山東省青州市濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院(青州262500)

楊洪濤 常維巍 呂 林

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丹參口服液對(duì)口腔種植體骨結(jié)合的影響及機(jī)制探討*

山東省青州市濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院(青州262500)

楊洪濤 常維巍 呂 林

目的：通過(guò)建立家兔種植體模型,檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)的表達(dá)量,探討丹參口服液對(duì)口腔種植體骨結(jié)合的影響及分子機(jī)制。方法：將18只家兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組各9只,均在家兔下頜雙側(cè)同一位置植入種植體各1枚。植入種植體的同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)組的家兔給于復(fù)方丹參口服液服用3周,分別于術(shù)后7 d、14 d、及21 d取種植體周圍組織通過(guò)RT-PCR、Western blot檢測(cè)TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)水平,并觀察兩組家兔種植體的穩(wěn)定性,于術(shù)后21 d時(shí)處死家兔做骨切片,采用HE染色通過(guò)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行骨組織形態(tài)學(xué)面積測(cè)量分析新生骨面積。結(jié)果：經(jīng)口服復(fù)方丹參液治療后實(shí)驗(yàn)組TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)水平、新骨組織形成量及新生骨面積明顯增加,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論：復(fù)方丹參口服液能促進(jìn)口腔種植體骨結(jié)合作用,其機(jī)制與上調(diào)TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)相關(guān)。

鈦種植體能與骨組織產(chǎn)生骨性結(jié)合且具有良好的組織相容性,目前在口腔種植上應(yīng)用越來(lái)越多。由于牙周疾病、創(chuàng)傷等造成的骨缺損，以及牙槽骨吸收而導(dǎo)致的骨量不足從而影響種植體-骨結(jié)合率下降及種植體成功率。 在實(shí)施種植后種植體與骨結(jié)合的牢固如否,會(huì)直接影響種植牙的質(zhì)量及效果,為更好的促進(jìn)種植體與骨結(jié)合能力和提高成功率,本實(shí)驗(yàn)探討通過(guò)丹參口服液上調(diào)組織中TGF-β1的表達(dá),對(duì)家兔口腔種植體骨結(jié)合的促進(jìn)作用,為臨床口腔種植體修復(fù)治療提供新的思路和方法。

材料與方法

1 材 料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年家兔18只,體重1500～1550 g(購(gòu)自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心)，雌雄各半單籠飼養(yǎng),分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每組9只；HE染色液(南京建成)；Trizol試劑盒(Invitrogen)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promegea)；PCR試劑盒(Promegea)；羊抗兔TGF-β1單克隆抗體(Santa Cruz)；辣根酶標(biāo)記二抗(博士德)；ECL發(fā)光試劑盒(Santa Cruz)；超凈工作臺(tái)(海爾)；低溫高速離心機(jī)(Sigma)；臺(tái)式離心機(jī)(Sigma)；恒溫?fù)u床(Thermo)；PCR儀(ABI 7200型)；DNA電泳儀(BioRad)；蛋白電泳儀(BioRad)；自動(dòng)凝膠成像分析儀(天能)；-86 ℃冰箱(Fuma)；鈦種植體(北京萊頓生物材料公司)；顯微鏡(Nikon)。

2 種植體植入 在家兔下頜雙側(cè)同一位置植入鈦種植體各1枚,植入種植體的同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)組的家兔給于復(fù)方丹參口服,服用3周。

3 新生骨面積計(jì)算 骨基質(zhì)呈嗜酸性染色,成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞核呈嗜堿性染色。每組隨機(jī)選取2張切片,每張切片于光鏡下(100倍)采圖3張,使用Adobe photoshop CS5將所采集的各組HE染色圖片中非骨組織部分刪去，只留余骨組織部分對(duì)成骨面積檢測(cè)。使用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)上面所得圖像進(jìn)行骨組織形態(tài)學(xué)面積測(cè)量,分析新生骨面積(Sbone)占成骨區(qū)總面積(Stotal)的相對(duì)百分比,計(jì)算公式:S= Sbone/Stotal。

4 定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成。TGF-β1上游引物：5，-GCAGTGGTTGAGCCGTGG-3，；下游引物：5，-GCTGAAGCAATAGTTGGTGTCC-3，；GAPDH上游引物：5，-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3，；下游引物：5，-TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3，。采用trizol法提取組織總RNA，取2 μg反轉(zhuǎn)錄成cDNA,定量PCR檢測(cè)TGF-β1mRNA表達(dá),以GAPDH為內(nèi)參照。反應(yīng)體系為:SYBR Green mix12.5μl,ddH2O 8.0 μl,上下游引物各1 μl,cDNA,2.5 μl,總體積25 μl。以2-△△Ct值表示各基因相對(duì)表達(dá)量。

5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取適當(dāng)大小組織塊加細(xì)胞裂解液裂解,經(jīng)蛋白定量變性后取樣品上樣電泳,轉(zhuǎn)膜、封閉、加一抗、二抗,加ECL發(fā)光試劑液X光片曝光顯色,進(jìn)行灰度分析。

結(jié) 果

1 新骨生成情況 7 d時(shí)對(duì)照組骨髓腔中發(fā)現(xiàn)有大量的顆粒,顆粒之間可見(jiàn)新生的纖維性基質(zhì)和類骨質(zhì)，周圍有許多成骨細(xì)胞以及部分骨髓組織,骨組織含量相對(duì)較少。實(shí)驗(yàn)組骨髓腔中發(fā)現(xiàn)復(fù)合顆粒溶解吸收,骨基質(zhì)開(kāi)始形成骨小梁,其周圍有大量的成骨細(xì)胞。而且與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組形成的新骨較多,新生骨組織中成骨細(xì)胞較少,骨組織相對(duì)成熟。14 d時(shí)對(duì)照組形成的骨小梁開(kāi)始連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，新骨內(nèi)可見(jiàn)大量骨細(xì)胞，新骨形成量增加。實(shí)驗(yàn)組新骨組織形成量明顯增加,骨小梁數(shù)目增加,變粗,粗大的骨小梁連接成較密集的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),均勻充填骨髓腔。21 d時(shí)對(duì)照組骨小梁粗大較密集,有大量骨細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組骨組織相對(duì)成熟,可見(jiàn)明顯的鈣化,纖維基質(zhì)基本吸收,骨細(xì)胞數(shù)多。

2 新生骨面積 見(jiàn)附表。新生骨面積隨觀察時(shí)間延長(zhǎng)而增加,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

附表 兩組新生骨面積的比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

3 TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá) 見(jiàn)圖1、2。mRNA相對(duì)表達(dá)量：對(duì)照組7 d、14 d、21 d分別為0.553±0.012；1.043±0.018；1.77±0.021；實(shí)驗(yàn)組7 d、14 d、21 d分別為0.957±0.024；2.653±0.032；3.857±0.063。蛋白表達(dá)：對(duì)照組7 d、14 d、21 d分別為1.167±0.015；2.107±0.014；2.54±0.011；實(shí)驗(yàn)組7 d、14 d、21 d分別為2.44±0.018；4.253±0.021；5.39±0.024。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 兩組TGF-β1 mRNA表達(dá)

圖2 兩組TGF-β1蛋白表達(dá)

討 論

丹參為臨床常用藥,具有抗心肌缺血,擴(kuò)冠狀動(dòng)脈,抗心律失常和活血化瘀等藥理作用[1]。有研究報(bào)道[2]復(fù)方丹參可以促進(jìn)家兔骨折中期骨愈合,在骨折愈合的中期復(fù)方丹參可以促進(jìn)TGF-β1的表達(dá),其可能是通過(guò)增加TGF-β1的表達(dá)而促進(jìn)家兔骨折中期骨愈合。然而,復(fù)方丹參是否能促進(jìn)口腔種植體骨結(jié)合未見(jiàn)有報(bào)道，種植體-骨界面骨整合的獲得是種植體成功的關(guān)鍵。研究表明,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族成員在發(fā)育和組織內(nèi)具有多功能生長(zhǎng)因子作用,能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、死亡或凋亡、細(xì)胞分化及細(xì)胞外基質(zhì)合成等生物學(xué)功能[3-4]。TGF-β1是重要的促纖維生長(zhǎng)因子,能直接促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖,并促使肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞等合成分泌細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)膠原、骨結(jié)合蛋白、糖蛋白等合成，參與體內(nèi)生理生化、信號(hào)轉(zhuǎn)到與調(diào)控,及促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化增殖[5]。關(guān)于TGF-β1與很多相關(guān)疾病的報(bào)道較多并引起關(guān)注,有關(guān)中藥對(duì)TGF-β1調(diào)控研究報(bào)道較少。因此，本研究采用中藥復(fù)方丹參口服液治療及觀察家兔種植體的穩(wěn)定性,探討其對(duì)口腔種植體骨結(jié)合的促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示7 d時(shí)對(duì)照組骨髓腔中發(fā)現(xiàn)有大量的顆粒，顆粒之間可見(jiàn)新生的纖維性基質(zhì)和類骨質(zhì)，周圍有許多成骨細(xì)胞以及部分骨髓組織，骨組織含量相對(duì)較少。實(shí)驗(yàn)組骨髓腔中發(fā)現(xiàn)復(fù)合顆粒溶解吸收，骨基質(zhì)開(kāi)始形成骨小梁，其周圍有大量的成骨細(xì)胞。而且與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組形成的新骨較多，新生骨組織中成骨細(xì)胞較少，骨組織相對(duì)成熟。14 d時(shí)對(duì)照組形成的骨小梁開(kāi)始連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，新骨內(nèi)可見(jiàn)大量骨細(xì)胞，新骨形成量增加。實(shí)驗(yàn)組新骨組織形成量明顯增加，骨小梁數(shù)目增加，變粗，粗大的骨小梁連接成較密集的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，均勻充填骨髓腔。21 d時(shí)對(duì)照組骨小梁粗大較密集，有大量骨細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組骨組織相對(duì)成熟,可見(jiàn)明顯的鈣化，纖維基質(zhì)基本吸收,骨細(xì)胞數(shù)多。新生骨面積隨術(shù)后觀察時(shí)間延長(zhǎng)而增加,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)相同也隨術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)而增加,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明復(fù)方丹參口服液能上調(diào)TGF-β1 mRNA的表達(dá)有利于新骨生成,TGF-β1對(duì)上皮細(xì)胞具有趨化增殖作用,促進(jìn)膠原基質(zhì)黏附及創(chuàng)傷愈合[6-7]。提示中藥復(fù)方丹參口服液可以上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的表達(dá)從而間接促進(jìn)種植體骨結(jié)合。與文獻(xiàn)報(bào)道[2]基本相同,但不同的是本研究結(jié)果顯示復(fù)方丹參口服液對(duì)術(shù)后各期的TGF-β1 mRNA和蛋白的表達(dá)都有上調(diào)和促進(jìn)作用。參與促進(jìn)種植體骨結(jié)合作用的可能有多種因子有待于進(jìn)一步深入研究和探討。將中醫(yī)常用藥物丹參口服液運(yùn)用到現(xiàn)代口腔種植骨結(jié)合的治療,有利于促進(jìn)口腔種植體的治療及技術(shù)的完善和提高種植體的穩(wěn)定性,拓展傳統(tǒng)中醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的結(jié)合,讓傳統(tǒng)中醫(yī)藥應(yīng)用有廣闊的前景。

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(收稿：2016-04-01)

*山東省濰坊市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201302131)

牙種植體,單牙 骨結(jié)合 丹參口服液 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

R783.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.002