任國(guó)艷，吳婷婷，張 凡，郭金英，崔國(guó)庭，吳 影，王 萍，曹 利（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003）

山藥黏液質(zhì)及其酶解物的微觀結(jié)構(gòu)及免疫活性

任國(guó)艷，吳婷婷，張 凡，郭金英，崔國(guó)庭，吳 影，王 萍，曹 利
（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003）

從鐵棍山藥中提取黏液質(zhì)，選取不同酶（胰蛋白酶、纖維素酶、復(fù)合蛋白酶）對(duì)其進(jìn)行酶解，得到不同酶解產(chǎn)物，采用紅外光譜和掃描電子顯微鏡技術(shù)，對(duì)黏液質(zhì)及其酶解物的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，同時(shí)采用體外細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，研究黏液質(zhì)及其酶解物對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化及細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示：黏液質(zhì)及其酶解物，在微觀結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)很大差別；黏液質(zhì)及其酶解物均能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化，但酶解物的促進(jìn)作 用強(qiáng)于黏液質(zhì)；黏液質(zhì)及其酶解物對(duì)Th1族細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)促進(jìn)作用顯著高于對(duì)Th2族細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)促進(jìn)作用，使細(xì)胞中Th1/Th2平衡向Th1方向偏移。

山藥黏液質(zhì)；酶解物；淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化；細(xì)胞因子；mRNA表達(dá)

山藥（Dioscorea opposita）是一種醫(yī)食同源的植物，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而鐵棍山藥更是被認(rèn)為山藥中的極品[1]。山藥中含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，其中黏液質(zhì)被認(rèn)為是山藥的主要有效成分，是糖和蛋白質(zhì)復(fù)合的大分子物質(zhì)，對(duì)山藥加工性能和藥理作用產(chǎn)生很大的影響[2]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)山藥黏液質(zhì)具有多種生物活性，能夠清除機(jī)體內(nèi)的自由基，具有抗氧化能力[3]；能夠抑制血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）的活性，具有降血壓的作用[4]；能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)[5]和增強(qiáng)機(jī)體免疫力[6]等活性。因此，黏液質(zhì)的功能活性已引起越來(lái)越多的關(guān)注。

山藥黏液質(zhì)的理化性質(zhì)及生物活性與其化學(xué)組成、分子鏈構(gòu)象等因素密切相關(guān)，有人用不同的酶酶解山藥黏液質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其理化性質(zhì)（如黏度）和生物活性均會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化[7]，但對(duì)酶解后黏液質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化研究較少；故本實(shí)驗(yàn)從鐵棍山藥中提取黏液質(zhì)，用3 種酶對(duì)山藥黏液質(zhì)進(jìn)行酶解，得到不同酶解產(chǎn)物，并對(duì)酶解產(chǎn)物的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析比較，然后通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，研究山藥黏液質(zhì)及其酶解產(chǎn)物對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化及細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響，為山藥黏液質(zhì)的開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵棍山藥（新鮮，未做任何處理），2015年6月10日購(gòu)于洛陽(yáng)盛德美超市。

胰蛋白酶（250 U/mg）、纖維素酶（400 U/mg）、復(fù)合蛋白酶（100 U/mg） 上海瑞永生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LG-0.2真空冷凍干燥機(jī) 沈陽(yáng)新陽(yáng)速凍設(shè)備制造公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；Gel DocXR+凝膠成像儀 美國(guó)伯樂(lè)公司；UV-2550紫外-可見分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；Vertex 70/80傅里葉交換紅外光譜儀 布魯克（北京）科技有限公司；JSM-5610LV掃描電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 山藥黏液質(zhì)的制備

新鮮鐵棍山藥→清洗、去皮→組織搗碎機(jī)進(jìn)行破碎→加入10 倍體積0.5 mol/L氯化鈉溶液浸提→過(guò)濾、離心→濃縮→乙醇分級(jí)沉淀→透析→低溫冷凍干燥→山藥黏液質(zhì)

乙醇分級(jí)沉淀，將無(wú)水乙醇緩慢加入濃縮液中，使其乙醇體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到30%、50%、75%，收集乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)溶液中的沉淀，進(jìn)行后續(xù)處理。

1.3.2 山藥黏液質(zhì)基本組成測(cè)定

總糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法；蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用凱氏定氮法；氨基酸組成測(cè)定采用氨基酸分析儀[8]；單糖組成分析測(cè)定采用氣相色譜法[9]。

1.3.3 山藥黏液質(zhì)酶解物的制備

1.3.3.1 復(fù)合蛋白酶酶解物的制備

[10]，稍加改動(dòng)。復(fù)合蛋白酶酶解山藥黏液質(zhì)的酶解條件為酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間2 h、加酶量25 mg/g、pH 7.0，水解度為52.36%，酶解后將酶解液煮沸5 min，2 000 r/min離心10 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮上清液后冷凍干燥，即得山藥黏液復(fù)合酶酶解物。

1.3.3.2 纖維素酶酶解物的制備

參考文獻(xiàn)[11]，稍加改動(dòng)。纖維素酶酶解山藥黏液質(zhì)的酶解條件為酶解溫度50 ℃、加酶量15 mg/g、酶解時(shí)間3 h、pH 5.0，還原糖含量最高為30.49%，酶解后將酶解液煮沸5 min，2 000 r/min離心10 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮上清液后冷凍干燥，即得山藥黏液質(zhì)纖維素酶酶解物。

1.3.3.3 胰蛋白酶酶解物的制備

參考文獻(xiàn)[12]，稍加改動(dòng)。胰蛋白酶酶解山藥黏液質(zhì)的酶解條件 為pH 7.5、酶解時(shí)間4 h、溫度45 ℃、加酶量20 mg/g，水解度為48.79%，酶解后將酶解液煮沸5 min，2 000 r/min離心10 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮上清液后冷凍干燥，即得山藥黏液質(zhì)胰蛋白酶酶解物。

1.3.4 山藥黏液質(zhì)及其酶解物電泳圖譜

參考文獻(xiàn)[13]方法電泳，稍有改動(dòng)。配制電泳試劑→制備5%濃縮膠、12%分離膠、電泳緩沖液→樣品變性處理→點(diǎn)樣→恒壓電泳→考馬斯亮藍(lán)染色→脫色→圖像分析。

1.3.5 山藥黏液質(zhì)及其酶解物紅外圖譜

將干燥的樣品與KBr壓制成片（待測(cè)樣品粉末與KBr粉末質(zhì)量比為1∶100），用Nicolet-Nexus470傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.3.6 山藥黏液質(zhì)及其酶解物紫外掃描圖譜

參考文獻(xiàn)[14]的方法，取5 mg待測(cè)樣品溶于3 mL蒸餾水中，分成2 等份，其中一份加入1.5 mL蒸餾水，另一份加入1.5 mL 0.4 mol/L NaOH溶液，測(cè)反應(yīng)開始和結(jié)束（2.0 h）時(shí)的紫外光譜。

1.3.7 山藥黏液質(zhì)及其酶解物掃描電子顯微鏡圖譜

用導(dǎo)電膠帶將山藥黏液質(zhì)及其凍干粉末固定在樣品臺(tái)上，用JFC-1600型離子濺射儀在高真空鍍膜機(jī)內(nèi)給樣品表面濺射噴金，用JSM-5610LV掃描電子顯微鏡觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)并照相。

1.3.8 山藥黏液質(zhì)及其酶解物對(duì)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

參考文獻(xiàn)[15]方法稍有改動(dòng)，將無(wú)菌獲得的活的脾臟淋巴細(xì)胞濃度，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL，加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，加入10 μg/mL的ConA溶液20 μL，設(shè)置空白對(duì)照組（在細(xì)胞培養(yǎng)液里只加ConA）和實(shí)驗(yàn)組（分別加入不同體積的山藥黏液質(zhì)及其酶解物，使其濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求），在37 ℃、5% CO2條件下在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT）法，用酶標(biāo)儀測(cè)其在570 nm波長(zhǎng)處的吸光度，每組設(shè)置6 個(gè)重復(fù)孔。

1.3.9 山藥黏液質(zhì)及其酶解物對(duì)T淋巴細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響

選取1.3.7節(jié)中效果最好的組分，向淋巴細(xì)胞中加入l mLRNAiso Plus，按試劑盒說(shuō)明書提取脾臟淋巴細(xì)胞中的總RNA，然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒說(shuō)明書操作）；再通過(guò)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法，定量檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量（按照SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作）。實(shí)驗(yàn)所需引物，由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)合成，其引物序列見表1。

表1 細(xì)胞因子引物序列Table 1 Primer sequences for cytokines

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以±s表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥黏液質(zhì)的基本組成

山藥黏液質(zhì)中總糖含量占40.87%，蛋白質(zhì)含量約占56.93%。氨基酸組成如表2所示，其中谷氨酸、亮氨酸和天冬氨酸含量較高；檢測(cè)到7 種人體必需氨基酸，含量占總氨基酸含量的39.543%。鐵棍山藥黏液中檢測(cè)到9 種單糖（表3），其中氨基葡萄糖和甘露糖含量較高，占總糖含量的66.422%。這一檢測(cè)結(jié)果與之前報(bào)道的結(jié)果不同，Koocheki等[16]研究山藥（Nagaimo）的黏液質(zhì)發(fā)現(xiàn)，其單糖主要由甘露糖、果糖、半乳糖、木糖、葡萄糖組成；Huang等[17]報(bào)道山藥黏液中主要含有半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和鼠李糖等中性糖；而丁青芝等[18]報(bào)道，山藥黏液質(zhì)中含有L-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖，其中D-葡萄糖含量最高。這可能是不同來(lái)源的山藥黏液質(zhì)中單糖含量和種類有很大區(qū)別。

表2 鐵棍山藥黏液質(zhì)的氨基酸含量Table 2 Contents of amino acids in mucilage from “Tieegguunn” yam tubers

表3 鐵棍山藥黏液質(zhì)單糖組成Table 3 Contents of monosaccharides in mucilage from “Tieegguunn” yam tubers

2.2 山藥黏液質(zhì)及其酶解液的電泳圖譜

圖1 鐵棍山藥黏液質(zhì)及其酶解物的電泳圖譜Fig. 1 SDS-PAGE profi le of mucilage from “Tieegguunn” yam tubeerrss and its hydrolysates

由圖1可知，山藥黏液質(zhì)經(jīng)不同的酶酶解以后，電泳圖譜發(fā)生明顯的變化。在上樣量相同的條件下，酶解以后的黏液質(zhì)顯現(xiàn)的 條帶明顯變細(xì)，其中復(fù)合蛋白酶酶解物所顯現(xiàn)的條帶最細(xì)，其次是胰蛋白酶酶解物，再次是纖維素酶酶解物，這表明3 種酶均對(duì)黏液質(zhì)發(fā)生了部分酶解；而3 種酶解物電泳譜帶與黏液質(zhì)比較，也發(fā)生了變化，這可能與所選取的酶的不同酶解程度有關(guān)，復(fù)合蛋白酶是由幾種蛋白酶組成，酶切位點(diǎn)較多，水解度最高，因此黏液質(zhì)被復(fù)合蛋白酶酶解后，酶解物的電泳圖譜上呈現(xiàn)較多譜帶；而胰蛋白酶酶切位點(diǎn)是在賴氨酸和精氨酸的前面，相對(duì)酶切位點(diǎn)較少，水解度較復(fù)合蛋白酶的低，黏液質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶酶切以后，在電泳圖譜上呈現(xiàn) 的條帶雖然多于黏液質(zhì)，但卻少于復(fù)合蛋白酶酶解物；纖維素酶酶解物的電泳譜帶，最接近于黏液質(zhì)的譜帶，這可能與纖維素酶只水解β-(1,4)糖苷鍵連接的葡萄糖殘基[19]，因此在蛋白染色的電泳圖譜上，看不到譜帶的明顯變化。

2.3 山藥黏液質(zhì)及其酶解物的紫外掃描圖譜

圖2 鐵棍山藥黏液質(zhì)及其酶解物的紫外光譜Fig. 2 Ultraviolet absorption spectra of mucilage from “Tiegun”egun yam yam tubersubers and its hydrolysates

由圖2的紫外光譜分析發(fā)現(xiàn)，在β消除反應(yīng)之前，山藥黏液質(zhì)、胰蛋白酶酶解物、纖維素酶酶解物和復(fù)合蛋白酶酶解物在波長(zhǎng)280 nm左 右均有一明顯的吸收峰，這是蛋白質(zhì)的紫外吸收峰；當(dāng)β消除反應(yīng)之后，4 種物質(zhì)在240 nm波長(zhǎng)處均出現(xiàn)了明顯的吸收峰，說(shuō)明4 種物質(zhì)中均含有O-連接的糖苷鍵，這一結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)所用的3 種酶對(duì)O-糖苷鍵并未起到破壞作用。

2.4 山藥黏液質(zhì)及其酶解物的紅外光譜分析

圖3 山藥黏液質(zhì)及其酶解物的紅外譜Fig. 3 IR spetra of mucilage from “Tieegguunn” yam tubeerrss and its hydrolysates

3 500～3 100 cm－1范圍內(nèi)是伯酰胺以及締合—OH的吸收峰，此峰較寬，也被認(rèn)為是糖類的特征峰[20]，由圖3可知，復(fù)合酶、纖維素酶、胰酶酶解產(chǎn)物在此處的吸收峰位于3 404 cm－1處，而黏液質(zhì)的位于3 275 cm－1處，這可能是由于酶解后氫鍵打開，締合—OH能力減弱造成的；2 958 cm－1處為—CH吸收峰，為伸縮振動(dòng)；1 643 cm－1處為乙酰氨基中C=O的吸收峰，振動(dòng)方式為伸縮振動(dòng)，且蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)為α-螺旋結(jié)構(gòu)；1 543 cm－1為—NH2吸收峰，振動(dòng)方式為變角振動(dòng)，這兩個(gè)峰被認(rèn)為是蛋白的特征吸收峰，1 400 cm－1為—CH面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收峰，主要是蛋白分子肽鍵的特征吸收峰[21]，復(fù)合蛋白酶酶解物中，1 543 cm－1為—NH2吸收峰明顯發(fā)生變化，表明復(fù)合酶作用后黏液質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化；1 240 cm－1是S=O伸縮振動(dòng)特征峰；1 068 cm－1為C—O—C伸縮振動(dòng)吸收峰，是多糖的特征吸收峰，且為吡喃糖環(huán)中的醚鍵和羥基的吸收峰，有報(bào)道認(rèn)為1 068 cm－1處是β-(1,4)糖苷鍵產(chǎn)生的吸收峰[22]，纖維素酶酶解物中，1 068 cm－1為C—O—C伸縮振動(dòng)吸收峰的峰型與其他3 種物質(zhì)明顯不同，而纖維素酶的作用位點(diǎn)正是β-(1,4)糖苷鍵，因此驗(yàn)證了這一說(shuō)法。

2.5 山藥黏液質(zhì)及其酶解物的掃描電子顯微鏡圖譜

圖4 山藥黏液質(zhì)及其酶解物的掃描電子顯微鏡圖譜（×1 000）Fig. 4 Scanning electron microscopic (SEM) images of mucilage from“Tieegguunn” yam tubers

由圖4可知，在掃描電子顯微鏡下，山藥黏液質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)相互聯(lián)通的網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)，孔的形狀不規(guī)則但清晰可見，多數(shù)孔徑大于10 μm；經(jīng)胰蛋白酶、纖維素酶、復(fù)合蛋白酶處理后，得到的酶解物與黏液質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)相比均發(fā)生明顯改變。黏液質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解后，形成了較 小的顆粒狀物質(zhì)，直徑均小于10 μm，聚集在孔徑周圍，使孔徑變得模糊不清。而黏液質(zhì)經(jīng)纖維素酶酶解后，形成了碎片狀物質(zhì)，碎片有大有小，但已經(jīng)看不到孔狀結(jié)構(gòu)。有人用不同的酶酶解膠原蛋白，觀察其微觀結(jié)構(gòu)也發(fā)生了很大變化，這種變化與酶的種類和水解程度有關(guān)[23]；Jin Wengang等[24]認(rèn)為用蛋白酶酶解蛋白質(zhì)，一方面可以降低蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，增加蛋白質(zhì)的親水性（通過(guò)帶電基團(tuán)的介入）；另一方面可以使蛋白質(zhì)的非極性基團(tuán)暴露，蛋白的疏水性增強(qiáng)，形成凝聚狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)山藥黏液質(zhì)用胰蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解后，觀察到的微觀結(jié)構(gòu)符合這一說(shuō)法，但用纖維素酶酶解后的酶解產(chǎn)物微觀結(jié)構(gòu)與蛋白酶酶解物的微觀結(jié)構(gòu)相差很大，其原因還有待進(jìn)一步研究。

2.6 山藥黏液質(zhì)及其酶解物對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

圖5 山藥黏液質(zhì)及其酶解物對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響（ =6）Fig. 5 Effects of mucilage from “Tiegun” yam tubers and its hydrolysates on lymphocyte transformat ion (n = 6)

由圖5可知，山藥黏液質(zhì)及其酶解物在一定劑量范圍內(nèi)能顯著提高脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力，但不同組分之間的影響存在一定差異。當(dāng)加入各組分的質(zhì)量濃度為5 μg/mL時(shí)，與空白對(duì)照組相比，均未出現(xiàn)顯著性差異；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到25 μg/mL時(shí)，除黏液質(zhì)組與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異外，其他3 組均呈現(xiàn)顯著促進(jìn)作用；當(dāng)質(zhì)量濃度在50 μg/ mL時(shí)，4 個(gè)組分對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化均呈現(xiàn)顯著的促進(jìn)作用；在質(zhì)量濃度為75 μg/mL時(shí)，各組分促脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力達(dá)到最大值；隨著質(zhì)量濃度的進(jìn)一步增加，各組分對(duì)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力也呈下降趨勢(shì)；表明各組分對(duì)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的促進(jìn)作用表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系?？傮w上看，4 個(gè)組分中，山藥黏液質(zhì)促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力最弱，其他3 種酶解物促進(jìn)淋 巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力顯著強(qiáng)于山藥黏液質(zhì)，其中復(fù)合蛋白酶酶解物的最強(qiáng)。Chalamaiah等[25]研究鯉魚卵蛋白的不同酶解物對(duì)淋巴細(xì)胞增殖作用，發(fā)現(xiàn)不同的酶解物均促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖作用，但增殖效果不同，而Agyei等[26]認(rèn)為不同酶解物對(duì)淋巴細(xì)胞增殖效果不同，是由于酶解后產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)不同造成的。

2.7 山藥黏液質(zhì)及其酶解物對(duì)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響

圖6 山藥黏液質(zhì)及其酶解物對(duì)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響Fig. 6 Effects of mucilage from “Tieegguunn” yam tubers and its hydrolysates on mRNA expression of cytokines

由圖6A可知，4 個(gè)組分對(duì)淋巴細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子（白細(xì)胞介素-2（interl eukin-2，IL-2）、IL-12和干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ））的mRNA表達(dá)均有促進(jìn)作用，但對(duì)每種細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量影響不同；由圖6B可知，4 個(gè)組分對(duì)淋巴細(xì)胞Th2型細(xì)胞因子（IL-4、IL-6和IL-10）的mRNA表達(dá)也均有促進(jìn)作用，但對(duì)每種細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量影響也不同；比較圖6A與圖6B發(fā)現(xiàn)，4 個(gè)組分對(duì)Th1型細(xì)胞因子（IL-2、IL-12和IFN-γ）的mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用要高于對(duì)Th2型細(xì)胞因子（IL-4、IL-6和IL-10）的mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用，這將會(huì)使脾淋巴細(xì)胞由Th0向Th1分化[27]。Priyankar等[28]研究山藥乙醇提取物對(duì)脾淋巴細(xì)胞因子的影響，發(fā)現(xiàn)山藥乙醇提取物能促進(jìn)Th1細(xì)胞因子mRNA表達(dá)，而抑制Th2細(xì)胞因子mRNA表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中，4 種物質(zhì)對(duì)Th2族細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)也有促進(jìn)作用，這可能是由于細(xì)胞的大量增殖分化引起的量上的增加。但由于4 種物質(zhì)對(duì)Th1族細(xì)胞因子的mRNA的表達(dá)促進(jìn)作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)Th2族細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用，表明4 種物質(zhì)均會(huì)使Th1/Th2平衡向Th1偏移。

3 結(jié) 論

山藥黏液質(zhì)中總糖含量占40.87%，蛋白質(zhì)含量約占56.93%。檢測(cè)到17 種氨基酸，其中谷氨酸、亮氨酸和天冬氨酸含量較高，必需氨基酸含量占總氨基酸含量的39.543%；鐵棍山藥黏液中含有7 種單糖，其中氨基葡萄糖和甘露糖含量較高，占總糖含量的66.422%。

選取不同的酶對(duì)山藥黏液質(zhì)進(jìn)行酶解，獲得3 種山藥黏液質(zhì)的酶解產(chǎn)物。通過(guò)電泳、紅外光譜、紫外光譜及電子顯微鏡掃描技術(shù)，對(duì)山藥黏液質(zhì)及其酶解物的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，結(jié)果表明山藥黏液質(zhì)及其不同酶解產(chǎn)物在微觀結(jié)構(gòu)上存在差別。

研究了山藥黏液質(zhì)及其酶解物的免疫活性，發(fā)現(xiàn)山藥黏液質(zhì)及其酶解物對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化均有促進(jìn)作用，其中山藥黏液質(zhì)促進(jìn)作用最弱，復(fù)合酶酶解物促進(jìn)作用最強(qiáng)；山藥黏液質(zhì)及其酶解產(chǎn)物均能促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子（IL-2、IL-12和IFN-γ）的mRNA表達(dá)和Th2型細(xì)胞因子（IL-4、IL-6和IL-10）的mRNA表達(dá)，但對(duì)Th1型細(xì)胞因子（IL-2、IL-12和IFN-γ）mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用要高于對(duì)Th2型細(xì)胞因子（IL-4、IL-6和IL-10）mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李敏. 山藥活性成分提取技術(shù)及藥理功能的研究進(jìn)展[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2013, 44(7): 1184-1189. DOI:10.3969/j:issn.2095-1191.2013.7.1184.

[2] YEH A I, CHAN T Y, GEORGE C C. Effect of water content and mucilage on physico-chemical characteristics of Yam (Discorea alata Purpurea) starch[J]. Journal of Food Engineering, 2009, 95(1): 106-114. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2009.04.014.

[3] 王陽(yáng), 霍秀文, 周翼虎, 等. 不同品種山藥塊莖多糖和黏液質(zhì)多糖對(duì)自由基清除能力的研究[J]. 遼寧大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 39(4): 354-360. DOI:10.3969/j.issn.1000-5846.2012.04.016.

[4] NAGAI T, NAGASHIMA T. Functional properties of dioscorin, a soluble viscous protein from Japanese Yam (Dioscorea opposita Thunb.) tuber mucilage Tororo[J]. Zeitschrift für Naturforschung C, 2006, 61(11/12): 792-798. DOI:10.1108/02634509810224428.

[5] 戴榕, 孔得信, 李宗羽, 等. 山藥黏蛋白的兩種提取工藝及其對(duì)食道癌細(xì)胞的抑制[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(13): 371-375. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.070.

[6] CHOI E M, KOO S J, HWANG J K. Immune cell stimulating activity of mucopolysaccharide isolated from Yam (Dioscorea batatas)[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2004, 91(1): 1-6. DOI:10.1016/ j.jep.2003.11.006.

[7] 朱運(yùn)平, 李大為, 李秀婷, 等. 雙酶法處理對(duì)淮山藥抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2015, 15(4): 110-115. DOI:10.16429/j.1009-7848.2015.04.015.

[8] ZHANG Y, LIU W T, LI G Y, et al. Isolation and partial characterization of pepsin-soluble collagen from the skin of grass carp(Ctenopharyngodon idella)[J]. Food Chemistry, 2007, 103(3): 906-912. DOI:10.1016/j.foodchem.2006.09.053.

[9] ZHU K X, ZHOU H M. Purification and characterization of a novel glycoprotein from wheat germ water-soluble extracts[J]. Process Biochemistry, 2005, 40(3/4): 1469-1474. DOI:10.1016/ j.procbio.2004.06.030.

[10] 李偉, 于新瑩, 佟長(zhǎng)青, 等. 大鯢黏液酶解產(chǎn)物的制備及其抗疲勞作用研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2011, 32(6): 146-151. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2011.06.023.

[11] 張嬌嬌, 許學(xué)勤. 復(fù)合酶解降低山藥黏液質(zhì)黏度的工藝[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2014, 40(1): 96-100. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ ts.2014.01.016.

[12] 趙謀明, 肖如武, 崔春, 等. 超濾對(duì)馬氏珍珠貝肉蛋白酶解液特性的影響牢[J]. 華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2009, 37(10): 124-128. DOI:10.3321/j.issn:1000-565X.2009.10.024.

[13] 任國(guó)艷, 梁旺春, 詹永獻(xiàn), 等. 海蜇頭糖蛋白分離純化及免疫活性研究[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(17): 147-151.

[14] MAGALHAES A, MAGALHAES H P B, RICHARDSON M, et al. Purifi cation and properties of a coagulant thrombin-like enzyme from the venom of Bothrops leucurus[J]. Comparative Biochemistry and Physiology, 2007, 146(4): 565-575. DOI:10.1016/j.cbpa.2005.12.033.

[15] 任國(guó)艷, 劉志龍, 郭金英, 等. 海蜇糖蛋白及其糖肽的體外免疫活性[J].食品科學(xué), 2013, 34(17): 250-255. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201317053.

[16] KOOCHEKI A, MORTAZAVI S A, SHAHIDI F, et al. Rheological properties of mucilage extracted from Alyssum homolocarpum seed as a new source of thickening agent[J]. Journal of Food Engineering, 2009, 91(3): 490-496. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2008.09.028.

[17] HUANG C C, LAI P, CHEN I H, et al. Effects of mucilage on the thermal and pasting properties of yam, taro, and sweet potato starches[J]. LWT-Food Science and Technology, 2010, 43(6): 849-855. DOI:10.1016/j.lwt.2009.11.009.

[18] 丁青芝, 馬海樂(lè), 駱琳, 等. 山藥糖蛋白的分離純化與鑒定[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(7): 217-221. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2008.07.045.

[19] AL-GHAZZEWI F H, TESTER R F. Efficacy of cellulase and mannanase hydrolysates of konjac glucomannan to promote the growth of lactic acid bacteria[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2012, 92(11): 2394-2396. DOI:10.1002/jsfa.5678.

[20] CHEN C, YOU L J, ABBASI A M, et al. Optimization for ultrasound extraction of polysaccharides from mulberry fruits with antioxidant and hyperglycemic activity in vitro[J]. Carbohydrate Polymers, 2015, 130: 122-132. DOI:10.1016/j.carbpol.2015.05.003.

[21] LUIS ARIAS-MOSCOSO J, MALDONADO-ARCE A, ROUZAUDSANDEZ O, et al. Physicochemical characterization of protein hydrolysates produced by autolysis of Jumbo Squid (Dosidicus gigas) byproducts[J]. Food Biophysics, 2015, 10(2): 145-154. DOI:10.1007/ s11483-014-9374-z.

[22] PINTO M, COELHO E, NUNES A, et al. Valuation of brewers spent yeast polysaccharides: a structural characterization approach[J]. Carbohydrate Polymers, 2015, 116: 15-22. DOI:10.1016/ j.carbpol.2014.03.010.

[23] CHI C F, CAO Z H, WANG B, et al. Antioxidant and functional properties of collagen hydrolysates from Spanish Mackerel skin as Infl uenced by average molecular weight[J]. Molecules, 2014, 19(8): 11211-11230. DOI:10.3390/molecules190811211.

[24] JIN W G, WU H T, ZHU B W, et al. Functional properties of gelationlike protein hydrolysates from scallop (Patinopecten yessoensis) male gonad[J]. European Food Research and Technology, 2012, 234(5): 863-872. DOI:10.1007/s00217-012-1700-4.

[25] CHALAMAIAH M, HEMALATHA R, JYOTHIRMAYI T, et al. Chemical composition and immunomodulatory effects of enzymatic protein hydrolysates from common carp (Cyprinus carpio) egg[J]. Nutrition, 2015, 31(2): 388-398. DOI:10.1016/j.nut.2014.08.006.

[26] AGYEI D, DANQUAH M K. Rethinking food-derived bioactive peptides for antimicrobial and immunomodulatory activities[J]. Trends in Food Science & Technology, 2012, 23(2): 62-69. DOI:10.1016/ j.tifs.2011.08.010.

[27] GAUTAM M, SAHA S, BANI S, et al. Immunomodulatory activity of Asparagus racemosus on systemic Th1/Th2 immunity: implications for immunoadjuvant potential[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2009, 121(2): 241-247. DOI:10.1016/j.jep.2008.10.028.

[28] PRIYANKAR D, TAPAS K C. In vitro modulation of Th1 and Th2 cytokine expression by edible tuber of Dioscorea alata and study of correlation patterns of the cytokine expression[J]. Food Science and Human Wellness, 2014, 3(1): 1-8. DOI:10.1016/j.fshw.2014.01.001.

Microstructure and Immunomodulating Activity of Mucilage from “Tiegun” Yam Tubers (Dioscorea opposita Thunb. cv. Tsukune) and Its Hydrolysates

REN Guoyan, WU Tingting, ZHANG Fan, GUO Jinying, CUI Guoting, WU Ying, WA NG Ping, CAO Li
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

Mucilage was extracted from “Tiegun” yam tubers (Dioscorea opposita T hunb. cv. Tsukune), and its hydrolysates were obtained by hydrolysis with different enzymes (trypsin, cellulase and complex protease). The microstructure of mucilage and its hydrolysates were detected by infrared spectroscopy and scanning electron microscopy. Meanwhile, their effects on the pr oliferati on of spleen lymphocytes and the relative expression levels of cytokine mRNA were explored by cel l culture in vitro and quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) methods, respectively. The results showed that mucil age and its hydrolysates were different in microstructure. Mucilage and its hydrolysates could promote the proliferation and transformation of spleen lymphocytes, but the promoting effect of mucilage was weaker than that of its hydrolysates. Promoting effects of mucilage and its hydrolysates on the mRNA expression of Th1 cytokines were signifi cantly higher than that of Th2 cytokines. These results showed that yam mucilage and its hydrolysates had potential function to shift the Th1/Th2 balance to relative Th1 dominance.

yam mucilage; hydrolysates; lymphocyte transformation; cytokine; mRNA expression

10.7506/spkx1002- 6630-201611011

TS201.4

A

1002-6630（2016）11-0058-07

任國(guó)艷, 吳婷婷, 張凡, 等. 山藥黏液質(zhì)及其酶解物的微觀結(jié)構(gòu)及免疫活性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 58-64.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611011. http://www.spkx.net.cn REN Guoyan, WU Tingting, ZHANG Fan, et al. Microstructure and immun omodula ting activity of mucilage from “Tiegun”yam tubers (Dioscorea opposita Thunb. cv. Tsukune) and its hydrolysates[J]. Food Science, 2016, 37(11): 58-64. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611011. http://www.spkx.net.cn

2015-08-31

河南科技大學(xué)研究培育基金項(xiàng)目（400913480019）

任國(guó)艷（1976—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)及功能制品。E-mail：renguoyan@163.com