李會萍 黎幫勇 胡尚連 曹 穎

(1.西南科技大學植物細胞工程實驗室，綿陽 621010； 2.四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心， 綿陽 621010)

2個慈竹NAC轉(zhuǎn)錄因子的克隆與組織表達分析

李會萍 黎幫勇 胡尚連*曹 穎

(1.西南科技大學植物細胞工程實驗室，綿陽 621010；2.四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心， 綿陽 621010)

以慈竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，結(jié)合毛竹基因組數(shù)據(jù)，采用同源克隆技術(shù)從慈竹中克隆到兩個NAC基因BeNAC1(GenBank注冊號：KU550706)和BeNAC2(GenBank注冊號：KU821586)，分別編碼313和389個氨基酸殘基。蛋白功能域預(yù)測和保守結(jié)構(gòu)域多重對比分析表明，BeNAC1和BeNAC2基因均含有NAM保守域，其模擬的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)與已知晶體結(jié)構(gòu)的水稻模型蛋白高度相似。亞細胞定位預(yù)測分析顯示，BeNAC1主要集中在細胞質(zhì)中；BeNAC2則主要集中在細胞核中。表達分析表明，BeNAC1和BeNAC2具有相似的組織特異性表達，在莖中表達量均明顯高于筍和葉片，且BeNAC1在除筍之外各組織中的表達量均顯著高于BeNAC2。

慈竹；NAC轉(zhuǎn)錄因子；克??；生物信息學分析；組織表達模式

慈竹(Bambusaemeiensis)是西南地區(qū)尤其四川省的主要竹種之一，其纖維具有一定的機械強度，故具備生產(chǎn)較高強度紙張的條件[1]。由于開花周期難以預(yù)測，且開花竹生長即衰敗[2]，使其傳統(tǒng)遺傳改良方法受到極大的限制。以往對慈竹在生長狀況[3]、生理生化[4]、遺傳多樣性[5]、功能基因克隆[6]等方面的研究，為其品種改良提供了一定的基礎(chǔ)，但有關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子方面的研究鮮見報道。

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，它的N端為高度保守的結(jié)構(gòu)域，C端為高度變異的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)[7～8]。自從Souer等從矮牽牛(Petuniahybrida)中克隆到第一個NAC基因NAM(no apical meristem)以來[9]，NAC在植物生長發(fā)育和逆境脅迫的響應(yīng)中的重要作用不斷被揭示[10]。如擬南芥(Arabidopsisthaliana)NAC1轉(zhuǎn)錄因子受生長素誘導，同時介導生長素信號來促進側(cè)根的發(fā)育[11]。水稻NAC29/31影響次生壁的發(fā)育，能夠激活MYB61，進而激活次生壁纖維素合成基因(CESA)表達，調(diào)控通路NAC29/31-MYB61-CESA影響水稻次生壁纖維素合成[10]；而水稻OsNAC5和OsNAC6則參與調(diào)控逆境應(yīng)答，其表達受到旱、冷、高鹽等非生物脅迫和ABA的誘導[12]；但對慈竹NAC轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究卻鮮見報道。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，RNA-Seq測序技術(shù)已經(jīng)成為了轉(zhuǎn)錄組分析的標準技術(shù)，利用該技術(shù)得到慈竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[13]，本研究基于課題組慈竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，克隆得到兩個NAC基因，并對其進行生物信息學分析以及組織特異性表達分析，為慈竹品質(zhì)改良提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以慈竹的筍(100 cm)、未展開葉、展開葉、莖為試驗材料，于液氮中保存，置于-80℃超低溫冰箱中備用(以上植物材料皆取自西南科技大學生命科學與工程學院資源圃)。

1.2 主要試劑和菌種

Plant RNA Kit試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自O(shè)mega Bio-tec公司；LA-Taq聚合酶、pMDTM19-T載體、PrimeScript?RT reagent Kit(Perfect DNA)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、EcoRⅠ、HindⅢ等購自寶生物工程(大連)TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒、X-Gal等購自北京天根公司；Green View染料購自BioBRK公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)由本試驗室制備。

1.3 試驗方法1.3.1 慈竹總RNA的提取和cDNA的合成

參照Plant RNA Kit試劑盒說明書方法提取慈竹筍(高100 cm)、未展開葉、展開葉、莖等組織總RNA。以O(shè)ligo dT為引物，按照PrimeScript?RT reagent Kit prefect real Time反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的方法將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3.2 慈竹BeNAC1和BeNAC2的克隆

以慈竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(plantTFDB)中的毛竹NAC基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計2對引物(BeNAC1-F和BeNAC1-R；BeNAC2-F和BeNAC2-R，表1)，以慈竹筍的cDNA為模版分別進行擴增。PCR的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸分為1 min(BeNAC1)和1∶20 min(BeNAC2)，30個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保持。

表1慈竹BeNAC1和BeNAC2基因克隆和Real-timePCR分析所用引物

Table1PrimersusedinBeNAC1andBeNAC2genescloningandreal-timePCRanalysisinB.emeiensis

引物Primers引物序列Primersequences(5′?3′)BeNAC1FATGAGGATGACGTGGTGCAACAGCTTCBeNAC1RTCAAGGACCAAAGCTATTCCTTCCTGCBeNAC2FATGGCGAGGTCGTGGCTTATAACTGGTABeNAC2RCTAGATGCGATCCAGCCAGCTTCCAATGBeTublin?RTFGCCGTGAATCTCATCCCCTTBeTublin?RTRTTGTTCTTGGCATCCCACATBeNACI?RTFTCTTCCAGACGCAGCCCAGGCAGTGBeNACI?RTRCCTGTTATTTGGGACCCCCTGGCTGBeNAC2?RTFGCCTGAAGGATGACGCTGAGAACCCBeNAC2?RTRTGGGCAGTCAAAAGGAAGCAATGTT

將回收純化的的PCR產(chǎn)物插入到pMDTM19-T載體(大連TaKaRa公司)克隆載體，在上海英濰捷基公司測序。

1.4慈竹BeNAC1和BeNAC2基因的生物信息學分析

用NCBI在線工具Conserved對兩個NAC編碼的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測分析。從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得其它物種的NAC功能性氨基酸和核苷酸序列，DAMBE檢測飽和度[14～15]，用ModelGenerator選擇最適建樹模型[16]，整理后導入Mega7.0軟件，用最大似然法(Maximum Likehood,ML)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(Bootstrap參數(shù)為1000 replicates)。用ClustalX1.8.3軟件對不同植物的NAC轉(zhuǎn)錄因子的NAM結(jié)構(gòu)域進行多重序列比對分析。MEME、SOPMA、Phyre2.0等在線工具分別對NAC蛋白序列進行模體、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析。用Yloc[17～18]進行亞細胞定位預(yù)測分析(選擇模型：Plants YLoc-HighRes)。

1.5 慈竹BeNAC1和BeNAC2的組織表達分析

根據(jù)測序的慈竹BeNAC1和BeNAC2基因的全長序列，設(shè)計real-time PCR引物(BeNAC1-RTF和BeNAC1-RTR；BeNAC2-RTF和BeNAC2-RTR，表1)。并以慈竹Tublin基因作為內(nèi)參，引物為BeTublin-RTF和BeTublin-RTR。按照Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒中20 μL體系的說明加樣。在iQ5 Multicolor Real-Time PCR自動擴增儀上進行real-time PCR反應(yīng)。每個樣品重復3次，最后采用2-ΔΔCt法[19]進行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 慈竹BeNAC1和BeNAC2基因的克隆及鑒定

以慈竹筍的cDNA為模版進行克隆，獲得兩條約1 000 bp的片段。測序結(jié)果顯示，獲得的BeNAC1和BeNAC2基因的開放閱讀框長度分別為939和1 167 bp，分別編碼313和389個氨基酸(圖1)。用NCBI在線工具Conserved[20]分別對其進行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測，BeNAC1和BeNAC2轉(zhuǎn)錄因子分別在67-208和57-201氨基酸位點含有NAM保守結(jié)構(gòu)域。NAM保守結(jié)構(gòu)域是NAC家族轉(zhuǎn)錄因子的特征結(jié)構(gòu)域，進一步確認BeNAC1和BeNAC2轉(zhuǎn)錄因子屬于NAC家族。將所得的新序列分別命名為BeNAC1和BeNAC2，GenBank注冊號分別為KU550706和KU821586。

圖1 慈竹BeNAC1(A)和BeNAC2(B)基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列 下劃線部分為NAM結(jié)構(gòu)域；“*”代表終止密碼子Fig.1 The nucleotide and encoded amino acid sequences of BeNAC1(A)and BeNAC2(B) The underlined part is the NAM domain; “*” represents the stop codon

2.2 慈竹BeNAC1和BeNAC2基因進化樹分析

分別以BeNAC1和BeNAC2的氨基酸序列為探針，通過Blast P程序從NCBI在線數(shù)據(jù)庫中檢索到與慈竹BeNAC1和BeNAC2同源性較高其他植物NAC序列。擬南芥ANAC036(NP_565404)、ANAC001(EFH68348)、CUC1(NP_188135)、SND2(AT4G28500.1)、SND3(AT1G28470.1)、VND6(NP_201044)、VND7(NP_177338)、ANAC008(At1g25580)；水稻ONANC003(AK061716)；矮牽牛NAM(CAA63102)和煙草TERN(BAA78417)。利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(建樹模型JTT+I+F+G)。如圖2所示，BeNAC1與ONAC003、SND2和SND3聚在一個分支上；BeNAC2與ANAC008聚在一個分支上。這兩個分支皆屬于第II組中ONAC003亞家族[21]，可以推測BeNAC1和BeNAC2分別與ONAC003/SND2/SND3和ANAC008在進化上的親緣關(guān)系上具有一定的相似性。用ModelGenerator進行氨基酸替代率分析，每個氨基酸的頻率分別為5.46%(A)，4.88%(R)，4.75%(N)，5.64%(D)，1.91%(C)，4.19%(Q)，7.14%(E)，7.14%(G)，3.77%(H)，4.08%(I)，6.83%(L)，6.66%(K)，2.22%(M)，3.68%(F)，6.06%(P)，9.08%(S)，5.84%(T)，1.86%(W)，3.28%(Y)和5.53%(V)。根據(jù)分析的數(shù)據(jù)顯示，氨基酸的替換率在0.00～2.19。

圖2 BeNAC1、BeNAC2和其他植物NAC的系統(tǒng)進化樹Fig.2 The phylogenetic tree of BeNAC1 and BeNAC2 protein

用Clustal W程序?qū)eNAC1和BeNAC2與擬南芥ANAC036(NP_565404)、ANAC001(EFH68348)、CUC1(NP_188135)；水稻ONANC003(AK061716)、OsNAC5(BAA89799)和矮牽牛NAM(CAA63102)的NAC家族成員進行保守結(jié)構(gòu)域多重比對分析。結(jié)果表明，BeNAC1和BeNAC2與ONAC003轉(zhuǎn)錄因子N端保守域的氨基酸相似性最高(圖3)，這與上述進化樹分析的結(jié)果保持一致。且整個NAM結(jié)構(gòu)域均含有相同的、保守性高的氨基酸。

圖3 BeNAC1和BeNAC2的NAM保守結(jié)構(gòu)域多重比對分析 “*”表示保守氨基酸；“：”表示保守替換；“.”表示非保守替換；“-”表示缺失；陰影的黑色、藍色、灰色分別表示保守性為100%、≥75%、≥50%的氨基酸；A～D為NAC轉(zhuǎn)錄因子N端保守區(qū)的保守亞域Fig.3 Multiple alignment analysis of NAM conservative structure domain in BeNAC1 and BeNAC2 “*” represents a conserved amino acid; “:” represents a conservative replacement; “.” represents non conservative replacement; “-” means missing; The shadow of the black, blue, grey represent conservative amino acid was 100%, ≥75%, ≥50%; A-D is a conserved subunit of the NAC transcription factor N terminal conserved region

2.3慈竹BeNAC1和BeNAC2蛋白的保守基序分析

利用MEME[22]在線工具對慈竹、水稻、擬南芥的NAC轉(zhuǎn)錄因子編碼的蛋白序列模體進行識別分析(圖4)。通常情況下，系統(tǒng)進化樹分析中聚在一個亞組的蛋白質(zhì)會有相似的motif組成，可以看出，BeNAC1、BeNAC2、ONAC003、SND2、SND和ANAC008均具有5個Motif。Motif 4、1、3、2分別對應(yīng)NAM多重比對分析A、B、C和D四個亞域，其中Motif 2基序末端序列中包含了NAM多重比對分析中未列出的E亞族序列，可以看出其氨基酸序列保守性不高。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，這兩種蛋白都是以無規(guī)則卷曲為主，其中BeNAC1和BeNAC2中分別含有26.84%和32.47%的α-螺旋，10.03%和10.05%的β-轉(zhuǎn)角，18.88%和15.72%的延伸鏈與44.25%和41.75%的無規(guī)則卷曲。以c3ulxA為模型[23],用Phyre2.0[24]對BeNAC1和BeNAC2進行三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。結(jié)果顯示，這兩個蛋白與c3ulxA的三級構(gòu)型高度相似(c3ulxA:已經(jīng)被X-Ray解析出晶體模型；PDB ID：3ULX)。圖5可以看出BeNAC1和BeNAC2的三級結(jié)構(gòu)主要以β-折疊為主，有少部分的α-螺旋。Yloc亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明，BeNAC1集中于細胞質(zhì)中的概率是75.5%(可信度為0.69)；BeNAC2則集中于細胞核中的概率為88.7%(可信度為0.93)。

圖4 BeNAC1和BeNAC2蛋白保守基序分析Fig.4 The conserved motif analysis of BeNAC1 and BeNAC2 protein

圖5 NAC蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 A.模型c3ulxA的三級結(jié)構(gòu)；B. BeNAC1的三級結(jié)構(gòu)；C. BeNAC2的三級結(jié)構(gòu)Fig.5 NAC protein tertiary structure prediction A. The tertiary structure of model c3ulxA; B. The tertiary structure of BeNAC1; C. The tertiary structure of BeNAC2

2.4慈竹BeNAC1和BeNAC2的組織表達模式分析

分別取慈竹的筍(100 cm)、未展開葉、展開葉和莖，通過熒光定量檢測BeNAC1和BeNAC2基因在不同組織中的表達情況。BeNAC1在慈竹中的表達量為莖>展開葉>筍>未展開葉；BeNAC2中為莖>筍>展開葉>未展開葉(圖6)?？梢钥闯鰞蓚€基因在莖中的表達量皆大于在其它組織中的表達量。特別是BeNAC1在莖中表達量幾乎是筍中表達量的12倍，未展葉表達量最低；BeNAC2在莖中表達量為筍中表達量的2倍多，在展開葉和未展葉中表達量最少。

圖6 同一慈竹NAC基因在不同組織中的表達分析Fig.6 The same sinocalamus affinis NAC gene expression analysis in different organizations

3 討論

近年來植物細胞次生壁形成的調(diào)控取得了顯著的進展，而NAC作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在其中起著舉足輕重的作用。目前，對次生生長相關(guān)NAC的研究大都集中在水稻、擬南芥等模式植物中[10]。慈竹是造紙工業(yè)的優(yōu)質(zhì)原料，提高其纖維素含量有著重要的意義，但目前對慈竹次生生長相關(guān)的NAC研究鮮見報道。

本研究克隆了2個慈竹NAC轉(zhuǎn)錄因子BeNAC1和BeNAC2。序列分析表明，這兩個基因都含有NAM特征結(jié)構(gòu)域。根據(jù)保守氨基酸的分布，該NAM結(jié)構(gòu)域可以分為A、B、C、D等四個亞域[21]，其中A、C和D亞域高度保守，B和E兩個亞域的氨基酸富于變化[9](B和E子結(jié)構(gòu)域在Ⅱ組中不保守，而在Ⅰ組的NAP，AtNAC3，ATAF和OsNAC3亞組中保守)[25]，因為E亞域氨基酸在此處的的保守性極低[21]，變化很大。此處未將E亞域序列包含在保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)。由于N端存在保守的堿性氨基酸，這些氨基酸使NAC蛋白相應(yīng)的表面上富含正電荷，很有可能直接參與了與DNA的結(jié)合[26]。

研究已經(jīng)表明，ONAC003(SNAC3)能增強水稻對高溫、干旱和滲透脅迫的耐受性。SNAC3介導活性氧(ROS)代謝，正向調(diào)控ROS清除基因的表達，故而增強了水稻對脅迫的耐受能力[27]。SND2/3除了能夠調(diào)節(jié)纖維素和半纖維素的生物合成外，還參與木質(zhì)素聚合和信號傳導[28]。ANAC008能夠編碼γ反應(yīng)抑制因子(SOG1)，可能對DNA的損傷有多重響應(yīng)。通過進化樹比對分析發(fā)現(xiàn)，這些功能性NAC與BeNAC1和BeNAC2進化關(guān)系比較近，同屬于ONAC003亞族。所以推測他們在功能上也具有一定的相似性，BeNAC1轉(zhuǎn)錄因子除了能參與植物的非生物脅迫下的防御應(yīng)答,還可能參與纖維細胞的發(fā)育調(diào)控；BeNAC2除了有上述功能外，還可能參與SOG1的合成調(diào)控。另外，表達分析表明BeNAC1和BeNAC2基因在莖中的表達量都遠高于其它組織。與其他組織相比，莖部具有較高的纖維素含量，這些證據(jù)暗示，這兩個轉(zhuǎn)錄因子可能參與慈竹莖部的纖維素合成調(diào)控過程，與系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類結(jié)果一致。但以上推測均需要進一步的深入研究與驗證。

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National Natural Science Foundation of China(Nos.31400257,31400333); Breeding Program Fund Project by the 13th Five-Year Plan of Sichuan Province(Nos:16ZS212301); Fund of Engineering Research Center for Biomass Resource Utilizaiton and Modification of Sichuan Province(Nos.12zxsk07,13zxsk01); Graduate innovation fund of Southwest University of Science and Technology(Nos.16ycx069)

introduction：LI Hui-Ping(1991—),female,master,research mainly focuses on plant genetics and variety improvement.

date:2016-08-30

CloningandExpressionAnalysisofTwoNACTranscriptionFactorsinBambusaemeiensis

LI Hui-Ping LI Bang-Yong HU Shang-Lian*CAO Ying

(1.Lab of Plant Cell Engineering Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010；2.Engineering Research Center for Biomass Resource Utilization and Modification of Sichuan Province,Mianyang 621010)

Based on the transcriptome database ofBambusaemeiensisand genome information ofPhyllostachysheterocycla, the two NAC genes were cloned by homology cloning technology from the shoots ofB.emeiensis, named asBeNAC1(GenBank: KU550706) andBeNAC2(GenBank: KU821586), encoding 313 and 389 amino acids, respectively. By protein function prediction and conserved domain multiple alignment, both ofBeNAC1 andBeNAC2 contained NAM conserved region. By protein structure prediction, the putatived three-dimensional structure ofBeNAC1 andBeNAC2 protein was similar to a rice protein with known crystal structure. By subcellular localization prediction analysis, BeNAC1 was mainly concentrated in the cytoplasm, and BeNAC2 was mainly concentrated in the nucleus. Tissue expression pattern analysis showed thatBeNAC1 andBeNAC2 displayed similar tissue-specific, both having the highest expression on stems, whereas in addition to the bamboo shoots, the expression ofBeNAC1 in each tissue tested was higher than that ofBeNAC2.

Bambusaemeiensis;NAC transcription factors;clone;bioinformatics analysis;tissue expression pattern

國家自然科學基金(31400257，31400333)；四川省“十三五”重點公關(guān)資助項目(16ZS212301)；四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心基金資助(12zxsk07，13zxsk01)；西南科技大學研究生創(chuàng)新基金資助項目(16ycx069)

李會萍(1991— )，女，碩士研究生，從事植物遺傳與品種改良研究。

* 通信作者：E-mail:hushanglian@126.com

2016-08-30

* Corresponding author：E-mail:hushanglian@126.com

S795.5

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.06.013