鄭寶江 張一凡 王美娟 王海竹 徐啟江

(1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

東北茶藨子大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育

鄭寶江1張一凡1王美娟1王海竹1徐啟江2*

(1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

采用常規(guī)石蠟切片技術(shù)，對東北茶藨子大、小孢子發(fā)生以及雌、雄配子體發(fā)育進行了深入研究。結(jié)果顯示：(1)每朵花包含5個雄蕊，每個花藥包含四個藥室，小孢子母細胞減數(shù)分裂是同時型，四分小孢子包括正四面體型和左右對稱型，發(fā)育完善的花粉粒為二細胞型；(2)花藥壁發(fā)育類型為基本型，從外而內(nèi)依次為表皮、藥室內(nèi)壁、2層中層、絨氈層，共五層結(jié)構(gòu)，絨氈層為腺質(zhì)型；(3)胚囊發(fā)育為典型的蓼型，子房1室，胚珠倒生多數(shù)，雙珠被，厚珠心，線性四分大孢子；(4)花粉發(fā)育的不同階段均有異?，F(xiàn)象，導(dǎo)致花粉敗育。

東北茶藨子；大孢子發(fā)生；小孢子發(fā)生；雌配子體；雄配子體

東北茶藨子(Ribesmandshuricum(Maxim.)Kom.)，又稱為燈籠果，隸屬于茶藨子科(Ribesiaceae)茶藨子屬(Ribes)[1]。主要分布于黑龍江、吉林、遼寧、華北及西北各省(區(qū))[2]。朝鮮及俄羅斯東西伯利亞亦有分布。該種經(jīng)濟價值較高，有“第三代果樹”的稱號，果可食用，亦可制果醬或釀酒，又可入藥，同時也可作為庭院綠化樹種，極具開發(fā)利用價值。

經(jīng)野外觀察發(fā)現(xiàn)，東北茶藨子種群退化，無法正常繁殖，導(dǎo)致種群數(shù)量明顯減少，在國家重點保護野生植物的名錄第二批中將其列入國家Ⅱ級野生保護植物[3]，也是整個茶藨子科中唯一的國家級保護植物[4]。到目前為止，僅限于對于東北茶藨子分布、應(yīng)用價值等方面[5～8]進行研究，而針對其生殖生物學(xué)方面的研究則較少。本文針對東北茶藨子的大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體的發(fā)育過程進行深入研究，并分析其致危原因，從而為東北茶藨子的保護及利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

東北茶藨子(Ribesmandshuricum(Maxim.) Kom.)采自東北林業(yè)大學(xué)實驗林場。2013～2015年每年4月初至5月上旬，每隔兩天采集生長狀況不同的花蕾或花朵。用FAA固定，愛氏蘇木精染色，常規(guī)石蠟切片法制片，切片厚度為7 μm，采用Olympus AH-2型光學(xué)顯微鏡觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 小孢子發(fā)生

東北茶藨子為總狀花序，花為兩性花，每朵小花有5個雄蕊，此外，在每個花藥下面包含四個藥室(圖版Ⅰ:1)。采用橫切的辦法將早期花藥剖開觀察，結(jié)果顯示孢原細胞體積比較的龐大，最早出現(xiàn)的位置是在表皮下四個角隅處，從形態(tài)上來看，和附近其他的細胞有著比較明顯的區(qū)別(圖版Ⅰ:2)。觀測其分裂機理可以發(fā)現(xiàn)，最開始的分裂方式是平周分裂，演變成為最早的初生壁細胞和初生造孢細胞(圖版Ⅰ:3)，初生壁細胞繼續(xù)分裂形成除表皮以外的花藥壁其他結(jié)構(gòu)，初生造孢細胞分裂也并未結(jié)束，經(jīng)過多次的有絲分裂之后，由初生造孢細胞演變?yōu)榇紊戽呒毎?。該細胞從結(jié)構(gòu)來看，細胞核體積相對巨大，幾何形狀趨于多邊化，細胞質(zhì)濃度較高(圖版Ⅰ:4)。接下來次生造孢細胞要繼續(xù)分裂，最終形成無明顯液泡，核大，質(zhì)濃小孢子母細胞(圖版Ⅰ:5)。

在經(jīng)過上述細胞演變之后的小孢子母細胞繼續(xù)發(fā)育，由多邊形逐漸變成圓球形，開始進入減數(shù)分裂期，細胞之間逐漸分離為獨立的個體。在前期Ⅰ階段所經(jīng)歷的演變比較復(fù)雜，主要包含細線期、粗線期、等(圖版Ⅰ:5～7)、接下來就進入到中期Ⅰ(圖版Ⅰ:8)、后期Ⅰ(圖版Ⅰ:9)、末期Ⅰ(圖版Ⅰ:10)，隨后經(jīng)、中期Ⅱ(圖版Ⅰ:11)、后期Ⅱ(圖版Ⅰ:12～13)、末期Ⅱ(圖版Ⅰ:14)，最后形成小孢子四分體。東北茶藨子的四分小孢子存在兩種類型，正四面體(圖版Ⅰ:15)和左右對稱(圖版Ⅰ:16)，其胞質(zhì)分裂的過程中也未出現(xiàn)分隔壁，因此推斷為同時型。

在研究過程中，針對處在不同藥室及相同藥室下的小孢子進行觀察，發(fā)現(xiàn)處在同一個藥室下的小孢子母細胞減數(shù)分裂過程是同步的，但這種同步性并非絕對，少數(shù)會出現(xiàn)1～2個時期的差別。相同花藥的不同藥室之間則差別顯著，分裂過程不一致，常會有3～4個時期差別的小孢子出現(xiàn)在同一花藥。同花卻不同的花藥之間相差更大，甚至能觀察達到4～6個分裂期的區(qū)別，不同步性表現(xiàn)的更加明顯。

2.2 雄配子體發(fā)育

附著在小孢子外圍的胼胝質(zhì)將會慢慢溶解，小孢子便開始從四分體內(nèi)分離出來。經(jīng)過分離后的孢子細胞質(zhì)密度很大，而整體外形卻很小，細胞核處于中心區(qū)域(圖版Ⅰ:17)。之后，細胞質(zhì)逐漸呈現(xiàn)液泡化，孢子外形會隨之擴大，有時可觀察到類似于孔溝的結(jié)構(gòu)(圖版Ⅰ:18)，這便是初期處于單核狀態(tài)的小孢子。隨后小孢子細胞局部會存在一定程度收縮，大液泡會在中心區(qū)域逐漸形成，細胞核受到排擠，被擠到花藥壁處，并且出現(xiàn)新月狀外形，此時小孢子便處于單核靠邊時期(圖版Ⅰ:19)。之后，在花藥壁附近，小孢子細胞核會出現(xiàn)胞質(zhì)分裂現(xiàn)象，經(jīng)過分裂后的細胞核體積并不相等，圖版Ⅰ:20～21展示的是在分裂后期和末期，會形成兩個細胞，分別是營養(yǎng)細胞與生殖細胞，前者體型較大，后者體型較小，并且呈現(xiàn)凸透鏡狀，之后雄配子體逐漸成長，兩者之間細胞板溶解，離開花粉粒細胞壁的生殖核產(chǎn)生新的球狀生殖細胞，與營養(yǎng)細胞共存。在尚未進行散粉時，生殖細胞內(nèi)不再進行有絲分裂，因此對于東北茶藨子來說，其發(fā)育完善的花粉屬于二細胞型。

圖版Ⅰ 1.完整花藥橫切；2.孢原細胞；3.平周分裂后的初生壁細胞和初生造孢細胞；4.絨粘層下形態(tài)不規(guī)則的次生造孢細胞；5～7.減數(shù)分裂前期Ⅰ的小孢子母細胞；8.減數(shù)分裂中期Ⅰ；9.減數(shù)分裂后期Ⅰ；10.減數(shù)分裂末期Ⅰ；11.減數(shù)分裂中期Ⅱ；12.減數(shù)分裂后期Ⅱ?qū)⑿纬烧拿骟w型的小孢子母細胞；13.小孢子母細胞減數(shù)分裂后期Ⅱ?qū)⑿纬勺笥覍ΨQ的小孢子母細胞；14.減數(shù)分裂末期Ⅱ的小孢子母細胞；15～16.四分小孢子最終分化為四面體形和左右對稱形；17.胼胝質(zhì)溶解分離出單核小孢子；18.小孢子細胞質(zhì)略回縮；19.核靠邊明顯，液泡擠壓呈月牙型的小孢子；20～21.有絲分裂的后、末期，最后形成二細胞花粉；22.敗育花粉粒；23.空花粉囊；24.絨粘層發(fā)育異常的小孢子Plate Ⅰ 1.A crosscutting complete anther; 2.The archesporial cells of the stamens; 3.The parietal cells and the sporogenous cell are formed by the periclinal division; 4.Secondary sporogenous cells with irregular morphology under the tapetum; 5-7.ProphaseⅠof microspore mother cell meiosis; 8.Meiotic metaphaseⅠ; 9.Meiotic anaphaseⅠ; 10.Meiotic pelophaseⅠ; 11.Meiotic metaphaseⅡ; 12-13.Anaphase Ⅱ of microspore mother cell meiosis,two types will be formed; 14.Pelophase Ⅱ of microspore mother cell meiosis; 15-16.The microspore tetrads are tetrahefdral and decussate; 17.The uninucleate microspore having shedded from the microspore tetrads with callus dissolved; 18.Shrink slightly of cytoplasm; 19.As the vacuole expanding and extruding the nucleus to the edge,the microspore showed as a crescent moon; 20-21.Anaphase and pelophase of mitosis,forms bicelluar pollen; 22.Abortive pollen; 23.Empty pollen sacs; 24.The tapetum dysplasia of microspore

圖版Ⅱ 1～2.花藥壁5層，基本型；3.中間層細胞作為營養(yǎng)提供者被分解；4.單核小孢子時期，絨氈層開始原位解體；5.小孢子有絲分裂時期,絨氈層進一步解體,藥室內(nèi)壁纖維狀加厚；6.成熟花粉時,絨氈層原位消失；7.幼小胚珠縱切,示一個孢原細胞；8.大孢子母細胞；9.第一次減數(shù)分裂中期；10.第一次減數(shù)分裂后期；11.二分體；12.大孢子母細胞第二次減數(shù)分裂中期；13.直線型四分體；14.單核胚囊；15～16.二核胚囊，還可看到退化的大孢子；17.四核胚囊；18.成熟胚囊的兩個助細胞；19.成熟胚囊的卵細胞和三個反足細胞；20.相互靠近的兩個極核Plate Ⅱ 1-2.The anther wall has five layers,elementary type; 3.The middle layer is decomposed as a nutrition provider; 4.At the stage of uninucleate microspore,the tapetum is beginning to degenerate at its position; 5.At the mitosis of microspore,there is a further disintedration of the tapetum and fibrous thickening in endothecium; 6.At the stage of mature pollen,the tapetum disappeared in its original position; 7.Slitting young ovule,shows an archesporial cell; 8.Megaspore mother cell; 9.Meiotic metaphaseⅠ; 10.Meiotic anaphaseⅠ; 11.Dyad; 12.Metaphase Ⅱ of megaspore mother cell meiotic; 13.A linear tetrad; 14.Uninucleate embryo sac; 15-16.Two-nucleate embryo sac,still can see the degenerative megaspore; 17.Four-nucleate embryo sac; 18.Two synergids of the mature embryo sac; 19.To show egg and three antipodal cells in mature embryo sac; 20.Two polar nucleus coming together

實驗還觀察到在東北茶藨子花藥發(fā)育的整個過程中，不同時期均有出現(xiàn)發(fā)育異?，F(xiàn)象。其異常之處在于：單細胞花粉及成熟花粉時期均存在一些空花粉，形狀各異，無細胞內(nèi)含物(圖版Ⅰ:22)；來自于一朵花的雄蕊內(nèi)，可能存在無法進行發(fā)育的花藥或花粉囊，最終成為空花粉囊(圖版Ⅰ:23)；小孢子母細胞還未進行減數(shù)分裂時絨氈層發(fā)育異常，提前退化解體(圖版Ⅰ:24)。

2.3 花藥壁發(fā)育

東北茶藨子的花藥壁發(fā)育類型為基本型。花藥壁由要經(jīng)過平周分裂和垂周分裂的初生壁細胞和表皮共同構(gòu)成。當初生造孢細胞分裂形成次生造孢細胞最后發(fā)育為小孢子母細胞后，花粉壁差不多已實現(xiàn)了分化，從外至里其結(jié)構(gòu)分別為：表皮、藥室內(nèi)壁、兩層中層與絨氈層，共五層結(jié)構(gòu)(圖版Ⅱ:1～2)。表皮細胞由排列較緊密長方形細胞構(gòu)成，具有角質(zhì)層；藥室內(nèi)壁也是一層排列整齊的細胞；中層細胞呈扁平狀，為2層；絨氈層細胞比外面的藥壁細胞都大，且具有腺細胞的一般特征：液泡少而小、細胞質(zhì)濃、發(fā)育完全時為雙核。在小孢子母細胞減數(shù)分裂時，中層細胞趨于解體(圖版Ⅱ:3)。在小孢子發(fā)育過程中，絨氈層細胞原位解體(圖版Ⅱ:4～5)，屬于腺質(zhì)型絨氈層。成熟花粉時期，花藥壁只存留表皮和U形纖維加厚的藥室內(nèi)壁(圖版Ⅱ:6)。

2.4 大孢子發(fā)生

東北茶藨子子房為一室側(cè)模胎座，胚珠倒生，雙珠被，厚珠心。

胚珠開始發(fā)育，位于珠心處一細胞外形逐漸擴大，于周圍細胞差異明顯，即為孢原細胞(圖版Ⅱ:7)。之后，細胞外形及細胞核在短時期內(nèi)快速增大，細胞質(zhì)濃度增加，從而成長為大孢子母細胞(圖版Ⅱ:8)，大孢子母細胞與珠心表皮細胞之間有數(shù)層細胞相隔，由此可看出茶藨子胚珠應(yīng)該是厚珠心型。大孢子母細胞接著會進行減數(shù)分裂，分別經(jīng)歷分裂中期Ⅰ、后期Ⅰ與末期Ⅰ(圖版Ⅱ:9～11)后，便會生成一直列二分體(圖版Ⅱ:11)，隨后又會經(jīng)歷中期Ⅱ(圖版Ⅱ:12)，分別再次進行分裂，最終生成一直線性的大孢子四分體(圖版Ⅱ:13)，一般來說，位于珠孔端的3個大孢子會慢慢退化，余下位于合點端大孢子具功能。

2.5 雌配子體發(fā)育

功能大孢子逐漸發(fā)育，外形越來越大，其細胞質(zhì)中會產(chǎn)生數(shù)個液泡，從而生成單核胚囊(圖版Ⅱ:14)，接著它會進行核分裂生成二核胚囊，還依稀可以看到退化的大孢子(圖版Ⅱ:15～16)。新產(chǎn)生的兩個核各自會在珠孔端與合點端進行二次分裂，并且生成四核胚囊(圖版Ⅱ:17)，經(jīng)過分裂后的胚囊外形得到明顯擴大。繼續(xù)進行分裂，最終生成八核胚囊，由于其胚囊外形相對立體，縱橫兩向都得到了延伸，一個切面無法得到完整的切片，因此由三張圖來展示，圖版Ⅱ:18顯示珠孔端的兩個助細胞，圖版Ⅱ:19顯示相鄰切片上的卵細胞和三個反足細胞，圖版Ⅱ:20為上下極核相互靠近。

3 討論

3.1 東北茶藨子的胚胎學(xué)特性及系統(tǒng)學(xué)意義

從胚胎學(xué)角度分析，東北茶藨子具有以下特性：小孢子母細胞中所發(fā)生的減數(shù)分裂屬于同時型，產(chǎn)生正四面體和左右對稱的四分小孢子，成熟具功能的花粉粒為二細胞型，花藥絨氈層屬于腺質(zhì)；直線性大孢子四分體，發(fā)育完善的胚囊結(jié)構(gòu)為7細胞8核，典型的蓼型生長模式。

東北茶藨子是總狀花序，兩性花，本次試驗觀察到其子房具1室，胚珠多枚，倒生，具雙珠被和厚珠心，胚囊的發(fā)育類型為單孢子發(fā)生型，是典型的蓼形胚囊發(fā)育方式。一般認為，雙珠被、厚珠心，蓼型胚囊發(fā)育是屬于比較原始的胚胎學(xué)特征[9]。Hall也認為倒生胚珠比彎生胚珠及直生胚珠原始[10]，由此推測東北茶藨子在胚珠的形態(tài)發(fā)育中具有較明顯的原始特征。

胚胎學(xué)特征在植物系統(tǒng)進化過程中是比較穩(wěn)定保守的性狀，可以作為判定不同類群間親緣關(guān)系的重要參考依據(jù)之一。關(guān)于茶藨子屬植物的分類位置和屬下類群劃分，不同學(xué)者持有不同意見[11]。近年來存在的爭議主要在于茶藨子屬和虎耳草科之間分類的劃分，基于這些分歧，就目前僅有的關(guān)于虎耳草科胚胎學(xué)的研究[12]來看，其花藥具有4個小孢子囊，花藥壁的發(fā)育屬于基本型，成熟的花粉為2-細胞型花粉，厚珠心，雙珠被，線性大孢子四分體，胚囊發(fā)育為蓼型，胚囊成熟后為7細胞8核胚囊，以上均與東北茶藨子的胚胎特征相似，說明二者之間存在一定的親緣關(guān)系。

3.2 東北茶藨子花粉發(fā)育時期異?，F(xiàn)象分析

在單細胞花粉及成熟花粉時期觀察到了空花粉空花粉囊現(xiàn)象。這些敗育小孢子的細胞質(zhì)往往出現(xiàn)解體現(xiàn)象，小孢子內(nèi)具大量膜體，降解小泡豐富。小孢子的形狀極不規(guī)則，形態(tài)各異，有些小孢子中空，內(nèi)容物消失。近年也有很多研究[13～17]發(fā)現(xiàn)植物開花時花藥中有一些空殼花粉存在。經(jīng)分析空花粉的出現(xiàn)是由于雄配子體在其生長環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常狀況，無法發(fā)育為成熟的花粉粒，從而降低花粉數(shù)量，影響其傳粉生殖過程，因此推斷這也可能是東北茶藨子數(shù)量快速減少的原因之一。東北茶藨子空殼花粉形成的原因及其機制有待于深入分析。

3.3 東北茶藨子絨氈層細胞生長異常

小孢子母細胞在分裂過程中有時會存在絨氈層過早退化問題，這和四分體形成后逐漸解體的正常情況是不一樣的。辣椒和華北駝絨藜中也發(fā)現(xiàn)了絨氈層異常發(fā)育的現(xiàn)象[18～19]，且在絨粘層過早退化的藥室內(nèi)部出現(xiàn)空花粉的幾率很高，因此說明空花粉的出現(xiàn)很大程度上是因為絨氈層無法正常生長，從而無法為小孢子母細胞供應(yīng)發(fā)育所需養(yǎng)分造成的，影響小孢子的正常發(fā)育，導(dǎo)致敗育。

近年來也有很多關(guān)于花藥發(fā)育異常而導(dǎo)致雄性敗育的研究，大部分研究[20～25]結(jié)果表明減數(shù)分裂過程出現(xiàn)問題、絨氈層細胞無法正常生長等均會給花藥最終的成熟帶來不利影響，從而使花粉敗育。東北茶藨子花藥發(fā)育過程不同階段出現(xiàn)的發(fā)育異常現(xiàn)象，其原因還有待于進一步深入研究。

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The Fundamental Research Funds for the Central Universities(Grant No.2572014EA03)；The Innovation Project of State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding(Northeast Forestry University)(2013A06，2013B010)；The National Science Foundation for Fostering Talents in Basic Research of the National Natural Science Foundation of China(Grant No.J1210053);Postdoctoral Science Foundation of Heilongjiang province(LBH-Q14011)

introduction：ZHENG Bao-Jiang(1970—)，male，Associate Professor，main research interests focus on Plant taxonomy and Plant resources science.

date:2016-04-05

Megasporogenesis,Microsporogensis,andMaleandFemaleGametophyteDevelopmentofRibesmandshuricum

ZHENG Bao-Jiang1ZHANG Yi-Fan1WANG Mei-Juan1WANG Hai-Zhu1XU Qi-Jiang2*

(1.College of Life Science,Northeastern Forestry University,Harbin 150040；2.The State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Harbin 150040)

We used normal paraffin sectioning method to study the megasporogenesis and microsprrogenesis and the development of male and female gametophytes during development process ofRibesmandshuricum(Maxim.) Kom. The flower ofR.mandshuricumhas five stamens with four locules in each. During meiosis of the mother cell, the division of the cytoplasm can be attributed to the simultaneous type. The tetrad of microspores resulted from the meiosis are simultaneously bilateral and tetrahedral. The mature pollen grains are two-celled. The development of the anther wall belongs to an elementary type. The anther wall can be divided into five layers from outside to inside, including epidermis, endothecium, two middle layers and tapetum. Tapetum belongs to glandular type. The development of embryo sac belongs to the type of polygonum.R.mandshuricumis with one ovary, the ovules in which are anatropous, numerous, crassinucellate, and double integuments. The megasporocyte divides into four linear megaspore in the form of meiosis. The megaspore in chalazal end has a functional ability. There are some abnormal phenomena in the development of the anther, leading to the pollen degeneration.

Ribesmandshuricum(Maxim.) Kom.；megasporogenesis；microsporogenesis；female gametophyte；male gametophyte

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目(2572014EA03)；林木遺傳育種國家重點實驗室創(chuàng)新項目(2013A06，2013B010)；國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金(J1210053)；黑龍江省博士后科研啟動金(LBH-Q14011)

鄭寶江(1970—)，男，副教授，主要從事植物分類學(xué)和植物資源學(xué)研究。

* 通信作者： E-mail:qijiangxu@126.com

2016-04-05

* Corresponding author：E-mail:qijiangxu@126.com

Q949.751.2

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.05.007