標(biāo)的測(cè)定[9]使用全自動(dòng)生化分析儀（深圳邁瑞公司BS-420），抗氧化指標(biāo)測(cè)定所使用的試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所。

1.3 動(dòng)物選擇和分組

在甘肅省某奶牛場(chǎng)選擇健康對(duì)照組C和蹄葉炎患病組S奶牛各10頭，蹄葉炎奶牛選取標(biāo)準(zhǔn)是通過(guò)活動(dòng)量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)近兩天內(nèi)活動(dòng)量有顯著降低的奶牛，再根據(jù)有跛行、弓背、蹄部觸診敏感和患蹄腫脹等臨床癥狀，排除腐蹄病、蹄毛疣和趾間增生等病例，經(jīng)獸醫(yī)診斷為蹄葉炎且無(wú)其他疾病臨床癥狀，近期無(wú)用藥記錄，經(jīng)組織胺和內(nèi)毒素檢測(cè)[18-20]的泌乳牛10頭作為患病組S。對(duì)照健康奶牛的選取標(biāo)準(zhǔn)是：肢蹄健康，無(wú)其他疾病臨床癥狀，近期無(wú)用藥記錄的泌乳奶牛10頭作為對(duì)照組C。并統(tǒng)計(jì)兩組奶牛的年齡、胎次、產(chǎn)奶量和體況評(píng)分（body condition score，BCS），各組奶?；厩闆r見(jiàn)表1。常規(guī)飼養(yǎng)管理，兩組奶牛均飼喂相同的日糧、自由采食和飲水，該奶牛場(chǎng)生產(chǎn)用日糧配方為：精料10 kg、青貯15 kg、干草4 kg、脂肪350 g，其日糧營(yíng)養(yǎng)成分含量見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。

表1 試驗(yàn)用奶牛的臨床資料和理化指標(biāo)（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

同行數(shù)據(jù)后所標(biāo)字母相異表示差異顯著（＜0.05），所標(biāo)字母相同表示差異不顯著（＞0.05）

Different letters in the same row means significant difference between the treatments (＜0.05), the same letter in the same row means not significant difference between treatments (＞0.05)

1.4 樣品采集

在清晨飼喂前采用含有EDTA K2抗凝劑的真空采血管尾靜脈采集全血8 mL，3 000×g離心15 min，將血漿分裝到EP管內(nèi)，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 血漿樣品的衍生化

血漿樣品在室溫下解凍血漿樣品后取 50 μL加入150 μL冷甲醇和 10 μL內(nèi)標(biāo)（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg·mL-1，甲醇配制）渦旋2 min，然后超聲提取10 min，再低溫離心10 min（14 000 r/min，4℃）。取150 μL上清液至玻璃衍生瓶中，快速蒸干后加入80 μL甲氧胺鹽酸吡啶溶液（15 mg·mL-1），渦旋震蕩 2 min后，于震蕩培養(yǎng)箱中37℃肟化反應(yīng)90 min，取出后再加入80 μL BSTFA（含1%TMCS）衍生試劑和20 μL正己烷，渦旋震蕩 2 min，于70℃反應(yīng)60 min。室溫放置30 min后，上機(jī)GC/MS分析小分子代謝物。在測(cè)定過(guò)程中，插入質(zhì)控樣本（QC），質(zhì)控樣本制備方法為取小部分所有待測(cè)樣本的混合物，對(duì)測(cè)定過(guò)程進(jìn)行監(jiān)督。

1.6 測(cè)定條件

氣相條件：載氣為高純氦氣；載氣流速為1.0 mL·min-1；程序升溫為0—2 min至 80℃；2—12min至 80—180℃；12—24 min至 180—240℃；24—26 min至 240—280℃；26—35 min至280℃。

質(zhì)譜條件：EI源溫度為220℃；電壓為-70V；質(zhì)量掃描范圍為 30—600（m/z）；采集速度為20譜/秒。

1.7 代謝物鑒定

使用GC-MS聯(lián)用儀對(duì)血漿樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，所產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換至NetCDF格式，之后采用Leco TOF軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化，包括降噪，保留時(shí)間校正，峰對(duì)齊和反卷積等數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化分析[21]。根據(jù)GC-MS總離子流圖中各峰的保留時(shí)間選取共有峰（即各圖中共有的色譜峰），每個(gè)化合物的特征離子片段譜的碎片質(zhì)荷比和豐度與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)局化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（national institute of standards and technology, NIST）、Feihn代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)離子片段譜庫(kù)比對(duì)，以匹配度超過(guò)70%的檢測(cè)物被認(rèn)為是與之匹配的代謝物。

1.8 多元統(tǒng)計(jì)分析

將歸一化后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P+11.5軟件包（Umetrics，Umea，Sweden），先采用無(wú)監(jiān)督的主成分分析（principal component analysis，PCA）觀察各樣本間的總體分布，然后用有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis PLS-DA）區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異，找到組間的差異代謝物。為防止模型過(guò)擬合，采用七次循環(huán)交互驗(yàn)證和200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)的方法來(lái)考察PLS-DA模型的質(zhì)量。通過(guò)PLS-DA分析，結(jié)合t-檢驗(yàn)，變量權(quán)重值（variable important in projection, VIP）大于1且＜0.05的變量被認(rèn)為是差異變量。

1.9 代謝通路富集分析

使用MBRole（http://csbg.cnb.csic.es/mbrole/）并結(jié)合KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,http://www.kegg.jp/）進(jìn)行代謝通路富集分析，鑒別出兩組間差異顯著的代謝通路，＜0.05說(shuō)明差異顯著。

1.10 驗(yàn)證試驗(yàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證GC-MS的結(jié)果，對(duì)患病組和健康組奶牛的血漿進(jìn)行了相關(guān)生化指標(biāo)和抗氧化能力檢測(cè)，主要檢測(cè)了脂質(zhì)代謝的相關(guān)指標(biāo)TG、TC、HDL-C和LDL-C與抗氧化能力的相關(guān)指標(biāo)T-AOC、SOD、MDA和GSH-Px。

2 結(jié)果

2.1 代謝物總離子圖分析與代謝物鑒定

對(duì)兩組血漿樣品的總離子流圖（TIC圖）進(jìn)行可視化檢查（圖1），發(fā)現(xiàn)所有樣品的儀器分析信號(hào)強(qiáng)、峰容量大且保留時(shí)間重現(xiàn)性好。通過(guò)將檢測(cè)結(jié)果與NIST數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對(duì)比，共鑒定出242個(gè)代謝物。為了進(jìn)一步表征兩組間代謝差異的特征，采用多元統(tǒng)計(jì)和單維統(tǒng)計(jì)相結(jié)合的方法獲得組學(xué)特征。

A：S組 S group；B：C組 C group

2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.2.1 PCA分析 PCA分析結(jié)果見(jiàn)圖2，圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，所有樣本均在95%的置信區(qū)間內(nèi)。PCA分析顯示其解釋率較高/強(qiáng)（2X=0.559），證實(shí)該分析模型可靠。由圖可見(jiàn)，S組主要分布在PC1的左側(cè)，C組主要分布在PC1的右側(cè)，在PC2上的分布雖有一定的重合，但大部分樣品分別聚類在PC2的上下兩側(cè)，說(shuō)明S組和C組有一定的組間差異性，并且QC樣本聚成一類，說(shuō)明整個(gè)分析方法（前處理方法和儀器分析系統(tǒng)）穩(wěn)健可靠，各試驗(yàn)組間的差異性是真實(shí)存在的。

PCA分析顯示：其解釋率較高/強(qiáng)（2X=0.559），證實(shí)該分析模型可靠PCA。得分圖中（圖2），每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，所有樣品基本在95%的置信區(qū)間內(nèi)。從圖中可以看出，S組主要分布在PC1的左側(cè)，C組主要分布在PC1的右側(cè)，在PC2上的分布雖有一定的重合，但大多數(shù)樣品分別聚類在PC2的上下兩側(cè)，說(shuō)明S組和C組有一定的組間差異性。并且QC樣本聚成一類，說(shuō)明整個(gè)分析方法（前處理方法和儀器分析系統(tǒng)）穩(wěn)健可靠，各試驗(yàn)組間的差異性是真實(shí)存在的。

2.2.2 PLS-DA分析 為了消除與分類不相關(guān)的噪音信息，在PCA模型的基礎(chǔ)上，建立了PLS-DA模型（2X=0.873，2Y=0.952，Q2=0.766），進(jìn)一步分析蹄葉炎與健康對(duì)奶牛在血漿代謝水平的變化血液代謝模式的影響。其中Q2表示模型的預(yù)測(cè)率，Q2＞0.5表示模型具有較好的判別分析能力。PLS-DA模型得分圖（圖3）顯示，兩組樣品之間有一定的差異，其中S組主要分布在PC1的右側(cè)，C組主要分布在PC1的左側(cè)，說(shuō)明兩組樣本在主成分坐標(biāo)軸上分離較好。

圖2 基于2組血漿GC-MS獲得的PCA得分圖

圖3 基于2組血漿GC-MS獲得的PLS-DA得分圖

采用200次響應(yīng)排序的方法對(duì)模型的穩(wěn)健性進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)圖4，參數(shù)為：2=0.673，Q2=–0.201，說(shuō)明此模型是穩(wěn)健可靠。

2.3 差異代謝物鑒定及相關(guān)代謝通路分析

通過(guò)PLS-DA分析后，并根據(jù)VIP＞1及t檢驗(yàn)的＜0.05的相對(duì)變量標(biāo)準(zhǔn)分析結(jié)果，將代謝物的峰面積進(jìn)行歸一化處理，經(jīng)過(guò)相對(duì)定量，得到各個(gè)結(jié)果在患病組和健康組奶牛血漿中共篩選到37個(gè)差異代謝物（表2）。其中有3種代謝物上調(diào)，分別是氨基氧乙酸、乳糖和油酸；有34種代謝物下調(diào)，代謝物在兩組間的變化差異倍數(shù)（fold change, FC），其中FC（S/C）為代謝物在患病組和健康組的比值。包括氨基酸、飽和脂肪酸以及與之代謝相關(guān)的化合物。

圖4 使用200次響應(yīng)法對(duì)PLS-DA進(jìn)行驗(yàn)證的點(diǎn)圖

通過(guò)MBRole和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析（圖5），兩組奶牛血漿中脂肪酸代謝（飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的生物合成）、氨基酸代謝存在極顯著差異(＜0.01)，嘌呤代謝、甲烷代謝和氰基氨基酸代謝等相關(guān)代謝途徑也存在顯著差異（＜0.05）。且兩組血漿中棕櫚酸和硬脂酸相對(duì)含量有所差異（圖6）。

1.脂肪酸生物合成通路，2.甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路，3.不飽和脂肪酸生物合成通路，4.嘌呤代謝通路，5.甲烷代謝通路，6.苯丙氨酸代謝通路，7.兩組奶牛血漿代謝總體通路，8.含腈氨基酸代謝通路

表2 S組和C組間的差異代謝物

RT=保留時(shí)間，F(xiàn)C=差異倍數(shù)，S組/C組。如果FC＞1，代表該物質(zhì)含量S組高于C組，值由T-檢驗(yàn)獲得

RT=retention time. FC=fold change, mean value of peak area obtained from S group/ mean value of peak area obtained from C group. If the FC value greater than1, means that metabolite are more in S group than in C group.values were obtained by T-test

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

奶牛血漿抗氧化能力指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，患病組奶牛血漿T-AOC和GSH-Px含量均低于健康組，差異顯著（＜0.05），MDA顯著高于健康對(duì)照組（＜0.05），但兩組間SOD差異不顯著。奶牛血漿生化相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4，蹄葉炎奶牛中的血漿含量TC、TG、LDL-C均顯著高于健康組奶牛，差異顯著（＜0.05）。由此說(shuō)明奶?；疾『?，機(jī)體抗氧化能力和脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，這與代謝組學(xué)結(jié)果相一致。

表3 兩組奶牛血漿抗氧化指標(biāo)（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

同列不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05），同列相同小寫字母表示差異不顯著（＞0.05）

Different letters in the same column mean significant difference (＜0.05) and same letters mean no significant difference (＞0.05)

表4 兩組奶牛血漿中脂質(zhì)代謝相關(guān)各指標(biāo)（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

同列不同大寫字母表示差異顯著(＜0.05)

Different letters in the same column mean significant difference (＜0.05)

圖6 兩組奶牛血漿中棕櫚酸和硬脂酸的相對(duì)含量

3 討論

3.1 奶牛血漿代謝譜分析

利用代謝組學(xué)篩選疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的生物標(biāo)記物，為疾病的早期診斷和治療提供理論依據(jù)，在人類和動(dòng)物疾病的研究中已有可喜進(jìn)展[11, 22-23]。但是采用代謝組學(xué)方法分析奶牛蹄葉炎的血漿代謝變化，這在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。目前，普遍認(rèn)為奶牛蹄葉炎是全身代謝紊亂的局部體現(xiàn)，但具體哪些代謝通路發(fā)生了變化還不清楚，本研究利用GC-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)蹄葉炎患病牛與健康奶牛血漿中存在37種差異代謝物，主要涉及脂肪酸生物合成通路，甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路和不飽和脂肪酸生物合成通路，另外，嘌呤代謝通路，甲烷代謝通路，苯丙氨酸代謝通路，含腈氨基酸代謝通路也發(fā)生了顯著變化。本研究全面分析了蹄葉炎患病牛與健康奶牛血漿代謝譜的變化，為進(jìn)一步解釋蹄葉炎的發(fā)生提供了一定的理論依據(jù)。

目前普遍認(rèn)為奶牛過(guò)量食入精料后，引起亞急性瘤胃酸中毒[24]，從而導(dǎo)致蹄葉炎，并且有很多研究通過(guò)飼喂過(guò)量碳水化合物，成功建立了蹄葉炎病理模型[6]，但本試驗(yàn)通過(guò)代謝通路富集分析，并未發(fā)現(xiàn)血漿中與能量代謝相關(guān)的通路存在顯著差異，只是與能量代謝相關(guān)的部分代謝物有所變化，推測(cè)可能是當(dāng)奶牛發(fā)生瘤胃酸中毒時(shí)，瘤胃微生物異常發(fā)酵，釋放出內(nèi)毒素和組胺，經(jīng)血液循環(huán)運(yùn)送到蹄部，作用于蹄部微循環(huán)，改變了血管通透性，造成蹄部的微循環(huán)障礙，從而引起局部的能量代謝變化，而并未表現(xiàn)出全身的能量代謝障礙。這與MEDINA[8]的研究結(jié)果一致，他發(fā)現(xiàn)馬發(fā)生蹄葉炎時(shí)，在蹄部間質(zhì)組織中能量代謝發(fā)生改變，而在血漿中并未表現(xiàn)出能量代謝障礙，這可能與血液的自我穩(wěn)態(tài)調(diào)控有關(guān)。

3.2 脂質(zhì)代謝異常

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蹄葉炎患病組和健康組奶牛相比，血漿中脂質(zhì)代謝通路發(fā)生了顯著變化（圖3），并經(jīng)過(guò)相關(guān)的試驗(yàn)證明，發(fā)現(xiàn)蹄葉炎患病牛與健康奶牛血漿中脂質(zhì)代謝的相關(guān)指標(biāo)有顯著差異（表4），說(shuō)明奶牛發(fā)生蹄葉炎時(shí)脂質(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂，這與筆者前期的蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果一致[25]。顯示，蹄葉炎患病牛血漿中棕櫚酸和硬脂酸含量低于健康奶牛，說(shuō)明奶牛發(fā)生蹄葉炎時(shí)脂肪酸合成受阻（圖6）。已知脂肪酸的生物合成起始于乙酰-CoA轉(zhuǎn)換成丙二酸單酰-CoA，這步反應(yīng)是在乙酰-CoA羧化酶的作用下實(shí)現(xiàn)的。乙酰-CoA羧化酶是脂肪酸生物合成的關(guān)鍵酶，生物素是其輔基。因此生物素含量下降時(shí)，會(huì)通過(guò)抑制乙酰-CoA羧化酶的活性而影響脂肪酸的合成。KHALED[26]等發(fā)現(xiàn)，跛行牛和健康牛血清中生物素的含量與機(jī)體抗氧化能力顯著負(fù)相關(guān)，當(dāng)機(jī)體抗氧化能力下降時(shí)，生物素含量隨之下降。本研究中進(jìn)行的試驗(yàn)也表明蹄葉炎患病牛的抗氧化能力降低，因此，生物素含量會(huì)降低，抑制乙酰-CoA羧化酶的活性，使脂肪酸生物合成受阻，導(dǎo)致棕櫚酸和硬脂酸含量下降。另有研究表明，奶牛發(fā)生蹄葉炎時(shí)血漿膽固醇含量升高[9]。眾所周知，有機(jī)體生物合成膽固醇的原料為乙酰-CoA，奶牛發(fā)生蹄葉炎時(shí)，膽固醇的大量合成也會(huì)影響脂肪酸的合成。

本研究中脂肪酸合成通路和不飽和脂肪酸合成通路均異常，因此，脂質(zhì)代謝通路可作為一條新的線索來(lái)進(jìn)一步明確蹄葉炎的發(fā)病機(jī)制。

3.3 氨基酸代謝異常

本研究結(jié)果顯示蹄葉炎患病牛血漿中許多氨基酸含量低于健康組奶牛，推測(cè)可能是丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸碳骨架分解后會(huì)形成乙酰-CoA，以調(diào)節(jié)體內(nèi)的脂肪酸合成異常。甘氨酸和絲氨酸在動(dòng)物的生命活動(dòng)中有重要作用，為核酸和脂質(zhì)的合成提供前體物質(zhì)[27]，而且在炎癥[28]，腫瘤[29]，癌癥[30]的發(fā)生過(guò)程中也有一定的作用，說(shuō)明甘氨酸和絲氨酸在維持動(dòng)物健康方面有重要作用。AMELIO[31]研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸的合成還會(huì)直接影響細(xì)胞的抗氧化能力。蹄葉炎發(fā)生時(shí)，奶牛體內(nèi)絲氨酸含量下降，細(xì)胞抗氧化能力下降，細(xì)胞功能受損，更容易受到組胺和內(nèi)毒素的侵害。許多氨基酸如：甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等還可作為一碳單位的來(lái)源，從而參與嘌呤與嘧啶的生物合成，本研究結(jié)果中蹄葉炎患病牛嘌呤代謝異常可能是由于氨基酸含量下降引起的。另外，經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)查閱發(fā)現(xiàn)，甲烷代謝通路（ko00680，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)）中甘氨酸和絲氨酸可通過(guò)四氫葉酸轉(zhuǎn)移一碳單位參與其中，因此在本試驗(yàn)中甲烷代謝通路在蹄葉炎奶牛中也表現(xiàn)出異常。

綜上所述，氨基酸代謝在蹄葉炎的發(fā)生過(guò)程中至關(guān)重要，且甘氨酸/蘇氨酸/絲氨酸代謝通路異常會(huì)影響其他幾條通路，今后應(yīng)給予進(jìn)一步研究，為揭示蹄葉炎的機(jī)理和防治提供新的線索。

4 結(jié)論

本研究基于氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)研究方法，研究了奶牛發(fā)生蹄葉炎時(shí)血漿中小分子代謝物的改變，共有37種差異代謝物被鑒別出，其中3種物質(zhì)上調(diào)，34種物質(zhì)下調(diào)，主要涉及脂肪酸合成通路和甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路異常等。為進(jìn)一步研究蹄葉炎的機(jī)理和防治提供新的線索。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Plasma Metabolic Profiling Analysis of Dairy Cows with Laminitis Based on GC-MS

LI Ya-juan1,2, WANG Dong-sheng1, ZHANG Shi-dong1, YAN Zuo-ting1, YANG Zhi-qiang1, DU Yu-lan2, DONG Shu-wei1, HE Bao-xiang2

(1Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutical Development, Ministry of Agriculture/Key Laboratory of New Animal Drug Project, Gansu Province /Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730050;2College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005)

【Objective】In order to discover the difference between the cows suffered with laminitis and healthy cows, metabonomics analysis based on gas chromatograph tandem mass spectrometer technology (GC-MS) was utilized in the study.【Method】Twenty plasma samples were collected from cows with laminitis and healthy groups. Plasma metabolic profiling was obtained by GC-MS after derivatization. Multivariate statistics including principal component analysis (PCA) and supervised partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) were conducted to screen the changed metabolites. Bioinformatics was analyzed to identify the significantly changed metabolic pathways.【Result】A total of 242 variables were detected and 37 compounds were significantly different between healthy and laminitis-suffered cows of which 3 were up-regulated including aminooxyacetic acid, lactose and oleic acid and 34 were down-regulated in laminitis group involved amino acid and fatty acid. The main changed metabolic pathways were fatty acid biosynthesis, Gly, Ser, Thr metabolism, biosynthesis of unsaturated fatty acids, purine metabolism, methane metabolism, cyanoamino acid metabolism and phenylalanine metabolism. Results of the the experiment of validation showed that the indexes related to fatty acid metabolism and antioxidation were significantly different between healthy cows and sick cows. 【Conclusion】 Based on GC-MS, this study revealed the changed regularity of metabolism in plasma with laminitis, and the discovered different metabolites would be potential biomarkers in occurrence and development process of laminitis, which can lay a theoretical foundation for further understanding of the pathogenesis, early diagnosis and therapy of laminitis in dairy cows.

metabonomics; laminitis; gas chromatograph tandem mass spectrometer technology; dairy cow

2016-03-01；接受日期：2016-09-06

國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（31302156）、甘肅省青年科技基金計(jì)劃1506RJYA145、中央級(jí)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（1610322014012）

聯(lián)系方式：李亞娟，E-mail：18719826933@163.com。通信作者董書偉，E-mail：dongshuwei@caas.cn。通信作者何寶祥，E-mail：hebaox@gxu.edu.cn