林萌莉，王 潔，廖永紅，周曉宏,*

（1.北京理工大學生命學院，北京 100081；2.北京工商大學食品學院，北京 100048）

燉煮雞湯中多肽與鮮味構效關系

林萌莉1，王 潔1，廖永紅2，周曉宏1,*

（1.北京理工大學生命學院，北京 100081；2.北京工商大學食品學院，北京 100048）

以傳統(tǒng)燉煮雞湯為對象，研究多肽與鮮味之間的構效關系。將燉煮3 h的雞湯利用10、5、3 kD的超濾膜分離，取味道鮮美的分子質量小于3 kD的組分進行高效液相色譜-質譜法多肽組分分析，獲得了93 條多肽序列。通過分析發(fā)現(xiàn)：加熱降解產(chǎn)生的多肽序列中甜鮮氨基酸的比例高，強疏水性氨基酸的比例低；加熱降解過程中肽鍵斷裂具有選擇性，親水氨基酸形成的肽鍵更易斷裂。鮮味多肽主要來源于肌肉蛋白，其次是膠原蛋白、酶、抗體等活性成分。

雞湯；多肽；鮮味；親水性氨基酸；疏水性氨基酸

鮮味是5 種基本味覺之一，深受東方人的喜愛。近代以前，鮮味食品是由蛋白含量豐富的食料通過燉煮或發(fā)酵方法制備的，如肉湯、蔬菜湯、醬油、豆腐乳等[1-2]。1908年，日本東京帝國大學教授池田菊苗發(fā)現(xiàn)了海帶湯鮮美的味道源自于谷氨酸鈉[3]。20世紀50年代末，谷氨酸鈉通過發(fā)酵方法實現(xiàn)了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[4]。1960年，研究者發(fā)現(xiàn)5’-鳥苷酸（guanosine 5’-monophosphate disodium salt，GMP）和5’-肌苷酸（inosine 5’-monophosphate disodium salt，IMP）按比例混合在一起，具有特殊的鮮味，出現(xiàn)了鮮味產(chǎn)品I＋G[5]。20世紀90年代，雞精產(chǎn)業(yè)出現(xiàn)并取得長足發(fā)展，雞精在一定程度上體現(xiàn)了肉的香氣和鮮味口感。由于味精、I＋G、雞精等鮮味工業(yè)產(chǎn)品成分單一、鮮味強烈直沖且缺乏營養(yǎng)，消費者更需要類似傳統(tǒng)肉湯、醬油等口感柔和、營養(yǎng)豐富的鮮味產(chǎn)品。然而，傳統(tǒng)方法原料利用率低、生產(chǎn)效率低，能源消耗高，人工成本壓力大。因此，研究傳統(tǒng)鮮味食品的鮮味形成機理和規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)技術已成為當前鮮味產(chǎn)業(yè)的迫切需求[6]。

傳統(tǒng)方法制備的肉湯、醬油等的主要鮮味成分是蛋白降解產(chǎn)生的多肽及氨基酸[7-9]。多肽在柔和協(xié)調(diào)的鮮味中具有非常重要的作用，是國內(nèi)外的研究熱點。1969年，多肽的呈味特性引起人們的關注[10]。1978年，Yamasaki等[11]采用木瓜蛋白酶酶解牛肉后，從酶解液中獲得美味提升肽：Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala。Noguchi[12]和Rhyu[13]等利用質譜分析從蛋白酶解物中分析獲得鮮味肽，發(fā)現(xiàn)鮮味主要存在于一些低分子質量的酸性多肽中。Maehashi等[14]分別利用不同的酶對蛋白質進行酶解，發(fā)現(xiàn)11 條多肽，其中，Glu-Glu、Glu-Val、Ala-Asp-Glu、Ala-Glu-Asp、Asp-Glu-Glu等在含有0.02%的肌苷酸的溶液中能夠提升鮮味效果。Gómez-Ruiz等[15]在酪蛋白中發(fā)現(xiàn)了許多鮮味肽，發(fā)現(xiàn)多肽中的氨基酸組成及氨基酸在多肽中的位置對于多肽的呈味特性具有非常重要的影響。Su Guowan等[16]通過超濾、反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）等分離方法對脫脂花生酶解物進行分析，發(fā)現(xiàn)了一條鮮味肽Ser-Ser-Arg-Asp-Glu-Gln-Ser-Arg和一條鮮味增強肽Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Pro-Asp-Gly-Ser-Ser-Arg。組成多肽的氨基酸與味覺受體的相互作用會影響多肽的呈味特性[17]。Ishibashi等[18-19]合成含有疏水性氨基酸的短肽并對其進行研究，發(fā)現(xiàn)多肽的苦味強度與疏水性氨基酸的比例及在多肽中的位置有關，疏水性氨基酸殘基比例高的多肽苦味強度較高[20]。Tamura[21]和Rhyu[13]等發(fā)現(xiàn)含有谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）的低分子質量酸性多肽具有鮮味。

綜上所述，以往鮮味多肽的研究都是針對單一或少數(shù)幾條多肽，但是，肉類燉煮食品的鮮味口感不只是由一種或若干種多肽呈現(xiàn)的，而是由肉類蛋白加熱降解形成的各種多肽呈現(xiàn)的[22]。本實驗利用傳統(tǒng)燉湯方法制備雞湯，通過超濾、高效液相色譜-質譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrum，HPLCMS）等分離分析手段研究雞湯中多肽與鮮味之間的構效關系，以期為工業(yè)化制備具有傳統(tǒng)燉湯燒肉鮮味的新型鮮味調(diào)味品提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

三黃童子雞 北京超市發(fā)超市雙榆樹分店。

1.2 儀器與設備

AL204-IC分析天平、Vivaspin 6離心濃縮管德國Sartouris公司；TDL-50B型離心機 上海安亭科學儀器廠；DIONEX UltiMate 3000 RSLC液相色譜儀、Q-Exactive質譜儀（Xcalibur 2.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 雞湯制備與處理

新鮮三黃雞洗凈之后，去尾脂腺，分割頭、頸、爪、腿、翅，雞身架切成5 cm×5 cm左右方塊，按質量比1∶3往燉鍋中加入蒸餾水，浸沒過雞塊，大火將雞湯煮沸之后微火慢燉3 h。湯汁用10 cm×20 cm，密度30×28的4 層紗布二次過濾，3 000 r/min離心20 min之后，取上層液體在4 ℃冰箱內(nèi)密封靜置一星期后，使脂肪和湯體充分分離，再用兩層7 cm的雙圈中速定性濾紙過濾保存。靜置前后雞湯風味，氨基態(tài)氮含量無明顯變化，靜置后檢測不到蛋白酶酶活力，說明雞湯靜置前后多肽的變化可以忽略。

1.3.2 超濾分析與風味評估

雞湯樣品在4 000 r/min條件下離心10 min后，收集上清液。分別用0.45、0.22 ?m水相濾膜對上清液進行微濾。獲得的微濾液再利用截留分子質量為10、5、3 kD的超濾離心管在3 000×g條件下進行20 min的超濾離心。取一定量的雞湯原液及不同截留分子質量的超濾液進行真空凍干稱量，4 ℃保存?zhèn)溆?。利用質量分數(shù)為0.9%的NaCl溶液溶解干粉，根據(jù)王春葉[23]和Frank[24]等報道的滋味稀釋分析法分析。

1.3.3 多肽序列分析

通過滋味稀釋分析發(fā)現(xiàn)雞湯中的鮮味物質分子質量主要集中在3 kD以下，和原雞湯的味道相似。因此選取分子質量小于3 kD的超濾組分進行多肽序列分析。取1 mL樣品，12 000×g離心15 min，取上清液，冷凍揮干，用質量分數(shù)0.1%的三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）復溶。樣品在0.3 ?L/min流速條件下梯度洗脫分離65 min。分離裝置為液相色譜儀與質譜儀直接相連，構成液相色譜-質譜聯(lián)用系統(tǒng)。分析柱為熔融石英毛細管柱（150 mm×75 ?m；Upchurch），將其與C18樹脂（300 ?，5 ?m；Varian）組合形成自制分析柱，流動相A為體積分數(shù)0.1%甲酸，流動相B為體積分數(shù)80%的乙腈和體積分數(shù)0.08%的甲酸，質譜分析使用單一的全掃描質譜Orbitrap（質量掃描范圍 400～1 500；分辨率140 000），并通過Xcalibur2.2軟件采集數(shù)據(jù)。HPLC-MS分析圖譜檢索國家國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫，獲得多肽序列。

2 結果與分析

2.1 雞湯多肽序列分析

將分子質量小于3 kD的組分進行MS多肽序列分析，總共獲得了93 條多肽序列，結果如表1所示。對93 條多肽進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)多肽最大分子質量為2 884 D，最多含有28 個氨基酸殘基。其中超過50%多肽序列中含有的氨基酸殘基數(shù)小于10，說明分子質量小于3 kD組分中含有的鮮味肽是一些低分子質量的多肽。Fadda等[25]也發(fā)現(xiàn)蛋白降解產(chǎn)生的低分子質量的肽與食品的鮮味有關。

表1 雞湯中小于3 kD的多肽序列Table1 Peptide sequences of the fraction (MW< 3 kD) in chicken broth

2.2 多肽中甜鮮氨基酸分布

在多肽中，不同呈味氨基酸的組成對于多肽呈味特性具有很重要的影響[17]。根據(jù)表1多肽序列信息計算甜鮮氨基酸（Asp、Glu、Gln、Asn、Ala、Gly、Thr、Ser）占各自多肽總氨基酸的比例，并將甜鮮氨基酸比例劃分為8 個區(qū)間，分別是0～9.9%、10%～19.9%、20%～29.9%、30%～39.9%、40%～49.9%、50%～59.9%、60%～69.9%、70%～79.9%，并統(tǒng)計各個區(qū)間中的多肽條數(shù)。如圖1所示，93 種序列中甜鮮氨基酸比例在30%～80%的多肽數(shù)為74 條，且近半數(shù)序列中甜鮮氨基酸的比例超過50%，說明含有高比例甜鮮氨基酸組成是小于3 kD組分中多肽呈鮮味的關鍵因素之一。

圖1 甜鮮氨基酸的比例分布Fig.1 Distribution of sweet and umami amino acids

2.3 多肽疏水性氨基酸分布

苦味氨基酸（Lys、Arg、Tyr、Ile、Leu、Val、Phe、Trp）多是一些疏水性氨基酸，疏水性氨基酸在多肽中的組成及位置都會影響多肽風味[20]。93 種序列中只有19%多肽序列的C末端為疏水性氨基酸，超過70%多肽序列中疏水性氨基酸的比例不超過50%。根據(jù)氨基酸疏水性的高低，疏水性值高于0.8的Ile、Leu、Val、Phe、Trp歸類為強疏水性氨基酸，低于0.8的Ala、Met、Pro等歸類為低疏水性氨基酸[26]。強疏水性的氨基酸的比例較低，一般在0～20%之間。說明雞肉蛋白在熱解的過程中，傾向于將低疏水性的肽段熱切下來。Normah等[27]指出疏水性氨基酸對多肽苦味具有重要作用，苦味的強弱與疏水性氨基酸分布位置有關。肽的C末端如果是疏水性氨基酸，多肽會呈現(xiàn)苦味。在蛋白加熱過程中，可能由于疏水性氨基酸在蛋白質內(nèi)部形成了疏水核心，不易暴露出來并被降解。而蛋白酶解過程中，易于形成疏水性多肽，所以會呈現(xiàn)苦味[28]。分子質量小于3 kD雞湯組分中極少數(shù)多肽序列中疏水性氨基酸占的比例較高，這些多肽在鮮味口感中也起著重要作用，使鮮味更柔和，同時也保證了雞湯中必需氨基酸的營養(yǎng)價值。

2.4 肽鍵熱分解的選擇性

疏水性氨基酸分布結果發(fā)現(xiàn)，肽鍵的末端不是隨機分布的，而具有一定的規(guī)律性，表明鍵的熱分解不是隨機的。對93 種多肽序列進行比較，對來源于蛋白的同源肽段熱切位點進行分析，統(tǒng)計出21 種不同的多肽的熱切位點，結果見表2。21 個推測的肽鍵熱切位點左側（N端）均不含強疏水性氨基酸，而在肽鍵右側（C端）出現(xiàn)5 次強疏水性氨基酸，N端、C端均為親水或低疏水性氨基酸的肽鍵切點所占比例為76.2%，N端為親水性或低疏水性氨基酸、C端為強疏水性氨基酸的肽鍵切點所占比例為23.8%，而在肽鍵N、C端均為強疏水性氨基酸的情況基本不存在。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)肽鍵熱切具有這樣的選擇性：親水肽鍵（親水氨基酸-親水氨基酸）在受熱情況下最先斷裂；半親水肽鍵（親水氨基酸-疏水氨基酸、疏水氨基酸-親水氨基酸）根據(jù)疏水氨基酸所在位置不同具有不同的熱切選擇性，其中疏水性氨基酸位于肽鍵左側（N端）不利于肽鍵發(fā)生熱切作用，但從整體熱切選擇性來說，半親水肽鍵比親水肽鍵熱切作用要差很多；疏水肽鍵（疏水性氨基酸-疏水性氨基酸）熱切作用最低，當肽鍵兩側氨基酸殘基具有強疏水性時，肽鍵基本不發(fā)生熱切作用。

表2 同源多肽的熱切位點Table2 Cleavage sites of the homologous polypeptides

2.5 雞湯鮮味肽組織來源

根據(jù)鮮味肽序列Gi號，統(tǒng)計各種多肽的組織來源。將雞肉組織分為4 類：肌肉蛋白組織、膠原蛋白組織、活性成分及其他組織。通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)58%的多肽來源于肌肉蛋白，12%的多肽來源于膠原蛋白，14%的多肽來源于酶、抗體等活性蛋白成分，另外16%多肽來源于其他組織。除了動物體的肌肉蛋白以外，膠原蛋白和活性蛋白成分對肉湯的風味具有重要貢獻。

3 結 論

多肽在食品的鮮味呈味特性中具有非常重要的作用，鮮味多肽主要為分子質量小于3 kD的小分子多肽。在分析獲得的93 條多肽序列中，疏水性的氨基酸含量較低，C末端基本上不是強疏水性的氨基酸，與苗曉丹等[20]研究發(fā)現(xiàn)的苦味肽與疏水性氨基酸之間關系的結論一致。但是，他們發(fā)現(xiàn)鮮味肽中Asp、Glu的比例較高，并從一級結構的角度解析了多肽與鮮味之間的構效關系。而本研究通過對燉煮雞湯中的多肽序列分析發(fā)現(xiàn)甜味氨基酸也是多肽呈鮮味的關鍵因素之一。從蛋白質結構整體分析，疏水性氨基酸在蛋白質內(nèi)部形成了疏水核心，加熱時表面的親水性氨基酸殘基組成的多肽先斷裂下來，所以，雞湯多肽疏水性氨基酸殘基的比例較低。肽鍵的斷裂具有選擇性，親水肽鍵最易斷裂。蛋白加熱降解形成的鮮味多肽主要來源于肌肉蛋白，其次是膠原蛋白及其他的一些活性成分。

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Structure-Acivity Relationship between Peptides and Flavor in Chicken Broth

LIN Mengli1, WANG Jie1, LIAO Yonghong2, ZHOU Xiaohong1,*
(1. School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China; 2. School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

The structure-activity relationship between peptides and flavor was studied on chicken broth made by the traditional cooking process. The chicken broth stewed for three hours was fractionated using ultrafiltration membranes with molecular weight cut-offs of 10, 5 and 3 kD. The peptidomics in the fraction (molecular weight < 3 kD) which had the strongest umami taste were analyzed by high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS). Totally 93 peptides with high proportion of umami and sweet amino acids and low proportion of hydrophobic amino acids were sequenced. Peptide bonds with hydrophilic amino acids were preferentially cleaved during the heating process. The peptides were mainly derived from muscle proteins, collagens, enzymes and antibodies.

chicken broth; peptide; umami; hydrophilic amino acids; hydrophobic amino acids

10.7506/spkx1002-6630-201603003

Q819

A

1002-6630（2016）03-0012-05

林萌莉, 王潔, 廖永紅, 等. 燉煮雞湯中多肽與鮮味構效關系[J]. 食品科學, 2016, 37(3): 12-16. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603003. http://www.spkx.net.cn

LIN Mengli, WANG Jie, LIAO Yonghong, et al. Structure-acivity relationship between peptides and flavor in chicken broth[J]. Food Science, 2016, 37(3): 12-16. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603003.http://www.spkx.net.cn

2015-03-13

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAD23B01）

林萌莉（1990 —），女，碩士研究生，研究方向為生物工程。E-mail：15965102575@163.com

*通信作者：周曉宏（1965 —），男，副教授，博士，研究方向為生物工程。E-mail：zhouxh@bit.edu.cn