李心利，朱玉紅，汪保衛(wèi)，付晶，王智文，陳濤

（天津大學(xué)化工學(xué)院，系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072）

一體化生物加工過程生產(chǎn)乙醇的研究進(jìn)展

李心利，朱玉紅，汪保衛(wèi)，付晶，王智文，陳濤

（天津大學(xué)化工學(xué)院，系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072）

一體化生物加工過程（consolidated bioprocessing，CBP）指通過對理想底盤微生物的開發(fā)和利用來實(shí)現(xiàn)一步轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素為生物產(chǎn)品的生物加工程序。本文回顧了一體化生物加工過程的研究背景，簡述了其開發(fā)理念和技術(shù)路線，全面綜述了近年來該技術(shù)在轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素生產(chǎn)二代生物乙醇研究中的不同策略及最新的研究進(jìn)展。分析了CBP系統(tǒng)中自然菌株、重組菌株和共培養(yǎng)菌株在轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇時(shí)的優(yōu)點(diǎn)和瓶頸因素。研究了基因工程、代謝工程等工程手段和技術(shù)在克服此技術(shù)中的阻礙性因素及提升乙醇得率等方面的應(yīng)用價(jià)值和潛力。最后，論述了組學(xué)及合成生物學(xué)等新興生物技術(shù)對CBP生物乙醇的貢獻(xiàn)和二代生物乙醇的商業(yè)化發(fā)展現(xiàn)狀及CBP乙醇未來所面臨的機(jī)遇與挑戰(zhàn)。

一體化生物加工過程；木質(zhì)纖維素；生物乙醇；發(fā)酵；生物技術(shù)

乙醇（酒精），作為國防、醫(yī)療、有機(jī)合成、食品等行業(yè)中的重要原料，主要通過化學(xué)法和生物發(fā)酵法兩種途徑合成，其中生物發(fā)酵法又經(jīng)歷一代糧食乙醇、二代非糧食乙醇即木質(zhì)纖維素基生物乙醇。在化石能源、糧食危機(jī)日益嚴(yán)重和可利用耕地逐年下降的今天，使得化學(xué)合成和一代生物法制備乙醇都受到了不同程度的約束而被逐漸放棄。因此，開發(fā)二代基于木質(zhì)纖維素的生物乙醇就受到了越來越多的關(guān)注［1］。木質(zhì)纖維素是一種能源密度小，成分多樣化，結(jié)構(gòu)復(fù)雜的固態(tài)、髙聚、天然可再生的清潔能源物質(zhì)，主要由纖維素（35%～37%）、半纖維（23%～25%）和木質(zhì)素（18%～22%）等構(gòu)成［2］。傳統(tǒng)生物法制備木質(zhì)纖維素基生物乙醇時(shí)，木質(zhì)纖維素首先要經(jīng)過復(fù)雜的預(yù)處理程序，如化學(xué)法和物理法等，來破壞其復(fù)雜的物理結(jié)構(gòu)，隨后預(yù)處理過的木質(zhì)纖維素進(jìn)一步被各種水解酶糖化為可被微生物代謝的單糖物質(zhì)而進(jìn)行乙醇發(fā)酵［3］。因此傳統(tǒng)木質(zhì)纖維素乙醇發(fā)酵程序主要分為：①木質(zhì)纖維素的預(yù)處理；②預(yù)處理物質(zhì)的酶水解（糖化）；③乙醇的發(fā)酵；④產(chǎn)品的分離純化［4］。同時(shí)這些復(fù)雜的加工過程還可以被整合到一系列不同的發(fā)酵程序之中，如分步糖化發(fā)酵（separate hydrolysis and fermentation，SHF）、同步糖化發(fā)酵（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）、同步糖化共發(fā)酵（simultaneous saccharification and co-fermentation，SSCF）等。以上技術(shù)方法的應(yīng)用雖然在不同程度上克服了生物乙醇發(fā)酵時(shí)存在的障礙，但是考慮到其復(fù)雜的加工程序及對昂貴水解酶的依賴性等問題而使其在工業(yè)實(shí)際應(yīng)用方面并不占據(jù)優(yōu)勢［4-5］。為了解決傳統(tǒng)生物乙醇發(fā)酵工藝存在的問題，近年來人們在木質(zhì)纖維素的利用方面進(jìn)行了大量的探索性研究；同時(shí)隨著系統(tǒng)生物學(xué)和代謝工程等學(xué)科的發(fā)展以及合成生物學(xué)和 “組學(xué)”等新興生物技術(shù)的應(yīng)用，人們對微生物細(xì)胞的遺傳背景和代謝網(wǎng)絡(luò)有了更加深入的研究和更加精細(xì)的調(diào)控；在此基礎(chǔ)上研究者提出了一種新穎的木質(zhì)纖維素發(fā)酵技術(shù)——一體化生物加工過程（consolidated bioprocessing，CBP），并取得了豐碩的成果；從而為未來可再生生物能源的利用及大宗生物產(chǎn)品的生產(chǎn)提供了優(yōu)選的機(jī)制［6］。

本文從CBP的原理和技術(shù)理念出發(fā)，系統(tǒng)闡述了自然菌株、重組菌株及共培養(yǎng)菌株在不同CBP策略下生產(chǎn)生物乙醇的研究進(jìn)展，探討了系統(tǒng)代謝工程、基因組學(xué)乃至合成生物學(xué)等新興技術(shù)對CBP生物乙醇菌株構(gòu)建的影響及對CBP木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇的貢獻(xiàn)，簡析了CBP生物乙醇發(fā)酵所面臨的主要問題和挑戰(zhàn)及其商業(yè)化現(xiàn)狀，展望了CBP木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇的未來。

1　CBP的原理及CBP系統(tǒng)微生物

一體化生物加工過程指通過對理想底盤微生物的開發(fā)，使其具有一步代謝木質(zhì)纖維素的能力，致使傳統(tǒng)木質(zhì)纖維素發(fā)酵過程中水解酶的生成、底物的糖化與發(fā)酵、乙醇的生產(chǎn)程序被封閉整合到由單一或者微生物菌群來完成的一步生物加工過程之中（如圖1所示）。此生物反應(yīng)器系統(tǒng)簡化了傳統(tǒng)發(fā)酵工藝的復(fù)雜性，降低了工業(yè)發(fā)酵成本，極大地提升了底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)品得率［7］。

圖1　CBP系統(tǒng)的理想架構(gòu)和反應(yīng)機(jī)制［12］

自CBP概念被提出至今，“魯棒性”底盤微生物的開發(fā)一直是CBP系統(tǒng)成敗的關(guān)鍵。理想的CBP微生物必須具有以下能力：①能夠合成和分泌復(fù)雜的高活性水解酶；②能夠代謝己糖、戊糖等多種糖底物；③能夠高轉(zhuǎn)化率和高產(chǎn)量；④高耐受性［8］。生物燃料研究的先驅(qū)者LYND等提出CBP微生物有兩種合適的來源即自然（native）或重組（recombinant）［6，9］。這些自然菌株或重組菌株主要包括細(xì)菌類，如嗜熱厭氧菌屬（Thermoanaerobacterium sp.）、梭菌屬（Clostridium）、埃希氏菌屬（Escherichia）、端胞菌屬（Terminosporus）、芽胞桿菌屬（Bacillus）等；真菌類，如青霉屬（Penicillium）、木霉屬（Trichoderma）、脈胞菌屬（Neurospora）、根霉屬（Rhizopus）及白腐真菌（White rot basidiomycetes）和酵母菌屬中的釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）等；部分放線菌類（Actinobacillus）及其他稀有菌類如白蟻腸道菌等。雖然這些微生物在代謝木質(zhì)纖維素類底物方面均具有各自的代謝優(yōu)勢，但是其代謝能力和產(chǎn)品的發(fā)酵能力卻有很大的差距。近年來，隨著各種新興生物技術(shù)和高通量技術(shù)被應(yīng)用于CBP微生物及新型水解酶的開發(fā)研究之中，越來越多的理想CBP系統(tǒng)微生物被開發(fā)，同時(shí)在模擬微生物代謝機(jī)理及利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物基產(chǎn)品等方面都有較好的成果［10］。本文作者課題組基于CBP理念，同時(shí)結(jié)合合成生物學(xué)方法等篩選了不同來源的半纖維素水解酶并進(jìn)行了組合優(yōu)化，構(gòu)建一株能夠快速代謝木聚糖的大腸桿菌（Escherichia coil）工程菌株；并進(jìn)一步通過基因工程手段優(yōu)化了水解酶的表達(dá)分泌水平，提高了半纖維素的水解能力；最終實(shí)現(xiàn)了利用大腸桿菌一步轉(zhuǎn)化半纖維素為琥珀酸的一體化生物加工過程，證實(shí)了通過CBP進(jìn)行半纖維素到琥珀酸轉(zhuǎn)化的可行性，為其進(jìn)一步改良以及利用木質(zhì)纖維素向其他化學(xué)品的轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)［11］。

2　CBP木質(zhì)纖維素基乙醇策略

依據(jù)對微生物生理功能的系統(tǒng)解析與代謝調(diào)控機(jī)理機(jī)制的研究，開發(fā)CBP木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇的策略主要有：①自然菌株策略；②工程菌株策略；③共培養(yǎng)策略。同時(shí)此三類CBP策略中的微生物不但具有合成和分泌高活力、復(fù)雜水解酶系的能力（http：//www.cazy.org/）而且能夠?qū)崿F(xiàn)同步糖化［如圖2（a）和圖2（b）所示］與代謝木質(zhì)纖維素和生物乙醇的生產(chǎn)［4］。

圖2　纖維素及半纖維素

2.1自然菌株策略

自然菌株在CBP生物乙醇生產(chǎn)中的優(yōu)勢是其天然就具備良好的水解木質(zhì)纖維素材料的能力。盡管如此，這類菌株依然存在由木質(zhì)纖維素向生物乙醇轉(zhuǎn)化的瓶頸。例如，大部分自然菌株并不能將木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)生的單糖充分地轉(zhuǎn)化為生物乙醇，同時(shí)由于絕大多數(shù)菌株受到基因編輯技術(shù)匱乏的限制，而無法對其進(jìn)行有效的代謝改造，就使得菌株在耐受性、水解酶的活力、產(chǎn)品的得率等方面的不足而成為了其推廣的限制性因素。因此，目前利用自然策略進(jìn)行CBP乙醇生產(chǎn)的主要挑戰(zhàn)在于快速有效地開發(fā)不同自然菌株的基因操作技術(shù)，而菌株代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與發(fā)酵機(jī)理研究則是后續(xù)研究方向。

2.1.1細(xì)菌生物乙醇發(fā)酵

在野生型細(xì)菌中，只有部分菌株能夠代謝木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇、丁醇等生物產(chǎn)品，而且主要集中于天然纖維素水解菌株中的耐熱厭氧菌屬、梭菌屬等。如模式菌株熱纖梭菌（Clostridium thermocellum）能夠合成和分泌20種高活性纖維素水解酶且具有寬泛的糖代謝范疇而被直接用于生物乙醇發(fā)酵研究中。同時(shí)在共培養(yǎng)和工程菌株改造方面梭菌屬也受到了同樣到了廣泛的關(guān)注（如表1所示）［14-15］。KUMAGAI等［14］利用自然型的熱纖梭菌（C. thermocellum）在厭氧條件下分別發(fā)酵預(yù)處理后的日本扁柏（Hinoki cypress）和桉樹（Eucalyptus）硬木時(shí)，CBP法生產(chǎn)生物乙醇的得率分別達(dá)到了79.4mg/g和73.1mg/g底物。同時(shí)近年來隨著研究的深入，越來越多的自然型木質(zhì)纖維素水解菌株被發(fā)現(xiàn)并被應(yīng)用于乙醇、丁醇、生物氫等產(chǎn)品的生產(chǎn)研究中且取得了一定的進(jìn)展。例如，SIGURBJORNSDOTTIR等［29］在冰島溫泉中成功的分離出了一株能夠代謝纖維素等底物同時(shí)能夠生產(chǎn)乙醇、生物氫的嗜熱厭氧桿菌屬菌株（Thermoanaerobacterium AK54），發(fā)酵利用預(yù)處理的纖維素生產(chǎn)乙醇和氫時(shí)其產(chǎn)量分別達(dá)到了1.13g/L和0.11g/L。

表1　不同CBP生物乙醇發(fā)酵策略及系統(tǒng)微生物

2.1.2絲狀真菌生物乙醇發(fā)酵

自然真菌發(fā)酵纖維素轉(zhuǎn)化生物乙醇的研究中，研究者的目光首先主要聚焦于絲狀真菌，如木霉菌（Trichoderma）、脈孢霉（Neurospora）、鐮孢屬（Fusarium）等，此類真菌不但具有水解纖維素及幾丁質(zhì)（Chitin）等物質(zhì)的能力，而且對很多的抑制劑如羧酸、醛等也有很好的耐受性，同時(shí)在構(gòu)建各種纖維素代謝基因工程菌株研究中，此類菌株的多種纖維素水解酶基因常常被看作是最合適的候選基因［4，30］。因此利用絲狀真菌生產(chǎn)生物乙醇為擴(kuò)充CBP系統(tǒng)的可用底物和微生物種類都提供了更多可選因素。INOKUMA等［16］首次通過分離篩選到一株可以代謝N-乙酰葡糖胺（N-GlcNAc）以及幾丁質(zhì)的自然型卷枝毛霉菌（Mucor circinelloides），利用此菌株在厭氧條件下經(jīng)過72h的發(fā)酵發(fā)現(xiàn)其可以代謝50g/L的N-乙酰葡糖胺生產(chǎn)18.6g/L乙醇，其產(chǎn)率達(dá)到了0.75g/L/h。同樣值得注意的是，其他種類的絲狀真菌在CBP發(fā)酵中也有很好的應(yīng)用價(jià)值。例如絲狀真菌中的米曲霉菌（Aspergillus oryzae）在傳統(tǒng)的日本生物基化學(xué)品發(fā)酵工廠及如今的CBP乙醇研究中均得到很好的開發(fā)和利用［31-32］。

2.1.3白腐菌生物乙醇發(fā)酵

白腐類真菌不但能夠合成和分泌多種木質(zhì)纖維素降解酶，如纖維素酶、過氧化物酶和漆酶等，而且具有與乙醇代謝強(qiáng)相關(guān)的酶系和降解木質(zhì)素的能力，因此利用此類真菌通過CBP加工木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇同樣具有巨大的潛在優(yōu)勢［33］。但是一些研究發(fā)現(xiàn)，白腐類真菌中僅有很少的一部分能夠直接代謝己糖物質(zhì)生產(chǎn)生物乙醇，如黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）、灰質(zhì)隔孢伏革菌（Peniophora cinerea）［34］。HORISAWA等［17］從土壤中分離篩選到一株可以有效的代謝戊糖和己糖的裂褶菌NBRC4928（Schizphylhls commne），通過CBP發(fā)酵工藝在厭氧條件下利用此菌株分別代謝微晶纖維素（MCC）、木聚糖（xylan）以及阿拉伯半乳聚糖（arabinogalactan）底物來生產(chǎn)生物乙醇，產(chǎn)品的得率分別達(dá)到了0.26g/g微晶纖維素、0.0419g/g-木聚糖和0.0508g/g阿拉伯半乳聚糖。OKAMOTO課題組［18］同樣利用白腐類真菌如變色栓菌（Trametes versicolor）、香栓菌（Trametes suaveolens）等進(jìn)行CBP系統(tǒng)發(fā)酵生物乙醇，也同樣取得了很好的研究結(jié)果（如表1所示）。更加值得關(guān)注的是此類真菌在耐受性方面也有很好的表現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)部分白腐真菌在乙醇的耐受性方面相比于乙醇發(fā)酵的工程菌株同樣具有巨大的優(yōu)勢；如毛柄金錢菌（Flammulina velutipes）對乙醇的耐受度最高可以達(dá)120g/L［35］。未來隨著基因工程、代謝工程及合成生物學(xué)的應(yīng)用和發(fā)展，白腐真菌在未來的CBP生物乙醇生產(chǎn)中必將受到更多的關(guān)注和應(yīng)用。

2.1.4酵母菌生物乙醇發(fā)酵

利用酵母屬真菌代謝纖維素生產(chǎn)乙醇時(shí)，由于常用的模式酵母菌株如樹干畢赤酵母菌（pichia stipitis）、釀酒酵母菌（S. cerevisiae）等均不具有水解纖維素的能力。工程菌株雖然能夠水解纖維素但是也存在著菌株代謝溫度和水解酶催化溫度之間的差異［36］。因此，近年來研究者不斷尋找既能水解纖維素又不受溫度限制的天然酵母菌株，且取得了一些研究成果。HU等［19］通過分離篩選得到一株具有高菊粉（inulin）酶活性并且可以耐高溫的天然酵母屬菌株馬克斯克魯維酵母（kluyveromyces marxianus PT-1），在200g/L的菊粉底物濃度，40℃條件下高溫厭氧發(fā)酵，在48h內(nèi)積累乙醇73.6g/L，達(dá)最大理論得率的90%。除此之外，具有相同木質(zhì)纖維素代謝潛力的酵母菌株如嗜寒酵母屬（Cryophilic yeast Mrakia spp），葡萄牙棒孢酵母（Clavispora）等也有被陸續(xù)報(bào)道于CBP應(yīng)用（如表1所示）［37］。

2.2重組菌株策略

木質(zhì)纖維素乙醇發(fā)酵不但可以利用天然的木質(zhì)纖維素水解菌株，而且還可以通過工程菌株來實(shí)現(xiàn)此目的。天然菌株的優(yōu)勢是其具有強(qiáng)大的水解酶生產(chǎn)能力，但是在乙醇的耐受性、產(chǎn)物得率等方面存在著不足；而工程菌株，雖然可以克服前者的不足，但是異源水解酶的引進(jìn)和表達(dá)同樣是一個(gè)巨大的障礙［38］。因此，如何構(gòu)建理想的CBP纖維素發(fā)酵工程菌株就成為了研究的重點(diǎn)?；贑BP理念，工程菌株的構(gòu)建主要包括兩個(gè)方向：一是改造天然能夠水解纖維素的微生物提高其乙醇發(fā)酵能力，二是改造天然高產(chǎn)乙醇的微生物，賦予其能夠有效代謝木質(zhì)纖維素的能力。

2.2.1改造天然纖維素水解菌株用于CBP乙醇

（1）強(qiáng)化對產(chǎn)物及抑制劑的耐受性來提升乙醇產(chǎn)量。通常在發(fā)酵木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇過程中會產(chǎn)生的大量的抑制劑，如醛、酸、酚等。研究表明這些物質(zhì)均會對菌體生長、水解酶酶活和水解效率等產(chǎn)生巨大的影響，因此通過提升菌株的“魯棒性”對提升乙醇的產(chǎn)量將有極好的促進(jìn)作用［39］。GEORGIEVA等［40］采用連續(xù)固定化反應(yīng)系統(tǒng)技術(shù)來研究高溫條件下CBP乙醇發(fā)酵時(shí)，發(fā)現(xiàn)在此技術(shù)中厭氧型嗜熱菌［Thermoanaerobacter mathranii（Δldh）］對乙酸和抑制劑的耐受度可以達(dá)到10g/L，極大地提升了菌株的抗逆性和對抑制劑的耐受性。同時(shí)使底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到了68%～76%，乙醇的得率達(dá)到了0.39～0.42g/g，其得率可以達(dá)到以單糖為碳源時(shí)的發(fā)酵得率。值得注意的是，菌株對乙醇的耐受性同樣是影響乙醇得率的關(guān)鍵因素，為此提升乙醇的耐受性同樣能夠極大地提升乙醇的產(chǎn)量。HUANG等［41］利用基因突變和基因組重排方法，使里氏木霉（Trichoderma reesei）對乙醇的耐受性提高到了4%（體積比），同時(shí)使乙醇的產(chǎn)量提升了5倍，達(dá)到了9.7g/L。BROWN等［42］在研究熱纖梭菌（C. thermocellum）的乙醇耐受機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，突變其乙醇脫氫酶（adhE*）后可以促使該菌株對乙醇的耐受度提高5～8倍，而達(dá)到50～80g/L，并且此菌株在后續(xù)的乙醇發(fā)酵試驗(yàn)中同樣取得了良好的實(shí)驗(yàn)效果。

（2）利用代謝工程手段提升乙醇的產(chǎn)量。在乙醇發(fā)酵時(shí)，乙酸、乳酸、琥珀酸等副產(chǎn)物生成都會競爭乙醇合成途徑的代謝流而降低乙醇的產(chǎn)量，因此可以采用敲除副產(chǎn)物生成的策略來提升乙醇產(chǎn)量和得率（如圖3所示）。ARGYROS等［24］通過代謝工程手段在熱纖梭菌（C. thermocellum）內(nèi)敲除乳酸代謝途徑基因（ldh）和乙酸生成途徑基因（Pta），導(dǎo)致乙醇生成選擇性比例相較于出菌株增加了40倍，而達(dá)到了40∶1（乙醇∶有機(jī)酸）。乙醇得率較野生株提升了4.2倍，產(chǎn)量達(dá)到了5.61g/L，而且消除了副產(chǎn)物有機(jī)酸的生成。值得關(guān)注的是在強(qiáng)化乙醇產(chǎn)量時(shí)，過表達(dá)影響乙醇合成相關(guān)的代謝流途徑對乙醇產(chǎn)量的提高同樣有很好的促進(jìn)作用（如圖3所示）。GUEDON等［43］在解纖維素梭菌（C. cellulolyticum）菌株內(nèi)過表達(dá)異源運(yùn)動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）丙酮酸脫羧酶（pdc）及乙醇脫氫酶（adh），致使纖維素消耗速率增加了150%，同時(shí)乙醇得率提升了53%。

圖3　生物乙醇代謝系統(tǒng)簡析［13,45］

（3）輔因子工程來提升乙醇產(chǎn)量。乙醇代謝時(shí)代謝途徑中充足還原力的供給是一個(gè)最關(guān)鍵的影響因素，因此增加NADH輔因子的再生降低輔因子的消耗將對乙醇的合成具有關(guān)鍵促進(jìn)作用（如圖3所示）。YAO等［44］利用代謝工程手段在嗜熱厭氧桿菌屬（Thermoanaerobacter Mathranii）菌株內(nèi)過表達(dá)NADH依賴性的甘油脫氫酶基因（glda），同時(shí)敲除乳酸脫氫酶基因（ldh）來阻斷NADH氧化途徑來輔助輔因子NADH的再生來強(qiáng)化乙醇的得率，發(fā)現(xiàn)嗜熱厭氧桿菌屬菌株［T. mathranii BG1G1（Δldh，PxylGldA）］的代謝流可以快速的轉(zhuǎn)向乙醇生成方向，進(jìn)而使乙醇的產(chǎn)率達(dá)到0.47g/L/h，為最大理論得率的97%。一個(gè)值得注意的趨勢是，如今許多研究者都在關(guān)注通過輔因子工程來提升代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率［45］，如在大腸桿菌（E. coli）中過表達(dá)NADPH依賴型的酵母線粒體NAD（H）激酶基因（Pos5p），使產(chǎn)品GDP-L-海藻糖和己內(nèi)酯產(chǎn)量分別提高了51%和96%。

（4）改造糖代謝相關(guān)的途徑提升乙醇量。由于木質(zhì)纖維素水解后產(chǎn)生多種單糖，因此提高微生物對這些糖的利用率同樣可以提高乙醇的產(chǎn)量。ALI等［46］通過過表達(dá)尖芽孢鐮刀菌（Fusarium Oxysporum）自身的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（hexose transporter，Hxt）促使乙醇的產(chǎn)量提升了近39%，同時(shí)過表達(dá)纖維素水解酶基因，增加基因表達(dá)劑量同樣可以提升微生物的糖代謝速率，從而影響乙醇產(chǎn)量。ANASONTZIS等［47］通過過表達(dá)尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）內(nèi)源木聚糖酶基因2（xylanase 2），致使乙醇產(chǎn)量提高了60%。雖然通過以上不同的策略可以極大地解決此類菌株在CBP木質(zhì)纖維素發(fā)酵中的問題，但是由于此類菌株在乙醇發(fā)酵及得率方面和傳統(tǒng)的乙醇菌株，如酵母菌，相比較還存在著很大的差距，因此開發(fā)更有效的乙醇發(fā)酵工程菌株仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

2.2.2改造天然乙醇生產(chǎn)菌株用于CBP乙醇

利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇已經(jīng)成為未來的發(fā)展方向，因此賦予傳統(tǒng)乙醇發(fā)酵模式菌株木質(zhì)纖維素發(fā)酵利用能力在開發(fā)二代生物乙醇研究中將有更大的應(yīng)用前景，并能很好地豐富CBP系統(tǒng)的內(nèi)容。

（1）改造菌株利用纖維素類生物質(zhì)。工程菌株代謝纖維素時(shí)主要依賴于3種纖維素酶，同時(shí)值得注意的是不同聚合度的纖維素在水解時(shí)需要酶種類也存在差異性［如圖2（a）、圖2（b）所示］，因此研究者重點(diǎn)關(guān)注了不同水解酶組合的引入及表達(dá)水平的提高等方面來增加工程菌株的水解能力。MUNJAL等［27］通過過表達(dá)異源類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.）的內(nèi)切葡聚糖酶基因（Endo5A）及葡糖苷酶基因（Gluc1C）構(gòu)建了一株能夠代謝纖維素的大腸桿菌（E. coli）菌株，在厭氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)乙醇時(shí)，使乙醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了最大理論值的85%。同樣VAN ROOYEN等［48］過表達(dá)扣囊復(fù)膜孢酵母菌（Saccharomycopsis fibuliger）的葡糖苷酶基因（Bgll）于釀酒酵母菌（S. cerevisiae），成功地使其可以代謝纖維二糖。TSAI等［49］構(gòu)建一個(gè)多纖維素水解酶系表面展示組合（synthetic yeast consortium，SYC）來過表達(dá)水解纖維素的關(guān)鍵水解酶，通過SYC的發(fā)酵水平與利用等量的水解酶來水解纖維素相比，乙醇產(chǎn)量提升了2.6倍，達(dá)到了3.5g/L，產(chǎn)率0.49g/g，為理論值的95%。對于半纖維素、菊粉、阿拉伯木聚糖等底物也存在同樣的應(yīng)用原理。在混合木質(zhì)纖維素碳源中，為了同時(shí)代謝這些底物，可以考慮同時(shí)表達(dá)不同水解酶基因或者是通過共培養(yǎng)等策略（表1）來完成底物的代謝發(fā)酵問題。

（2）提升菌株對戊糖及戊聚糖的利用能力。研究發(fā)現(xiàn)部分乙醇菌株對戊糖的運(yùn)輸和代謝方面存在著缺陷，以木聚糖物質(zhì)為例，在利用釀酒酵母菌代謝木聚糖類物質(zhì)的過程中會產(chǎn)生大量冗余的木糖、阿拉伯糖等而影響乙醇得率，但是，發(fā)現(xiàn)這些問題均可以通過修飾糖轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝通路而得到解決（如圖3所示）。SAKAMOTO等［50］在釀酒酵母菌（S. cerevisiae）中通過表面展示過表達(dá)3種半纖維素水解酶［如圖2（b）所示］以及3種木糖代謝途徑關(guān)鍵基因，賦予了工程菌株可以一步代謝半纖維素的能力，并使乙醇的產(chǎn)率達(dá)到了0.37g/（L·h）。值得注意的是，對于木糖和阿拉伯糖的代謝在不同的自然菌株中均發(fā)現(xiàn)有能夠運(yùn)輸和代謝這些糖的關(guān)鍵基因和操縱子存在。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)輸?shù)鞍譇raE能夠同時(shí)運(yùn)輸木糖和阿拉伯糖（如圖3所示），但其轉(zhuǎn)遠(yuǎn)效率直接受到阿拉伯糖操縱子的影響以及葡萄糖的碳代謝抑制。本文作者課題組利用野生型枯草芽孢桿菌168（Bacillus subtilis）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化和反向代謝工程操作，成功重構(gòu)了一株高效代謝木糖和阿拉伯糖的三基因突變株［B. subtilis168（Δupp，comP：T1121X，sinR：T319C，araR：A184G）］，這一性狀使其具有很好的CBP系統(tǒng)菌株改造潛力，也為未來CBP木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物基化學(xué)品開拓了道路［51］

2.3共培養(yǎng)或合成微生物菌群（Synthetic microbial consortium）策略

工業(yè)化成本、代謝穩(wěn)定與否是CBP系統(tǒng)微生物的一個(gè)重要指標(biāo)。以往的生物乙醇發(fā)酵主要是利用單一菌株如自然菌株、工程菌株等為主的一代、二代發(fā)酵技術(shù)來完成，但是存在著混合底物利用、耐受性、代謝穩(wěn)定性、代謝負(fù)擔(dān)等問題。隨著對自然界微生物共生共存原理的認(rèn)知加深，以及對不同微生物代謝特點(diǎn)及代謝網(wǎng)絡(luò)的研究不斷深入，以微生物共培養(yǎng)為主的第三代發(fā)酵技術(shù)在CBP乙醇生產(chǎn)研究中取得了長足進(jìn)展。PASCHOS等［23］通過共培養(yǎng)尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）和釀酒酵母（S. cerevisiae），通過同步糖化發(fā)酵程序在厭氧條件下發(fā)酵預(yù)處理的小麥秸稈生產(chǎn)乙醇，使乙醇的產(chǎn)量比單菌株發(fā)酵模式增加了19%，達(dá)到了58g/L。共培養(yǎng)策略的實(shí)施前提是必須構(gòu)建一個(gè)穩(wěn)定的共培養(yǎng)共表達(dá)系統(tǒng)。DU等［21］通過分析篩選16個(gè)不同的天然微生物基團(tuán)得到了一個(gè)能夠穩(wěn)定利用纖維素并生產(chǎn)乙醇的HP微生物菌群（如表1所示）基團(tuán)，在55℃及7g/L纖維素為碳源的條件下發(fā)酵時(shí)，可以使78%的底物轉(zhuǎn)化成乙醇，產(chǎn)量達(dá)到了2.5g/L。值得注意的是，穩(wěn)定的共培養(yǎng)系統(tǒng)在不同種類水解混合糖的代謝能力和乙醇得率方面也有很好的體現(xiàn)；如共培養(yǎng)僅能代謝己糖的纖維素水解菌熱纖梭菌（C. thermocellum）和代謝戊糖的微生物可以有效地降低不同種微生物之間的底物競爭而實(shí)現(xiàn)乙醇產(chǎn)量的最大化。XU等［52］共培養(yǎng)僅能代謝己糖的纖維素水解菌株熱纖梭菌（C. thermocellum）和代謝戊糖的嗜熱乳酸梭菌（C. thermolacticum），發(fā)現(xiàn)混合菌在降低發(fā)酵代時(shí)及提升乙醇的得率方面都得到了很好的結(jié)果。

3　新興生物技術(shù)對CBP生物乙醇的貢獻(xiàn)

近幾年，宏基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)以及合成生物學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等分析技術(shù)以及高通量篩選技術(shù)的快速發(fā)展，為發(fā)展商業(yè)化、工業(yè)化的CBP乙醇產(chǎn)業(yè)提供了一個(gè)全新的思路。尤其是近年來高速發(fā)展的合成生物學(xué)技術(shù)在設(shè)計(jì)構(gòu)建理想化的微生物細(xì)胞工廠以及篩選更高效的水解酶類方面的應(yīng)用更是為CBP生物乙醇的發(fā)展提供了一個(gè)強(qiáng)大的助力［53］。同時(shí)在多纖維素酶催化水解纖維素的研究工作中，宏基因組學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)等組學(xué)技術(shù)在探索和設(shè)計(jì)一些新型高效能、耐熱型、pH穩(wěn)定型的新型水解酶方面同樣提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐。在未來的CBP生物工廠的構(gòu)建中，通過不同的組學(xué)技術(shù)來開發(fā)新的模塊化的纖維素酶體系以及結(jié)合“奇異”的工程技術(shù)應(yīng)用，而使開發(fā)出全新的de novo CBP微生物代謝途徑成為了可能［28］。對于一個(gè)更加理想化的CBP微生物，除了能夠合成分泌高活性的水解酶系，還必須要耐受在生物質(zhì)預(yù)處理及發(fā)酵階段的有害物質(zhì)及發(fā)酵產(chǎn)物。對此，面臨發(fā)酵抑制物及高濃度產(chǎn)物等干擾因素時(shí)，系統(tǒng)生物學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)方法已經(jīng)被廣泛的用于探索微生物及水解酶系的分子和基因表達(dá)特點(diǎn)及作用機(jī)制。同時(shí)在應(yīng)對抑制因子存在的環(huán)境下，全局轉(zhuǎn)錄因子工程和質(zhì)子泵排毒機(jī)制等方法策略也被用于研究酶的催化、表達(dá)機(jī)理之中［54］，并且在一些研究中宏基因組學(xué)也已被充分的應(yīng)用于開發(fā)CBP生物基產(chǎn)品底盤微生物的研究之中。

4　CBP乙醇的商業(yè)化研究進(jìn)展

在過去的十年中，研究者通過對不同CBP乙醇生產(chǎn)策略和新興生物技術(shù)手段的綜合開發(fā)和運(yùn)用，已然攻克了諸多的CBP乙醇生產(chǎn)難題，并且在小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)性探索方面取得了可觀的成果［4］。但是對于發(fā)展和構(gòu)建更大規(guī)模的商業(yè)化CBP乙醇而言許多的問題和障礙依然存在，如成本和能耗、發(fā)酵周期、產(chǎn)物得率及酶等方面［55］。盡管發(fā)展商業(yè)化的二代乙醇依然處于一個(gè)起步階段并要克服很多的困難，但是依然有許多的研究者和企業(yè)在此方面取得了巨大的進(jìn)步［53］。MASCOMA公司［56］以其本身專利性的二代Mascoma農(nóng)作物加工技術(shù)（Mascoma Grain Technology，MGT）而首次使CBP乙醇生產(chǎn)商業(yè)化成為了可能，而且是一個(gè)最具代表性的工業(yè)化CBP乙醇開發(fā)領(lǐng)航者。2011年，Valero可再生燃料公司（VRF）和太平洋乙醇公司通過利用Mascoma的CBP乙醇技術(shù)，其所生產(chǎn)的二代乙醇占據(jù)了美國乙醇總量的9%。除此之外，Qteros公司［57］同樣成功的開發(fā)出了一種以梭菌屬（C. phytofermentans）為標(biāo)志性的“Q Microbe”技術(shù)，并且可以很好地服務(wù)于CBP乙醇的商業(yè)化發(fā)展。值得注意的是，其他的公司如DSM POET，Abengoa，Iogen及LanzaTech等也在追逐著CBP乙醇發(fā)展的商業(yè)化步伐［58］。不僅在國外，國內(nèi)的眾多纖維素乙醇企業(yè)和研究團(tuán)體在二代乙醇研究中同樣取得了較好的成果。中國科學(xué)院廣州能源研究所等通過對限制CBP乙醇生產(chǎn)的關(guān)鍵因素進(jìn)行攻關(guān)，成功地實(shí)現(xiàn)了萬噸級的乙醇生產(chǎn)示范工程［59］。同時(shí)其他的企業(yè)如濟(jì)南圣泉、河南天冠和山東龍力生物、中糧集團(tuán)等在二代乙醇研發(fā)方面也均取得很好的成果。同時(shí)由意大利Mossi Ghisolfi集團(tuán)和丹麥的生物制藥企業(yè)諾維信投資的世界最大的木質(zhì)纖維素乙醇工廠已于2015年開始在安徽阜陽承建，極大地推動了中國在生物質(zhì)能源方面的發(fā)展。但是這些企業(yè)所研發(fā)的商業(yè)化二代乙醇技術(shù)并非真正意義上的CBP乙醇工藝，其依然采用了傳統(tǒng)額外添加酶的方法來實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)的降解和乙醇的生產(chǎn)；同時(shí)在二代CBP乙醇發(fā)酵工業(yè)中，低于5000t的裝置屬于中試裝置；而萬噸級的裝置則可劃分于中試和產(chǎn)業(yè)化推廣之間，即示范工程；而大于萬噸以上的裝置方屬于產(chǎn)業(yè)化。有鑒于此，這些商業(yè)化乙醇生產(chǎn)的規(guī)模也只能歸于中式和初級放大的階段而非實(shí)際意義上的工業(yè)化和商業(yè)化發(fā)展［60］。不僅于此，這些半商業(yè)化的二代乙醇在底物的利用方面也只局限于玉米芯、甘蔗渣等底物而無法達(dá)到更多工業(yè)化的生產(chǎn)要求。盡管如此，這些生物乙醇商業(yè)化的歷史性探索和成功案例同樣為未來發(fā)展最優(yōu)化和大規(guī)模的商業(yè)化木質(zhì)纖維素基乙醇尤其是為CBP乙醇的工業(yè)化發(fā)展提供了清晰的現(xiàn)實(shí)案例。因此在可預(yù)見的將來，CBP乙醇的發(fā)展必將走進(jìn)商業(yè)化和工業(yè)化的藍(lán)圖。

5　結(jié)語與展望

在過去的幾十年內(nèi)，CBP系統(tǒng)在轉(zhuǎn)化纖維素生產(chǎn)生物燃料方面取得了巨大的進(jìn)展，也為解決化石能源危機(jī)提供了一個(gè)新的視角和參考依據(jù)。在近幾年的CBP木質(zhì)纖維素發(fā)酵生物乙醇研究中，不同的纖維素乙醇轉(zhuǎn)化方法以及大量的自然和工程微生物都被應(yīng)用于CBP生物乙醇生產(chǎn)的研究和分析中，同時(shí)也包括不同的發(fā)酵策略和發(fā)酵工藝的發(fā)展。除此之外，宏基因組學(xué)、合成生物學(xué)、代謝工程等高通量技術(shù)在開發(fā)理想CBP系統(tǒng)微生物、解析酶的催化代謝機(jī)制、新酶的研究方面也取得了巨大的進(jìn)展。盡管CBP生物乙醇技術(shù)在一定程度克服了許多的挑戰(zhàn)和困難，但是對于大規(guī)模的商業(yè)應(yīng)用還是面臨著一定的技術(shù)難題和挑戰(zhàn)。為了開發(fā)出更加合理的CBP乙醇發(fā)酵過程，改進(jìn)工業(yè)發(fā)酵的不足，未來的發(fā)展方向和挑戰(zhàn)主要集中于以下幾個(gè)方面。

（1）改善CBP系統(tǒng)微生物在水解酶的合成、分泌、酶活及催化效率、水解酶生產(chǎn)中的代謝負(fù)擔(dān)和異源基因表達(dá)的不穩(wěn)定性問題。隨著代謝工程、合成生物學(xué)、宏基因組學(xué)的發(fā)展，越來越多的生物學(xué)手段被應(yīng)用于研究水解酶的特性、催化位點(diǎn)及催化機(jī)制；并開發(fā)出了一系列新的催化效率高、熱穩(wěn)定性好、pH穩(wěn)定的新酶同時(shí)被應(yīng)用于CBP菌株的構(gòu)建之中。同時(shí)新的基因工程技術(shù)如表面展示、信號肽、酶基團(tuán)等在改善CBP系統(tǒng)微生物的發(fā)酵表現(xiàn)方面也將有很好的促進(jìn)作用。

（2）縮短發(fā)酵代時(shí)及提升乙醇產(chǎn)量。隨著代謝工程的應(yīng)用及微生物代謝機(jī)制和網(wǎng)絡(luò)的不斷解析，從而使人們可以更加精確的定位和阻斷副產(chǎn)物代謝途徑、特異性的引進(jìn)新的代謝途徑、結(jié)合工程手段來增加輔因子NADH的再生同時(shí)結(jié)合新型高活力水解酶的利用等，這些技術(shù)和方法在提高乙醇產(chǎn)量、縮短發(fā)酵代時(shí)等方面都將具有很好的促進(jìn)作用。

（3）解決CBP微生物對產(chǎn)物及抑制劑耐受性。幾年來，隨著全局型轉(zhuǎn)錄因子工程和質(zhì)子泵排毒機(jī)制被應(yīng)用于弱化產(chǎn)物及抑制劑對水解酶及微生物的毒害，同時(shí)結(jié)合木質(zhì)纖維素預(yù)處理技術(shù)和方法的應(yīng)用均可以極大地降低有毒物質(zhì)對微生物以及酶的影響進(jìn)而提升發(fā)酵表現(xiàn)。

（4）拓寬底物利用范圍，降低生產(chǎn)成本。近年來隨著對代謝工程、基因工程和合成生物學(xué)的應(yīng)用以及對菌株代謝機(jī)理的解析及代謝網(wǎng)絡(luò)的模擬化重構(gòu)操作，人們已經(jīng)可以理性的設(shè)計(jì)和構(gòu)建出能夠共利用各種底物的模式化工程菌株，如釀酒酵母菌、枯草芽孢桿菌等，并且實(shí)現(xiàn)了菌株糖代謝能力從無到豐的推進(jìn)。同時(shí)結(jié)合不同CBP策略的使用，已經(jīng)促使部分的基因或者代謝工程菌被應(yīng)用到CBP乙醇的生產(chǎn)之中，而且取得了極好的效果。

未來，隨著代謝工程整合系統(tǒng)生物學(xué)、合成生物學(xué)以及進(jìn)化工程即所謂的的系統(tǒng)代謝工程（systems metabolic engeering，SME）的應(yīng)用，以及基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄物組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、計(jì)算機(jī)生物學(xué)等分析技術(shù)以及高通量篩選平臺快速發(fā)展及各學(xué)科的相互結(jié)合和滲透同時(shí)參考理性的設(shè)計(jì)理念，相信隨著人們對CBP發(fā)酵機(jī)理的理解和認(rèn)知，必將在可預(yù)見的未來攻克CBP領(lǐng)域所存在的種種壁壘，最終實(shí)現(xiàn)對木質(zhì)纖維素材料的綜合開發(fā)利用，并能極大地降低生產(chǎn)成本和滿足經(jīng)濟(jì)化的商業(yè)應(yīng)用，從而使人類度過化石原料和糧食資源匱乏所帶來的能源和糧食危機(jī)。

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Progress in bioethanol production via consolidated bioprocessing

LI Xinli，ZHU Yuhong，WANG Baowei，F(xiàn)U Jing，WANG Zhiwen，CHEN Tao
（School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Key Laboratory of Systems Bioengineering，Tianjin 300072，China）

Consolidated bioprocessing（CBP），refers to bioprocessing by exploitation and utilization of ideal chassis microorganisms to directly convert lignocellulose into bioproducts in one processing. The research background，development concepts and technology roadmaps of the CBP were briefly introduced in this paper. Subsequently，we comprehensively reviewed the different strategies and the recent research progress in CBP lignocellulose to second generation bioethanol production. Then，the advantages and bottleneck factors of the native，recombinant and co-culture strains used in CBP bioethanol fermentation were analyzed. The genetic engineering，metabolic engineering and other techniques' application value and potential for overcoming the barrier factors of CBP bioethanol production and increasing bioethanol yield were assessed. Ultimately，this review provided a brief commentary on the contribution of emerging biotech，such as ‘omics' and synthetic biology and on CBP bioethanol production and the recent conditions of the lignocellulosic bioethanol production toward commercialization scale，as well as opportunities and challenges in the future.

consolidated bioprocessing；lignocellulose；bioethanol；fermentation；biotechnology

TK 6；TQ 92

A

1000-6613（2016）11-3600-11

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.11.033

2016-03-23；修改稿日期：2016-04-17。

國家973計(jì)劃（2012CB725203）及國家863計(jì)劃（2012AA02A702，2012AA022103） 項(xiàng)目。

李心利（1989—），男，碩士研究生。E-mail lixin_li@tju.edu.cn。聯(lián)系人：陳濤，副教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榇x工程和合成生物學(xué)。E-mail chentao@tju.edu.cn。