西安市兒童醫(yī)院小兒外科(西安710003)

郭 朝 徐 泉▲

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激活PPAR-γ上調(diào)PTEN抑制人腎母細胞瘤G401細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的實驗研究

西安市兒童醫(yī)院小兒外科(西安710003)

郭 朝 徐 泉▲

目的：研究羅格列酮對人腎母細胞瘤細胞G401增殖、遷移和侵襲能力的影響,并探討其相關機制。方法：體外培養(yǎng)G401,不同濃度的羅格列酮干預G401細胞,MTT法測定細胞增殖的抑制率。選擇最合適的羅格列酮濃度(10 μmol/L)干預細胞,用劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力的變化,Transwell侵襲小室實驗檢測細胞侵襲能力的變化,Western blot檢測PPAR-γ、PTEN、T-AKT、P-AKT、MMP-2、MMP-9蛋白水平變化；RT-PCR檢測PTEN、MMP-2、MMP-9的mRNA表達變化。結(jié)果：羅格列酮可以顯著抑制G401細胞增值,并呈濃度和時間依賴性(P<0.05)；羅格列酮可以顯著抑制G401細胞的遷移和侵襲能力(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示羅格列酮可以上調(diào)PPAR-γ、PTEN的蛋白水平,下調(diào)P-AKT、MMP-2、MMP-9水平；RT-PCR結(jié)果顯示羅格列酮可以上調(diào)PTEN的mRNA水平,下調(diào)MMP-2、MMP-9的mRNA水平。結(jié)論：羅格列酮可抑制腎母細胞瘤細胞G401的增殖,其分子機制可能與激活PPAR-γ,上調(diào) PTEN、抑制PI3K/AKT信號通路有關；羅格列酮抑制G401細胞遷移和侵襲能力主要是通過激活PPAR-γ,抑制MMP-2和MMP-9 的表達實現(xiàn)。

腎母細胞瘤是小兒最常見的惡性腫瘤之一，約占兒童惡性腫瘤的6%,泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的95%以上。目前臨床多采用手術、放療及化療等綜合個體化治療方案,但是在治療過程中發(fā)現(xiàn)，常用的化療藥物如長春新堿、放線菌素D等均存在較大的肝腎毒性,而放療易引起放射性腸炎等并發(fā)癥。因此尋找新型干預藥物，并探討其具體作用機制,對防治腎母細胞瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要意義[1]。過氧化物酶體增生物激活受體-γ(PPAR-γ)是一種核轉(zhuǎn)錄受體,具有廣泛的組織、細胞保護作用[2]。磷脂酰肌醇3-激酶 (PI3K)是重要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導分子,通過催化磷脂酰肌醇(PI)磷酸化發(fā)揮作用,AKT是PI3K的下游靶基因，PI3K/AKT信號通路參與細胞增殖、遷移、分化,血管生成等一系列病理生理過程,在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[3]。10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因,其產(chǎn)物PTEN蛋白是 PI3K/AKT信號通路的內(nèi)源性負性調(diào)控蛋白,可通過其脂質(zhì)磷酸酶活性阻斷PI3K/AKT信號通路來實現(xiàn)其抑癌作用[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移關系密切,目前研究較多的為MMP-2和MMP-9[5]。研究證實,激活 PPAR-γ可抑制多種腫瘤細胞的增殖及其侵襲轉(zhuǎn)移[6]，但在腎母細胞瘤中尚無相關研究報道。本文探討激活PPAR-γ能否通過上調(diào) PTEN,抑制 PI3K/AKT信號通路,下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達,進而抑制腎母細胞瘤細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。

材料和方法

1 材 料 人腎母細胞瘤細胞G401購自北京協(xié)和細胞資源中心,羅格列酮購自Sigma公司。McCoy's 5a培養(yǎng)基購自Gibco公司,胎牛血清購自杭州四季青公司。四甲基偶氮唑鹽(MTT) ,二甲基亞砜(DMSO) 均購自美國Sigma 公司。兔抗人PPAR-γ、PTEN、T-AKT、P-AKT、MMP-2、MMP-9單克隆抗體均購自Cell signaling technology(CST)公司,鼠抗人β-actin單克隆抗體,辣根酶(FITC)標記山羊抗鼠 IgG、山羊抗兔 IgG 二抗均購自北京中杉金橋公司。PTEN、MMP-2、MMP-9、β-actin基因引物由北京奧克鼎盛有限公司合成,反轉(zhuǎn)錄試劑盒和 RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司。

2 細胞培養(yǎng) 用含雙抗(青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml)的10% FBS-McCoy's 5a培養(yǎng)基培養(yǎng)人腎母細胞瘤細胞G401,置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中,細胞單層貼壁生長,至70 %～80 %融合度時,用0.25 %胰酶消化后傳代,取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

3 MTT法細胞增殖實驗 取對數(shù)生長期的G401細胞制成單細胞懸液，以4000個細胞/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板,每孔加培養(yǎng)基200 μl,于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待24 h細胞貼壁后,加入不同濃度的羅格列酮(0.1、1、10、100 μmol/L),分別培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h后終止。(以下操作均在避光條件下進行)每孔加入5 mg/ml MTT 溶液20 μl,細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h,棄上清液,每孔加入DMSO 150 μl,置酶標儀上振蕩10 mim。測波長為490 nm處的吸光度(OD)值。細胞增殖抑制率=(OD對照組-OD實驗組) /( OD對照組-OD空白組)，實驗重復3 次。

4 細胞劃痕愈合實驗 取對數(shù)生長期的G401細胞,制成單細胞懸液,接種于6孔培養(yǎng)板中。待細胞長滿培養(yǎng)板底層后,取一個干凈的10 μl無菌槍頭,用其尖端分別在 6 孔板的各組細胞上劃痕。用PBS漂洗2遍洗去被刮下的細胞,加入無血清培養(yǎng)基,然后分為對照組及羅格列酮組(10 μmol/L)。在細胞倒置顯微鏡下觀察劃痕寬度,取各組細胞培養(yǎng)孔中劃痕寬度相等的位置照相,并做標記。將細胞放置于37℃，5 % CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),24 h及48 h后觀察同一位置的細胞遷移情況,再次照相。細胞遷移指數(shù) =[24(48)h劃痕面積]/初始劃痕面積(0 h),實驗重復3 次。

5 Transwell小室侵襲實驗 將Matrigel基質(zhì)膠用預冷的無血清McCoy's 5a培養(yǎng)基按1∶6的比例稀釋,取100μl稀釋的基質(zhì)膠加入到Transwell小室的上室中,放入細胞培養(yǎng)箱4 h或過夜。取對數(shù)生長期的細胞,分為對照組及羅格列酮組(10umol/L)分別干預24 h,用1% FBS-McCoy's 5a培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整到5×105/ml。24孔板Transwell小室上室加入200 μl細胞懸液,下室加入500 μl 1%FBS-McCoy's 5a培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS清洗,多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色,擦去上室細胞,顯微鏡下計數(shù)。取5個視野(上、中、下、左、右),照相、計數(shù),實驗重復3 次。

6 Western-blot 檢測PPAR-γ、PTEN、T-AKT、P-AKT、MMP-2、MMP-9蛋白的表達 取對數(shù)生長期的G401細胞,制成單細胞懸液,接種于6孔培養(yǎng)板中,于 37℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞長至60 %～70 %時，分為對照組及羅格列酮組(10 μmol/L),48 h后,用RIPA細胞裂解液提取各組細胞總蛋白,使用BCA法測定蛋白濃度；SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳,使用半干轉(zhuǎn)膜法,將蛋白轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上；將PVDF膜放入5 % 脫脂牛奶中室溫封閉2 h,加一抗孵育；4 ℃過夜；PBST 洗膜,10 min×3 次；二抗孵育,室溫2 h；PBST；洗膜,10 min×3次；使用BIO-RAD 成像系統(tǒng)檢測條帶,分析結(jié)果,實驗重復3 次。

7 RT-PCR檢測PTEN、MMP-2、MMP-9、β-actin的mRNA表達變化 細胞培養(yǎng)及分組同上,24 h收獲細胞,按照說明書提取細胞總RNA,測定其完成度和純度,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,以β-actin為內(nèi)參照。β-actin上游引物序列5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3',下游引物序列:5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3'；PTEN上游引物序列5'-ACCAGTGGCACTGTTGTTTCAC-3',下游引物序列5'-TCCTCTGGTCCTGGTATGAAG-3'；MMP-2上游引物序列5'-GATACCCCTTTGACGGTAAGGA-3',下游引物序列5'-CCTTCTCCCAAGGTCCATAGC-3'；MMP-9上游引物5’-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3',下游引物5'-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3'。反應條件為：95℃預變性3 min，94 ℃變性30 s,相應退火溫度(55～ 62℃) 30 s,72℃延伸30 s,35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min,4 ℃冷卻。產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,BIO-RAD 成像系統(tǒng)檢測條帶并拍照。條帶分析,將目標條帶與β-actin帶的吸光度值之比作為其 mRNA 表達水平的參數(shù),實驗重復3 次。

結(jié) 果

1 羅格列酮抑制G401細胞增殖的作用 見圖1。羅格列酮能夠明顯抑制G401細胞的增殖,具有時間及濃度依賴性(P<0.05)。

圖1 羅格列酮對G401細胞的抑制作用

2 羅格列酮抑制G401細胞的遷移能力 見圖2。將細胞分為對照組、羅格列酮組(10 μmol/L),分別干預24 h及48 h,通過劃痕實驗檢測各組G401細胞遷移能力的變化。干預24 h后,正常對照組的遷移指數(shù)為0.444±0.0823,羅格列酮組的遷移指數(shù)為0.778±0.0437；干預48 h后,正常對照組的遷移指數(shù)為0.110±0.0320，劃痕幾乎已經(jīng)全部愈合,羅格列酮組的遷移指數(shù)為0.446±0.0855；兩組之間相比,羅格列酮明顯抑制了G401細胞的遷移,差異具有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。

與對照組比較，* P<0.05

3 羅格列酮抑制G401細胞的侵襲能力 見圖3。將細胞分為對照組、羅格列酮組(10 μmol/L),干預24 h,通過Transwell小室侵襲實驗檢測兩組G401細胞的侵襲能力的變化。對照組的穿膜細胞數(shù)為267.333±50.4個,羅格列酮組的穿膜細胞數(shù)為118±35.028個,羅格列酮顯著抑制了G401細胞的侵襲能力,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 羅格列酮抑制G401細胞的侵襲能力

4 羅格列酮對G401細胞PPAR-γ、PTEN、T-AKT、P-AKT、MMP-2、MMP-9蛋白水平的影響 見圖4。Western blot檢測結(jié)果顯示,羅格列酮干預后,G401細胞PPAR-γ、PTEN的水平升高，P-AKT、MMP-2、MMP-9的水平降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖4 羅格列酮對G401細胞PPAR-γ、PTEN、T-AKT、P-AKT、MMP-2、MMP-9蛋白水平的影響

5 羅格列酮對G401細胞PTEN、MMP-2、MMP-9mRNA表達水平的影響 見圖5。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，羅格列酮干預細胞后,PTEN mRNA的表達水平明顯升高,MMP-2、MMP-9 mRNA的表達水平顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖5 羅格列酮對G401細胞PTEN、MMP-2、MMP-9mRNA表達水平的影響

討 論

羅格列酮是一種高選擇性、強效的PPAR- γ激動劑,它激活 PPAR-γ核受體后,可以促進葡萄糖合成、轉(zhuǎn)運及胰島素增敏,臨床上多用于治療2 型糖尿病[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn),羅格列酮對于多種腫瘤具有一定的抑制作用,如肝癌[8]、胰腺癌等。本試驗證實羅格列酮可以抑制腎母細胞瘤G401細胞的增殖,進一步研究發(fā)現(xiàn)羅格列酮可以上調(diào)G401細胞的PPAR-γ的mRNA和蛋白表達水平,下調(diào)AKT的磷酸化水平。

PPAR-γ在細胞分化、增殖、生長、炎癥、凋亡及血管形成等多方面中發(fā)揮重要作用。目前多項研究表明 PPAR-γ與腫瘤疾病關系密切,Han等[9]研究發(fā)現(xiàn),羅格列酮可以通過激活 PPAR-γ依賴信號通路,即PTEN-PI3K/AKT信號通路抑制人肺癌細胞的增殖過程。PPAR-γ與配體結(jié)合后,可形成活性轉(zhuǎn)錄因子,再與類維甲酸核內(nèi)受體RXR)形成轉(zhuǎn)錄復合體，最終與PPAR-γ反應活性原件(PPRE)結(jié)合,參與調(diào)控多種目的基因的轉(zhuǎn)錄,包括 PTEN 基因。PTEN 是一種內(nèi)源性PI3K/AKT信號通路的調(diào)控因子,可通過PI3K介導的信號通路,發(fā)揮調(diào)控腫瘤細胞增殖、生長及凋亡的作用[10]。本試驗中我們發(fā)現(xiàn),羅格列酮可以激活PPAR-γ,上調(diào)其表達水平,進而從mRNA及蛋白水平上調(diào)PTEN的表達,提示羅格列酮可通過增加PTEN的轉(zhuǎn)錄和表達,抑制PI3K/AKT信號通路，從而發(fā)揮抑制腎母細胞瘤細胞增殖的作用。

MMPs是降解細胞外基質(zhì)的重要成分,在腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用,特別是MMP-2和MMP-9[11]。本試驗發(fā)現(xiàn),羅格列酮可抑制G401細胞的遷移能力和侵襲能力；同時MMP-2、MMP-9的mRNA及蛋白表達水平均明顯下調(diào),提示羅格列酮可能通過下調(diào)MMP-2和MMP-9的轉(zhuǎn)錄和表達,從而抑制了G401細胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述,羅格列酮可抑制腎母細胞瘤細胞G401的增殖,并呈濃度和時間依賴效應；其分子機制可能與激活PPAR-γ,上調(diào) PTEN、抑制PI3K/AKT信號通路有關。以上研究結(jié)果表明,激活PPAR-γ具有潛在的治療腎母細胞瘤的作用,為研發(fā)新的靶向治療藥物提供了新的思路。

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(收稿：2016-01-28)

▲通訊作者：西安交通大學第二附屬醫(yī)院

Wilms瘤 過氧化物酶體增生物激活受體-γ 磷脂酰肌醇3-激酶 基質(zhì)金屬蛋白酶 @羅格列酮

R737.11

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10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.006