陳紀(jì)鵬，李生強(qiáng)，劉顯軍，卻志群

(宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000)

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甘藍(lán)型油菜與黑芥雙倍體減數(shù)分裂的原位雜交分析

陳紀(jì)鵬，李生強(qiáng)，劉顯軍，卻志群

(宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000)

【目的】 探明植物雜種后代減數(shù)分裂異常與花粉敗育之間的關(guān)系?！痉椒ā?通過(guò)甘藍(lán)型油菜與黑芥種間雜交和基因組加倍，獲得蕓薹屬三基因組雙倍體，采用基因組原位雜交方法，觀(guān)察三基因組雙倍體花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂規(guī)律?！窘Y(jié)果】 與單倍體相比，雙倍體花粉育性得到一定恢復(fù)，但可育花粉的比例較低，只有10%～20%?；蚪M原位雜交結(jié)果顯示，雙倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂終變期染色體以形成同源二價(jià)體為主，但也有部分染色體形成四價(jià)體或六價(jià)體。四價(jià)體有3種形式：B基因組染色體形成的四價(jià)體、AC基因組染色體形成的四價(jià)體及B與AC基因組之間形成的異配四價(jià)體。減數(shù)分裂后期Ⅰ染色體均等分離的細(xì)胞占總數(shù)的70%左右，在第2次減數(shù)分裂期也觀(guān)察到非正常分裂如非四分孢子、微核等現(xiàn)象?！窘Y(jié)論】 減數(shù)分裂過(guò)程中的染色體異常行為可能是導(dǎo)致花粉育性不高的重要原因；雖然不正常的減數(shù)分裂導(dǎo)致花粉育性下降，但雙親染色體的異源聯(lián)會(huì)可為雙親遺傳物質(zhì)的交換提供條件。

黑芥；甘藍(lán)型油菜；減數(shù)分裂；基因組原位雜交；雄性不育

在植物進(jìn)化歷程中，多倍化發(fā)揮了巨大的作用。自然界約70%的高等植物都是多倍體，而且人們認(rèn)為典型的二倍體植物如玉米、水稻等在進(jìn)化史上也經(jīng)歷了至少一次多倍化[1-2]。蕓薹屬(Brassica)植物在進(jìn)化上也經(jīng)歷了多倍化的歷程，蕓薹屬栽培種包括3個(gè)基本種和3個(gè)復(fù)合種，3個(gè)基本種是白菜(B.rapa，AA，2n=20)、黑芥(B.nigra，BB，2n=16)和甘藍(lán)(B. oleracea，CC，2n=18),3個(gè)復(fù)合種是甘藍(lán)型油菜(B.napus，AACC，2n=38)、芥菜型油菜(B.juncea，AABB，2n=36)和埃塞俄比亞芥(B.carinata，BBCC，2n=34)。3個(gè)復(fù)合種是由3個(gè)基本種兩兩雜交并經(jīng)過(guò)基因組自然加倍形成的，即白菜與甘藍(lán)雜交形成甘藍(lán)型油菜，白菜與黑芥雜交形成芥菜型油菜，黑芥與甘藍(lán)雜交形成埃塞俄比亞芥。這種進(jìn)化關(guān)系由日本學(xué)者禹長(zhǎng)春提出，因此被稱(chēng)為“禹氏三角”。而且蕓薹屬栽培種之間的這種進(jìn)化關(guān)系已被分子生物學(xué)和基因組原位雜交等方法進(jìn)一步證實(shí)[3]。雖然蕓薹屬四倍體表現(xiàn)出強(qiáng)大的進(jìn)化優(yōu)勢(shì)[1，4]，比如四倍體的甘藍(lán)型油菜成為世界上主要的油菜栽培種，但是自然界中卻沒(méi)有自然形成的蕓薹屬六倍體種，人工合成的六倍體也表現(xiàn)出不良性狀，不適合栽培，而在其他種屬，如小黑麥和燕麥中都有六倍體用于栽培。

十字花科大約有338個(gè)屬，近3 700個(gè)種，不但有多種栽培蔬菜、油料作物、藥用植物和觀(guān)賞植物，還有大量的野生種。在十字花科植物中，蘊(yùn)藏著大量的具有各種生物抗性和非生物抗性的基因資源，為油菜的遺傳改良提供了前提。隨著全球自然條件的不斷惡化，油菜病蟲(chóng)草害以及各種非生物脅迫日益加劇，嚴(yán)重影響著油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，培育具有良好抗性的新品種成為解決這一問(wèn)題的主要途徑。近年來(lái)，人們通過(guò)多種途徑合成了蕓薹屬三基因組雙倍體用于栽培物種的遺傳改良[5-7]。黑芥是蕓薹屬的一個(gè)二倍體栽培種，其不僅具有良好的栽培性狀，還具有抗黑腐病、抗黑脛病和根腫病等特性[8-9]。近年來(lái)，花椰菜、蘿卜、白菜等栽培作物與黑芥的種、屬間雜交均獲得成功，并且成功地將抗病基因從黑芥引入栽培蔬菜中[10]。本研究通過(guò)人工雜交和基因組加倍獲取甘藍(lán)型油菜與黑芥的種間雜種，既可以將黑芥的優(yōu)良基因引入甘藍(lán)型油菜，又可創(chuàng)造出蕓薹屬栽培種三基因組雙倍體，采用基因組原位雜交方法分析三基因組雙倍體中各基因組間和基因組內(nèi)的染色體聯(lián)會(huì)情況，探明三基因組雙倍體減數(shù)分裂過(guò)程中染色體的行為規(guī)律，以期為人類(lèi)創(chuàng)造有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蕓薹屬六倍體提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

與黑芥(B.nigra,BB,2n=16)雜交的4個(gè)甘藍(lán)型油菜(B.napus,AACC,2n=38)品種分別為‘Oro’(世界上第1個(gè)低芥酸、低硫甙油菜品種)、‘中油821’、‘湘油15’和‘陜油15’，其中‘陜油15’為甘藍(lán)型半冬性胞質(zhì)不育三系雜交中晚熟品種，具有中抗菌核病特征。雜交種本身遺傳的不穩(wěn)定性可能導(dǎo)致雜種后代不穩(wěn)定，加大選育的難度，但后代群體的遺傳差異可為優(yōu)良性狀的選擇提供更大空間。4個(gè)雜交親本種植于宜春學(xué)院實(shí)驗(yàn)田，而黑芥生育期較短且喜干旱，為了使其與甘藍(lán)型油菜花期相遇，將其種植在溫室內(nèi)并適當(dāng)延遲播種。

1.2方法

1.2.1三基因組雙倍體的獲得以黑芥與4個(gè)甘藍(lán)型油菜作為雜交親本，于盛花期人工去除雄蕊，第2天上午取甘藍(lán)型油菜花粉輔助授粉，對(duì)甘藍(lán)型油菜與黑芥進(jìn)行種間雜交，并在授粉后20 d左右進(jìn)行胚培養(yǎng)獲取雜種后代，計(jì)算三倍體獲得頻率(獲得頻率=獲得雜種植株數(shù)/授粉花朵數(shù)×100%)。將三倍體雜種幼芽轉(zhuǎn)入MS+0.25 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+1 mg/L秋水仙堿培養(yǎng)基中進(jìn)行基因組加倍，在含有秋水仙堿的培養(yǎng)基中處理10 d，再轉(zhuǎn)入不含秋水仙堿的培養(yǎng)基，使愈傷組織重新分化出幼苗，即可獲得基因組加倍的三基因組雙倍體(AABBCC)。

1.2.2三基因組雙倍體花粉育性的醋酸洋紅染色觀(guān)察在天氣晴朗的上午選取三基因組雙倍體植株當(dāng)天開(kāi)放的花，取2枚花藥放在載玻片上破碎使花粉散出，滴加醋酸洋紅染色，蓋上蓋玻片后在顯微鏡下觀(guān)察花粉形態(tài)和著色深淺，并統(tǒng)計(jì)可育花粉數(shù)量。每株觀(guān)察花粉數(shù)量200粒以上，花粉粒大而圓且易被染色的花粉為可育花粉，較小、干癟且不易被染色的為不育花粉。

1.2.3花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的熒光顯微觀(guān)察采用CTAB法提取黑芥和4種甘藍(lán)型油菜總DNA。黑芥DNA采用缺口平移法以地高辛(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)標(biāo)記作為探針。將甘藍(lán)型油菜的DNA在沸水中煮15 min左右，將其切為200 bp左右的片段用作封阻DNA。將標(biāo)記好的探針與封阻DNA用于基因組原位雜交。

在盛花期取三基因組雙倍體的花蕾，立即放入卡諾固定液(無(wú)水乙醇與冰乙酸體積為3∶1的混合液)固定24 h以上，然后轉(zhuǎn)入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇中于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。試?yàn)時(shí)，先取固定好的適宜大小(花粉母細(xì)胞正處于減數(shù)分裂終變期)的花蕾，取出花藥在檸檬酸緩沖液中浸泡20 min左右并在搖床上搖動(dòng)，洗去花藥表面的乙醇，然后將花藥取出放入混合酶液中酶解1 h左右，混合酶液由質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%蝸牛酶(北京百泰生物藥業(yè))、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%果膠酶(Merck,German)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%纖維素酶(Yakult Honsha)組成；將酶解后的花藥置于潔凈的載玻片上破碎，使花粉母細(xì)胞散出，滴加卡諾固定液使花粉母細(xì)胞均勻分散在載玻片的中央，并迅速將固定液點(diǎn)燃使花粉母細(xì)胞附著于載玻片上；每張載玻片上加雜交混合液50 μL(包含探針、封阻DNA和緩沖液的混合物)，37 ℃恒溫箱中過(guò)夜。將未雜交的信號(hào)洗脫后加抗FITC抗體(Sigma,America)檢測(cè)生物素探針，然后加體積分?jǐn)?shù)0.2% 4-6-二脒基-2苯基吲哚(DAPI，Roche,Sweden)對(duì)染色體復(fù)染，再加抗淬滅劑封片，在熒光顯微鏡(Olympus BX-51)下觀(guān)察并用CCD(DP-70)拍照。

2　結(jié)果與分析

2.1三基因組雙倍體植株表型及花粉育性

以黑芥為母本時(shí)，4個(gè)甘藍(lán)型油菜作為父本均以2.5%～5.3%的頻率獲得了三倍體雜種(ABC)。而反交組合中只有‘陜油15’與黑芥組合以極低的頻率(0.4%)獲得了三倍體雜種，其他3個(gè)組合均未得到雜種后代。各個(gè)雜交組合的三倍體雜種經(jīng)秋水仙堿處理后都獲得了相應(yīng)的雙倍體，雙倍體的獲得頻率為10%～20%。

雙倍體植株與三倍體相比，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)更加旺盛，其植株高度增加，莖稈更粗壯，葉片更大且厚(圖1-A)；花蕾明顯增大，可以作為鑒定雙倍體的重要指標(biāo)。經(jīng)有絲分裂染色體計(jì)數(shù)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，雙倍植株體細(xì)胞含有54條染色體，說(shuō)明秋水仙堿加倍成功(圖1-B)。

圖 1　甘藍(lán)型油菜與黑芥雜交所得三基因組雙倍體植株的表現(xiàn)(A)和體細(xì)胞有絲分裂染色體的觀(guān)察(B)Fig.1　Morphology(A) and mitosis(B) of amphiploids between B.napus and B.nigra

雙倍體植株的花也比較大，雄蕊比三倍體的雄蕊長(zhǎng)，接近柱頭，而三倍體雄蕊不到雌蕊長(zhǎng)度的一半；而且花藥發(fā)育更加充分，比較飽滿(mǎn)；開(kāi)花期花藥破裂，可以觀(guān)察到有少量花粉散出；三倍體花藥不飽滿(mǎn)，未觀(guān)察到散粉現(xiàn)象。經(jīng)醋酸洋紅染色在顯微鏡下觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，雙倍體可育花粉占總花粉數(shù)的 10%～20%。在套袋自交的情況下，胚珠不發(fā)育，不能形成種子。但在田間開(kāi)放授粉條件下，有部分角果形成少量種子，表明雙倍體雌配子育性也得到一定恢復(fù)，通過(guò)與甘藍(lán)型油菜回交可能產(chǎn)生回交后代。

2.2三基因組雙倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期的染色體聯(lián)會(huì)

原位雜交后對(duì)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的觀(guān)察結(jié)果(表1)顯示，甘藍(lán)型油菜與黑芥雜交所得三基因組雙倍體在減數(shù)分裂終變期染色體以形成二價(jià)體為主，其中B基因組染色體在每個(gè)花粉母細(xì)胞里形成的同配二價(jià)體數(shù)平均為7.28～7.58個(gè)，有些細(xì)胞B基因組的染色體全部進(jìn)行同源配對(duì)形成8個(gè)二價(jià)體(圖2-A1，A2)，每個(gè)細(xì)胞最少形成5個(gè)二價(jià)體。AC基因組染色體在每個(gè)花粉母細(xì)胞里形成的同配二價(jià)體數(shù)平均為17.48～18.00個(gè)，部分細(xì)胞里AC基因組的染色體全部?jī)蓛膳鋵?duì)形成19個(gè)二價(jià)體。除了形成二價(jià)體外，還有少部分染色體形成四價(jià)體。A、B、C 3個(gè)基因組間部分同源關(guān)系可能導(dǎo)致形成四價(jià)體，尤其是A與C基因組間的親緣關(guān)系比較近，染色體間的部分同源程度更高。四價(jià)體的形成有3種形式：4條B基因組染色體形成四價(jià)體，4條AC基因組染色體形成四價(jià)體，2條B基因組染色體和2條AC基因組染色體形成異配四價(jià)體(圖2-B1，B2)；每個(gè)花粉母細(xì)胞中B基因組染色體形成的四價(jià)體數(shù)平均為0.18～0.31個(gè)；AC基因組形成的四價(jià)體數(shù)平均為0.39～0.54個(gè)；而B(niǎo)基因組與AC基因組形成的異配四價(jià)體數(shù)平均為0.20～0.39個(gè)。其他類(lèi)型的染色體聯(lián)會(huì)構(gòu)型也有發(fā)現(xiàn)，但頻率極低。

表 1　甘藍(lán)型油菜與黑芥三基因組雙倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂終變期的染色體聯(lián)會(huì)觀(guān)察結(jié)果Table 1　Chromosome associations in pollen mother cells (PMC) of trigenomic amphiploids between B.napus and B.nigra at diakinesis

注：ⅡBB.B基因組染色體形成的二價(jià)體；ⅡAACC.AC基因組染色體形成的二價(jià)體；ⅣBB.B 基因組染色體形成的四價(jià)體；ⅣBB-AACC.B基因組與AC基因組間染色體形成的四價(jià)體；ⅣAACC.AC基因組染色體形成的四價(jià)體；Ⅵ.六價(jià)體；每個(gè)組合第1行數(shù)字表示平均值，第2行數(shù)字表示變化范圍。

Note:ⅡBB.Bivalent of B genome;ⅡAACC.Bivalent of AC genomes;ⅣBB.Tetravalent of B genome;ⅣBB-AACC.Tetravalent between B genome and AC genome;ⅣAACC.Tetravalent of AC genome;Ⅵ.Hexavalent.The first line in each square means the average value and the second means the range.

圖 2　甘藍(lán)型油菜與黑芥三基因組雙倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂染色體聯(lián)會(huì)和分離的原位雜交圖像 A1,B1,C1.DAPI(藍(lán)色)染色的染色體圖像;A2,B2,C2.DAPI圖像與探針信號(hào)融合圖像，綠色信號(hào)來(lái)自黑芥基因組探針。A1,A2.16個(gè)黑芥 染色體形成8個(gè)同源二價(jià)體的終變期花粉母細(xì)胞；B1,B2.甘藍(lán)型油菜AC基因組與黑芥B基因組形成1個(gè)異配四價(jià)體(箭頭所示)的 終變期花粉母細(xì)胞；C1,C2.黑芥染色體9∶7分離并有一條甘藍(lán)型油菜染色體落后(箭頭所示)的后期Ⅰ花粉母細(xì)胞。標(biāo)尺=10 μmFig.2　GISH analyses of chromosome pairings and segregation in PMCs of trigenomic amphiploids A1,B1,C1.DAPI (blue) images;A2,B2,C2.Merged images, green signals are from B.nigra probe. A1,A2.One diakinesis PMC with 8 bivalents of B genome;B1,B2.One diakinesis PMCs of with one allo-tetravalent (arrowed) between B gemone and AC genomes;C1,C2.One AI PMC with 9∶7 segregation of B genome and a lagged chromosome of AC genomes(arrowed).Bar=10 μm

2.3三基因組雙倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期的染色體分離

經(jīng)基因組加倍獲得的雙倍體染色體分離，以 27∶27的比例均等分離細(xì)胞占總觀(guān)察細(xì)胞數(shù)的70%左右，而且在絕大多數(shù)均等分離的細(xì)胞中，B基因組和AC基因組染色體也是均等分離的。同時(shí)，染色體不均等分離的細(xì)胞以較低的頻率出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為總?cè)旧w不均等分離以及B和AC基因組染色體不均等分離?？?cè)旧w不均等分離主要表現(xiàn)為28∶26、29∶25和30∶24的分離形式；B基因組染色體不均等分離主要表現(xiàn)為9∶7(圖2-C1，C2)和10∶6的分離形式；AC基因組不均等分離主要表現(xiàn)為20∶18和21∶17的分離形式。在染色體分離過(guò)程中，有少數(shù)染色體形成染色體橋或落后染色體(圖2-C1，C2)。第2次減數(shù)分裂與相應(yīng)的三倍體相比表現(xiàn)得比較有規(guī)律，形成四分孢子的比例達(dá)到90%以上。不正常的減數(shù)分裂現(xiàn)象主要表現(xiàn)為非四分孢子和微核的形成。除了形成四分孢子以外，還有五分孢子和六分孢子出現(xiàn)，出現(xiàn)的頻率分別為6%和2%；而且在第2次減數(shù)分裂結(jié)束后，還有少數(shù)細(xì)胞可以產(chǎn)生由少數(shù)染色體或染色體片段形成的微核，微核可能無(wú)法進(jìn)入子細(xì)胞核而丟失。

3　討論與結(jié)論

本研究通過(guò)秋水仙堿處理獲得雙倍體的效率比較高，而且加倍完整，無(wú)嵌合體形成。經(jīng)過(guò)遠(yuǎn)緣雜交和染色體組加倍形成雙倍體后，雙親的遺傳物質(zhì)便發(fā)生劇烈的變化，使得雙倍體雜種減數(shù)分裂表現(xiàn)出二倍體的特征，即同源染色體進(jìn)行配對(duì)[11]，而且隨著減數(shù)分裂期染色體行為的二倍體化，雙倍體的育性也會(huì)得到較好的恢復(fù)[12]。本研究中獲得的雙倍體育性仍然很低，可育花粉所占比例非常低，而且自由傳粉條件下結(jié)實(shí)率也不高，表明雌配子育性恢復(fù)不好。雙倍體育性恢復(fù)差的現(xiàn)象在蕓薹屬其他植物的雜交中也有發(fā)生[13]。本研究獲得的三基因組雙倍體在減數(shù)分裂終變期染色體主要進(jìn)行同源聯(lián)會(huì)形成二價(jià)體，但由于A(yíng)、B、C基因組親緣關(guān)系比較近，尤其是A和C基因組之間親緣關(guān)系更近，因此有部分染色體形成了四價(jià)體，甚至六價(jià)體。嚴(yán)格的同源染色體配對(duì)是二倍體植物形成可育配子的前提，雙倍體中多價(jià)體的形成勢(shì)必會(huì)影響減數(shù)分裂后期Ⅰ染色體分離從而導(dǎo)致染色體不均等分離，結(jié)果使產(chǎn)生配子的遺傳平衡被打破，導(dǎo)致配子育性下降或產(chǎn)生非整倍體后代[14]。本研究中的雙倍體不完全正常的染色體聯(lián)會(huì)(除大部分染色體形成二價(jià)體外，還有一定數(shù)量的多價(jià)體形成)導(dǎo)致減數(shù)分裂后期Ⅰ染色體分離紊亂，均等分離的細(xì)胞僅占70%，而且還發(fā)現(xiàn)染色體橋和落后染色體。由此可以推測(cè)，這種不正常的減數(shù)分裂行為是導(dǎo)致雙倍體花粉育性低的重要原因。在埃塞俄比亞芥與白菜雜交獲得的蕓薹屬三基因組雙倍體(AACCBB)中，花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中染色體表現(xiàn)出較好的二倍體遺傳特征，同緣染色體配對(duì)的頻率和減數(shù)分裂后期Ⅰ均等分離的比例都比較高，因此花粉育性也比較高，但是在自交后代中，仍然有較大比例的非整倍體出現(xiàn)[7，15]。本研究所得雙倍體花粉育性只有10%～20%，可能是由于所用親本不同導(dǎo)致。雖然雜種都含有相同的遺傳物質(zhì)，但是細(xì)胞質(zhì)的影響也會(huì)引起性狀的差異，而且來(lái)自不同親本的同一基因組之間也會(huì)存在一定的差異。

在異源多倍體形成的早期世代，非正常減數(shù)分裂產(chǎn)生的配子育性喪失也許是異源多倍體形成過(guò)程中促細(xì)胞減數(shù)分裂二倍體化的一個(gè)因素。減數(shù)分裂過(guò)程中，染色體不能全部進(jìn)行同源配對(duì)，將導(dǎo)致后期Ⅰ染色體向兩極不均等的分離，結(jié)果極可能使形成的配子染色體數(shù)目異常，染色體數(shù)異常的配子極可能是不育的配子，尤其是染色體數(shù)目減少的配子。經(jīng)過(guò)多代對(duì)異常配子的選擇，可以使細(xì)胞的減數(shù)分裂趨于正常[16]。埃塞俄比亞芥與白菜雜交合成的蕓薹屬雙倍體由于非整倍體的大量存在，也表現(xiàn)出育性下降的特點(diǎn)，但隨著連續(xù)自交，花粉育性得到恢復(fù)[7]。本研究從花粉細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程入手分析花粉不育的原因，找到了影響花粉育性的證據(jù)，所獲得的三基因組雙倍體減數(shù)分裂過(guò)程表現(xiàn)出較多異?，F(xiàn)象，如多價(jià)體的形成、染色體不均等分離、染色體橋和落后染色體等。不正常的減數(shù)分裂勢(shì)必會(huì)影響遺傳物質(zhì)在子細(xì)胞中的平衡分配，因此產(chǎn)生了大量的不育花粉。人工合成的多倍體雖然經(jīng)歷了雄性不育對(duì)配子的選擇，但不可能在短期世代后達(dá)到遺傳平衡,只有經(jīng)歷多代自交或回交后配子育性才能較好恢復(fù)。由此可以推測(cè)，人工合成的異源多倍體的遺傳物質(zhì)恢復(fù)平衡要經(jīng)歷一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程，這也是當(dāng)前僅有極少數(shù)人工合成多倍體用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的原因。

雖然人工多倍體早期世代減數(shù)分裂出現(xiàn)非正常的染色體聯(lián)會(huì)，使多倍體表現(xiàn)出遺傳不穩(wěn)定等不利現(xiàn)象。但是來(lái)自不同親本的染色體之間的聯(lián)會(huì)是雙親之間遺傳物質(zhì)交換的前提，異源多價(jià)體的形成為雙親優(yōu)良基因的聚合提供了可能。本研究的雙倍體B基因組與AC基因組染色體進(jìn)行異配形成四價(jià)體在細(xì)胞中以較高的頻率出現(xiàn)，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)達(dá)到 0.20～0.39，不同基因組內(nèi)的聯(lián)會(huì)為遺傳物質(zhì)在基因組之間的交換提供了條件，使黑芥優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜成為可能。雖然雙倍體的雌雄配子的育性都比較低，但在田間開(kāi)放條件下仍有少量種子產(chǎn)生，表明通過(guò)回交可以獲得雜種后代，為創(chuàng)建甘藍(lán)型油菜的附加系和代換系提供了可能。

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Insituhybridization analysis on meiosis ofBrassicanapusandBrassicanigraamphiploids

CHEN Jipeng,LI Shengqiang,LIU Xianjun,QUE Zhiqun

(CollegeofLifeScienceEnvironmentandResource,YichunUniversity,Yichun,Jiangxi336000,China)

【Objective】 This study investigated the relationship between abnormal meiosis and pollen fertility of plant hybrid offspring. 【Method】 Trigenomic amphiploids betweenBrassicanapusandBrassicanigrawere obtained by interspecific hybridization and genome doubling.Genomicinsituhybridization (GISH) was carried out to observe chromosome behavior in meiosis of pollen mother cells (PMC) of the amphiploids.【Result】 Pollen fertility of the amphiploids was determined and majority of pollen grains was sterile with fertile ratio of 10%-20%.Multivalents were formed as quadrivalents and hexavalents at diakinesis.The quadrivalents included autosyndetic quadrivalents of B genome,AC genomes and allosyndetic quadrivalents betwee B and AC genomes.The hexavalents also appeared in amphiploids at very low frequencies.Total chromosomes were segregated equally at about 70% PMCs at anaphase Ⅰ.At the end of second stage of meiosis,non-tetrads and micro-nucleus were also observed.Some abnormalities including chromosome bridges and laggards were observed at low frequency in some PMCs at anaphase Ⅱ/Ⅱ.【Conclusion】 The non-diploidized cytological behavior of these amphiploids contributed to their low fertility.Although abnormal meiosis decreased pollen fertility,heterologous recombination improved exchange of genetic materials between parents.

Brassicanapus;Brassicanigra;meiosis;genomicinsituhybridization; male sterility

時(shí)間:2016-09-0709:02DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.10.007

2015-04-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460357)；江西省科技支撐項(xiàng)目(20141BBF60010)；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20151BAB204026)

陳紀(jì)鵬(1974-)，男，河南西平人，副教授，博士，主要從事油菜遠(yuǎn)緣雜交和細(xì)胞遺傳研究。

E-mail：chensi20020606@163.com

S565.403.51

A

1671-9387(2016)10-0045-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160907.0902.014.html