陸玉建 張韓杰 韓文瑜 沈志強

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院/博士后科研工作站，濱州 256600； 2.吉林大學(xué)博士后科研流動站，長春 130062； 3.濱州學(xué)院生命科學(xué)系/山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，濱州 256603； 4.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)rd29A啟動子驅(qū)動otsB基因轉(zhuǎn)化紫茉莉的研究

陸玉建1,2,3張韓杰3韓文瑜2沈志強1,4*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院/博士后科研工作站，濱州 256600；2.吉林大學(xué)博士后科研流動站，長春 130062；3.濱州學(xué)院生命科學(xué)系/山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，濱州 256603；4.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600)

紫茉莉為紫茉莉科紫茉莉?qū)俣嗄晟荼局参?，具有較高觀賞和藥用價值，對重金屬和石油污染有較強修復(fù)能力。然而目前為止，紫茉莉再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系尚未建立。本研究以紫茉莉為材料，初步建立起較為穩(wěn)定的再生體系。通過克隆擬南芥rd29A啟動子和大腸桿菌otsB基因，構(gòu)建了p2300-rd29Apro-otsB植物表達載體。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對紫茉莉進行遺傳轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，當(dāng)農(nóng)桿菌的OD600=0.5，侵染成熟胚或帶芽莖段60 min，共培養(yǎng)2 d，紫茉莉的轉(zhuǎn)化效率較高。通過對篩選出的轉(zhuǎn)基因植株進行PCR檢測，顯示大腸桿菌otsB基因已成功整合到紫茉莉的基因組中，并可有效的進行轉(zhuǎn)錄。

紫茉莉；rd29A啟動子；otsB基因；農(nóng)桿菌；遺傳轉(zhuǎn)化

紫茉莉(MirabilisjalapaL.)又名草茉莉、胭脂花、地雷花、粉豆花等，為紫茉莉科(Nyctaginaceae)紫茉莉?qū)?Mirabilis)多年生草本植物，原產(chǎn)南美熱帶地區(qū)，在我國廣為分布和種植[1～2]。紫茉莉品種繁多，花色豐富，具有殺菌、抗病毒、解痙和鎮(zhèn)痛等功效，觀賞和藥用價值都較高[2～5]。近年來發(fā)現(xiàn)，紫茉莉是一種高生物量重金屬富集植物，對鎘、鉛等有較強的吸收能力[6～7]。紫茉莉還可對石油污染的土壤進行生物修復(fù)[3,8]。此外，紫茉莉生長比較迅速，適應(yīng)長期干旱等不良環(huán)境的能力較強[9]。目前，有關(guān)紫茉莉的研究還較少，其修復(fù)污染和抗脅迫的分子機制仍不清楚。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是開展相關(guān)研究有效手段，而高效再生體系的建立則是紫茉莉遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)外有關(guān)紫茉莉再生和轉(zhuǎn)化方面的研究仍未見相關(guān)報道，僅有的結(jié)果主要分析了不同激素對紫茉莉愈傷組織誘導(dǎo)和細胞懸浮培養(yǎng)的影響[10～11]。本研究首先建立起較為穩(wěn)定的紫茉莉再生體系，在此基礎(chǔ)上，探索其遺傳轉(zhuǎn)化的最適條件。啟動子是調(diào)控基因表達的關(guān)鍵元件，擬南芥rd29A啟動子是逆境誘導(dǎo)型啟動子[12]。當(dāng)植物遭受逆境脅迫時，rd29A啟動子可驅(qū)動下游基因表達以減輕不良環(huán)境對植物的損害[13～14]。海藻糖由兩分子葡萄糖以α,α1-1糖苷鍵結(jié)合而成的非還原性雙糖，為一種重要的滲透保護劑[15～16]。海藻糖的合成主要由6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)和6-磷酸海藻糖磷酸化酶(TPP)催化完成[17～18]。大腸桿菌的TPS由otsA基因所編碼，TPP則由otsB基因所編碼[18]。現(xiàn)階段，有關(guān)otsA基因的研究較多，而otsB幾乎沒有受到關(guān)注。本試驗通過利用擬南芥rd29A啟動子驅(qū)動大腸桿菌otsB基因在紫茉莉中進行表達，可以為今后進一步提高紫茉莉生物修復(fù)和抗逆能力，以及相關(guān)分子機制的研究提供數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料及試劑

野生型擬南芥(columbia生態(tài)型)和紫茉莉的種植條件為：16 h光照、8 h黑暗，濕度保持在60%～70%，溫度控制在22℃左右，光照強度為2 200 Lux。限制性核酸內(nèi)切酶、Primer STARTMHS DNA ploymerase購自TakaRa公司，Taq酶、T4DNA連接酶、凝膠回收試劑盒均購自Fermentas公司，pTZ57R/T載體購自蘭州鵬程生物技術(shù)有限公司，引物合成和核酸測序由上海生工完成，大腸桿菌DH5α、土壤農(nóng)桿菌GV3101和p2300-GFP載體由濱州學(xué)院生命科學(xué)系基因工程實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基成分

根據(jù)前期試驗的結(jié)果，以紫茉莉帶芽莖段為外植體，初步建立起較為穩(wěn)定的再生體系，適宜紫茉莉離體快繁的培養(yǎng)基類型如下所述?；九囵B(yǎng)基：MS；無菌苗生長培養(yǎng)基M0：MS+0.1 mg·L-1NAA；不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基M1：MS+1 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1KT+1 mg·L-1NAA+0.05 mg·L-1TDZ；生根培養(yǎng)基M2：1/2MS+0.5 mg·L-1NAA。

1.2 試驗方法

1.2.1擬南芥rd29A啟動子和大腸桿菌otsB基因的克隆

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中擬南芥rd29A啟動子(rd29Apro)和大腸桿菌otsB基因序列的相關(guān)信息，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件進行引物設(shè)計。rd29Apro和otsB基因引物信息(下劃線顯示引入酶切位點的位置)如下，rd29Apro-F：5′CGCAAGCTTAGATTTGGGGTTTTGCTTTTGAATG3′(HindⅢ)，rd29Apro-R：5′GCGGAGCTCTTTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAA3′(SacⅠ)；otsB-F：5′ATAGAGCTCATGACAGAACCGTTAACCGAAACC3′(SacⅠ)，otsB-R：5′GCGTCTAGAGATACTACGACTAAACGACTCATAGT3′(XbaⅠ)。分別以野生型擬南芥和大腸桿菌基因組DNA為模板，高保真PCR擴增rd29Apro和otsB，回收PCR擴增產(chǎn)物，連入pTZ57R/T載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并對重組克隆進行PCR和酶切鑒定。將含有目的片段的陽性克隆進行測序。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用HindⅢ-SacⅠ分別酶切pTZ57R/T-rd29Apro和p2300-GFP，將回收的目的片段進行連接，從而構(gòu)建p2300-rd29Apro-GFP載體(圖1:A～B)。用SacⅠ-XbaⅠ分別酶切pTZ57R/T-otsB和p2300-rd29Apro-GFP，將目的片段回收并連接，從而構(gòu)建p2300-rd29Apro-otsB載體(圖1:C)。將含目的基因的p2300-rd29Apro-otsB表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。

1.2.3 卡那霉素敏感性試驗

挑取黑色成熟、飽滿的紫茉莉瘦果，50℃水浴1 h，75%酒精消毒10 min,無菌水清洗5次，再用0.1%升汞處理30 min，剝胚，接種于含0、10、30、50、70、90 mg·L-1卡那霉素(Kan)的M0培養(yǎng)基中。觀察并記錄幼苗的生長狀況，統(tǒng)計幼苗的成活率，確定最適抗生素篩選濃度。

1.2.4 紫茉莉的遺傳轉(zhuǎn)化

將含目的基因的農(nóng)桿菌振蕩培養(yǎng)，測定OD600值，離心后加入含100 μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)的MS培養(yǎng)基重懸菌體；以紫茉莉成熟胚或帶芽莖段為受體，置于菌液中侵染后共培養(yǎng)。然后將成熟胚或帶芽莖段用含500 mg·L-1羧芐青霉素鈉(Carb)的抑菌液浸泡10 min，無菌水沖洗3～4次。對于成熟胚，先將其轉(zhuǎn)入M0+Kan+Carb(500 mg·L-1)培養(yǎng)基中進行篩選培養(yǎng)，獲得抗性無菌苗，然后切取帶芽莖段，在M1+Kan+Carb(500 mg·L-1)培養(yǎng)基中進行分化培養(yǎng)；對于帶芽莖段，可直接轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基M1+Kan+Carb(500 mg·L-1)中進行抗性芽的誘導(dǎo)。切取生長健壯的不定芽，在M1+Kan+Carb(500 mg·L-1)中進行增殖培養(yǎng)，或在生根培養(yǎng)基M2+Kan+Carb(250 mg·L-1)中誘導(dǎo)生根，獲得轉(zhuǎn)基因試管苗。

圖1 目的基因表達載體的構(gòu)建 A. p2300-GFP表達載體；B. p2300-rd29A pro-GFP表達載體；C. p2300-rd29A pro-otsB表達載體Fig.1 Construction of p2300-rd29A pro-otsB expression vectors A. Schematic illustration of p2300-GFP expression vector; B. Schematic illustration of p2300-rd29A pro-GFP expression vector; C. Schematic illustration of p2300-rd29A pro-otsB expression vector

1.2.5 轉(zhuǎn)化條件的選擇

分別以紫茉莉成熟胚和帶芽莖段作為轉(zhuǎn)化的材料，將農(nóng)桿菌液OD600值調(diào)整為0.2、0.5和1.0；侵染時間依次為15、30和60 min；共培養(yǎng)時間設(shè)置為1、2和3 d。根據(jù)成熟胚的成苗率或莖段的分化率確定最合適的轉(zhuǎn)化條件。

抗性無菌苗成活率(%)=產(chǎn)生抗性無菌苗數(shù)/接種成熟胚數(shù)×100%

(1)

抗性不定芽分化率(%)=再生抗性芽的莖段數(shù)/接種莖段數(shù)×100%

(2)

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

用CTAB法提取野生型和轉(zhuǎn)化植株葉片DNA，PCR檢測大腸桿菌otsB整合到紫茉莉染色體上的情況；Trizol法提取野生型和轉(zhuǎn)化植株的總RNA，RT-PCR檢測大腸桿菌otsB在轉(zhuǎn)基因植株中的轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.7 統(tǒng)計分析

采用EXCEL 2003和SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，通過Duncan多重比較進行顯著性測驗，字母相同者差異不顯著，字母不同者表示在0.05(小寫字母)或0.01(大寫字母)水平上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 p2300-rd29A pro-otsB表達載體的構(gòu)建

分別以野生型擬南芥和大腸桿菌基因組DNA為模板，高保真PCR擴增rd29Apro和otsB(圖2:A)?；厥誔CR擴增產(chǎn)物，連入pTZ57R/T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并對重組克隆進行PCR和酶切鑒定。實驗結(jié)果表明，目的片段已插入pTZ57R/T(圖2:B～E)。用HindⅢ-SacⅠ分別酶切pTZ57R/T-rd29Apro和p2300-GFP，連接回收片段，鑒定重組質(zhì)粒，顯示rd29Apro已連入p2300-GFP，從而實現(xiàn)p2300-rd29Apro-GFP表達載體的構(gòu)建(圖2:F～G)。用SacⅠ-XbaⅠ分別酶切pTZ57R/T-otsB和p2300-rd29Apro-GFP，將回收的目的片段進行連接，鑒定重組體，表明otsB基因已插入p2300-rd29Apro-GFP，從而實現(xiàn)p2300-rd29Apro-otsB表達載體的構(gòu)建(圖2:H～I)。

2.2 紫茉莉轉(zhuǎn)化體系的建立

2.2.1 卡那霉素敏感性試驗

取成熟飽滿的紫茉莉瘦果(圖3:A)，消毒后剝?nèi)ス?，獲得成熟胚(圖3:B)，接種到含不同濃度梯度Kan的M0培養(yǎng)基中，觀察紫茉莉幼苗的生長狀況，確定最佳的抗生素篩選濃度。培養(yǎng)2周后，在不添加Kan的情況下，紫茉莉幼苗生長旺盛，葉片嫩綠，根系發(fā)達(圖3:C)；Kan濃度為10 mg·L-1時，幼苗的生長開始受到抑制，葉片小，根少而短，排除敗育的胚外，幼苗的成活率接近90%(圖3:D)。隨著Kan濃度的增加，對幼苗的抑制作用越來越強(圖3:E～H)。當(dāng)Kan濃度為70 mg·L-1時，幼苗的長勢停滯，葉片枯黃，開始死亡，幼苗的成活率已不足10%(圖3:G)；Kan濃度為90 mg·L-1時，Kan對幼苗抑制作用過強，紫茉莉幼苗過早出現(xiàn)死亡，成活率幾乎為0(圖3:H)。因此，比較適合篩選轉(zhuǎn)基因紫茉莉的Kan濃度設(shè)定為70 mg·L-1。

圖2 載體的構(gòu)建與鑒定 A.高保真PCR克隆擬南芥rd29A pro和大腸桿菌otsB基因；B. pTZ57R/T- rd29A pro質(zhì)粒PCR的結(jié)果；C. pTZ57R/T-rd29A pro質(zhì)粒酶切的結(jié)果；D. pTZ57R/T-otsB質(zhì)粒PCR的結(jié)果；E. pTZ57R/T-otsB質(zhì)粒酶切的結(jié)果；F. p2300-rd29A pro-GFP質(zhì)粒PCR的結(jié)果；G. p2300-rd29A pro-GFP質(zhì)粒酶切的結(jié)果；H. p2300-rd29A pro-otsB質(zhì)粒PCR的結(jié)果；I. p2300-rd29A pro-otsB質(zhì)粒酶切的結(jié)果 M. Marker 3(條帶大小依次為：4500、3000、2000、1200、800、500和200 bp)Fig.2 Construction and identification of vector A. Amplification results of Arabidopsis thaliana rd29A promoter and otsB gene in E.coli; B. Detection of pTZ57R/T- rd29A pro plasmid by PCR; C. The result of pTZ57R/T-rd29A pro plasmid digested by HindⅢ-SacⅠ; D. Detection of pTZ57R/T-otsB plasmid by PCR; E. The result of pTZ57R/T-otsB plasmid digested by SacⅠ-XbaⅠ; F. Detection of p2300-rd29A pro-GFP plasmid by PCR; G. The result of p2300-rd29A pro-GFP plasmid digested by HindⅢ-SacⅠ; H. Detection of p2300-rd29A pro-otsB plasmid by PCR; I. The result of p2300-rd29A pro-otsB plasmid digested by SacⅠ-XbaⅠ M. DNA marker 3(DNA bands size as follows: 4 500, 3 000, 2 000, 1 200, 800, 500 and 200 bp)

圖3 卡那霉素敏感性試驗 A.紫茉莉的瘦果；B.紫茉莉的成熟胚；C～H.在篩選培養(yǎng)基中生長2周的紫茉莉 Kan濃度依次為0、10、30、50、70、90 mg·L-1Fig.3 Kanamycin sensitivity test A. The achenes of Mirabilis jalapa L.; B. The mature embryos of M.jalapa L.; C-H. M.jalapa L. grown in the selection media containing 0, 10, 30, 50, 70 and 90 mg·L-1 kanamycin for two weeks

2.2.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

以紫茉莉成熟胚為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，通過對抗性無菌苗的生長情況進行觀察統(tǒng)計可以發(fā)現(xiàn)(圖4)，當(dāng)農(nóng)桿菌OD600=0.2時，紫茉莉成熟胚成苗率約為30%，明顯低于OD600=0.5，后者成熟胚成苗率達到50%，而當(dāng)農(nóng)桿菌OD600=1.0時，紫茉莉成熟胚成苗率下降為33%。因此，當(dāng)農(nóng)桿菌的OD600值為0.5，侵染能力較強，紫茉莉成熟胚轉(zhuǎn)化率最高，三者之間差異顯著(P<0.05)。農(nóng)桿菌侵染時間為60 min，成熟胚成苗率大約為55%，比侵染15 min(26%)與30 min(39%)要高。其中侵染時間15和60 min之間存在顯著差異。由此可見，在利用紫茉莉成熟胚進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中，侵染時間為60 min時其轉(zhuǎn)化效果較好。對于共培養(yǎng)時間，2和3 d的效果區(qū)別不大，共培養(yǎng)2 d時，成熟胚成苗率可達到61%，比3 d(48%)的略高。而共培養(yǎng)時間為1 d時，成熟胚成苗率只有25%，和2～3 d的結(jié)果之間存在比較明顯的差異。

圖4 紫茉莉成熟胚轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化Fig.4 Optimization of transformation conditions for mature embryos of M.jalapa L.

以帶芽莖段為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，進行農(nóng)桿菌侵染和轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化。實驗結(jié)果表明(圖5)，當(dāng)農(nóng)桿菌OD600=0.2時，紫茉莉莖段的轉(zhuǎn)化率約38%，遠低于OD600=0.5，后者抗性不定芽誘導(dǎo)率達到70%，二者之間存在及其顯著的差異(P<0.01)。而當(dāng)農(nóng)桿菌OD600=1.0時，莖段的轉(zhuǎn)化率則下降為52%。因此，當(dāng)農(nóng)桿菌的OD600值為0.5，侵染能力較強，抗性不定芽的分化率較高。農(nóng)桿菌侵染時間為60 min時，抗性不定芽的分化率可達到80%左右，轉(zhuǎn)化效果明顯優(yōu)于15 min，但和30 min轉(zhuǎn)化率(71%)差異并不十分明顯。因此，侵染時間60 min為宜，此時抗性不定芽的分化率高。對于共培養(yǎng)時間，2 d的效果較好，不定芽的分化率約為72%，比共培養(yǎng)1 d(25%)和3 d(58%)時的效果好，三者之間差異顯著。此外，在紫茉莉轉(zhuǎn)化過程中，無論外植體為成熟胚或莖段，向農(nóng)桿菌菌液中添加100 μmol·L-1乙酰丁香酮都對提高紫茉莉的轉(zhuǎn)化效率有一定的促進作用。

圖5 紫茉莉不定芽轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化Fig.5 Optimization of transformation conditions for nodal stem segments of M.jalapa L.

圖6 紫茉莉遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立 A.和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)2 d的紫茉莉胚；B.轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中的胚；C.篩選培養(yǎng)7 d的胚；D.篩選培養(yǎng)15 d后紫茉莉的幼苗；E.莖段的分化培養(yǎng)；F.分化培養(yǎng)30 d的莖段；G.莖段的遺傳轉(zhuǎn)化；H.在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d的莖段；I.在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d的莖段；J.增殖培養(yǎng)15 d的莖段；K.生根誘導(dǎo)；L.試管苗的形成；M.處于花期的轉(zhuǎn)基因紫茉莉；N.轉(zhuǎn)基因植株的普通PCR檢測；O.轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR檢測Fig.6 The genetic transformation and identification of M.jalapa L. A. Mature embryos infected by Agrobacterium tumefaciens for 2 d; B. Embryos in the selection medium; C. Embryos cultured for 7 d in the selection medium; D. Seedlings cultured for 15 d in the selection medium; E. Differentiation culture of stem segments; F. Stem segments cultured for 30 d in the differentiation medium; G. Genetic transformation of nodal stem segments; H. Stem segments cultured for 15 d in the selection medium; I. Stem segments cultured for 30 d in the selection medium; J. Proliferation culture of stem segment for 15 d; K. Rooting induction; L. Formation of plantlets; M. Flowering transgenic Mirabilis jalapa L.; N. PCR analysis of otsB gene in putative transgenic plants; O. RT-PCR detection of transgenic plants

2.2.3 轉(zhuǎn)基因紫茉莉的獲得

通過對成熟胚或帶芽莖段進行轉(zhuǎn)化和篩選，初步獲得了紫茉莉轉(zhuǎn)基因植株。具體過程如圖6所示。圖6A為和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)2 d后的紫茉莉成熟胚，共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移到添加抗生素的培養(yǎng)基中進行篩選培養(yǎng)(圖6:B)。篩選培養(yǎng)7 d后，轉(zhuǎn)化成功的成熟胚進一步發(fā)育，開始抽出葉片(圖6:C)；篩選培養(yǎng)15d后部分紫茉莉幼苗開始快速生長，而目的基因沒有導(dǎo)入的成熟胚則發(fā)育遲緩，逐漸死亡(圖6:D)。切取轉(zhuǎn)化苗的莖段，進行不定芽誘導(dǎo)(圖6:E)。培養(yǎng)30 d后，莖段在篩選培養(yǎng)基中快速增殖(圖6:F)。圖6G為帶芽莖段的遺傳轉(zhuǎn)化。莖段在抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d后，可以看到轉(zhuǎn)化成功的莖段開始產(chǎn)生新芽(圖6:H)。莖段在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后，沒有轉(zhuǎn)化成功的莖段枯萎死亡，而具有抗性的不定芽則繼續(xù)快速生長(圖6:I)。切取抗性不定芽，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)15 d后，大部分不定芽增殖旺盛(圖6:J)。待抗性芽生長到一定階段，進行生根誘導(dǎo)(圖6:K)。大約1個月后，初步獲得具有抗性的轉(zhuǎn)基因試管苗(圖6:L)。當(dāng)根布滿培養(yǎng)基底部，株高8～10 cm時，對幼苗進行馴化和移栽，生長1～2月后便可開花(圖6:M)。提取轉(zhuǎn)基因植株的DNA進行PCR檢測，結(jié)果表明，大腸桿菌otsB基因已成功的整合到部分紫茉莉的基因組中(圖6:N)。提取轉(zhuǎn)基因植株的RNA，RT-PCR檢測大腸桿菌otsB基因表達情況，顯示該基因在部分紫茉莉中可以有效的進行轉(zhuǎn)錄(圖6:O)。

3 討論

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是選育優(yōu)良品種極為便捷和有效的途徑，成功的基因轉(zhuǎn)化首先依賴于良好的植物受體系統(tǒng)的建立，外植體高效穩(wěn)定的再生能力是遺傳轉(zhuǎn)化能否成功的關(guān)鍵因素。通過試驗發(fā)現(xiàn)，以紫茉莉葉片為材料，極易誘導(dǎo)形成大量的不定根，產(chǎn)生愈傷組織的量卻極少，且質(zhì)量較差，難以分化成芽，這與已有的研究結(jié)果并不一致[10～11]。因此，以葉片為外植體，建立穩(wěn)定的再生體系目前尚存在一定的困難。而紫茉莉帶芽莖段再生能力強，可不經(jīng)愈傷組織階段直接產(chǎn)生大量的叢生芽，通過生根誘導(dǎo)即可建立較為穩(wěn)定的再生體系，故可作為良好的植物受體系統(tǒng)。作為植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，不僅能夠高效穩(wěn)定的再生，還要對轉(zhuǎn)化選擇抗生素敏感。在篩選過程中，非轉(zhuǎn)化細胞應(yīng)對抗生素敏感，細胞的分裂和分化受到抑制；而轉(zhuǎn)化細胞由于攜帶該抗生素的抗性基因則能夠正常分裂和分化，最終獲得完整的轉(zhuǎn)化植株[19～20]。現(xiàn)階段，較為普遍使用的選擇標(biāo)記基因是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptⅡ)，其編碼的蛋白可以抑制卡那霉素的活性[20～21]?？敲顾孛舾行栽囼灡砻?，野生型紫茉莉?qū)an較為敏感，比較合適的篩選濃度為70 mg·L-1，在此濃度下，絕大部分紫茉莉幼苗的生長受到抑制，黃化死亡。所以，通過適宜濃度的Kan對轉(zhuǎn)化植株進行初步篩選是完全可行的。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是植物遺傳轉(zhuǎn)化的最重要方法之一，利用農(nóng)桿菌浸染的特性和植物細胞自身的物質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，外源基因可以被導(dǎo)入受體細胞基因組，并能穩(wěn)定的表達與遺傳。由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化頻率較低，因此需要對影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素進行優(yōu)化，進而建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的過程是其侵入植物組織，吸附細胞表面，完成T-DNA插入的過程。農(nóng)桿菌的濃度、浸染時間和共培養(yǎng)時間是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素。有研究表明，農(nóng)桿菌濃度過大、侵染時間過長，對植物生長具有毒害作用；濃度過低、侵染時間過短，菌體不能充分吸附在受體表面或吸附量過少，使T-DNA不能有效轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)化的數(shù)目較少，從而降低轉(zhuǎn)化率[22～24]。共培養(yǎng)時間過短，農(nóng)桿菌的T-DNA難以有效的進入受體細胞內(nèi)部并將目的基因整合到該細胞的基因組中，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率降低；共培養(yǎng)時間過長，除菌困難，污染比較嚴(yán)重[24～25]。據(jù)外植體的生長狀態(tài)和轉(zhuǎn)化率的高低，最終確定當(dāng)農(nóng)桿菌OD600=0.5，侵染60 min，共培養(yǎng)2 d時，對紫茉莉的遺傳轉(zhuǎn)化比較有利。對成熟胚和帶芽莖段而言，以后者為受體，轉(zhuǎn)化效率高，培養(yǎng)周期短。推測其可能的原因是帶芽莖段細胞分裂更為活躍，對基因轉(zhuǎn)化較敏感，有利于T-DNA轉(zhuǎn)移和整合。因此，在紫茉莉遺傳轉(zhuǎn)化過程中，選擇莖段作為受體更為合適。經(jīng)抗生素篩選獲得的轉(zhuǎn)基因植株仍需用分子生物學(xué)的方法進行檢測，以確保大腸桿菌otsB基因成功插入到紫茉莉的基因組中并能進行有效的表達。在選取的35株Kan抗性植株中，通過PCR方法檢測到otsB基因的陽性植株為9株，而otsB基因能夠進行表達的只有5株?？梢姡宪岳虻膶嶋H轉(zhuǎn)化效率還比較低，轉(zhuǎn)化成功率可能在10%左右。

采用傳統(tǒng)的育種技術(shù)改良和篩選作物品種，花費時間過長，限制因素過多，存在較高的不確定性，通過基因工程技術(shù)可以方便省時的將特定外源基因?qū)氲绞荏w植物的基因組，篩選出性狀優(yōu)良的新品種[26～27]。因此，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為加速農(nóng)業(yè)發(fā)展的強有力手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。當(dāng)前，我國存在大量鹽漬化和石油、重金屬等污染的土壤，嚴(yán)重威脅著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人民群眾的身體健康。紫茉莉具有生長迅速，生物量大，適應(yīng)性強等特點，是一種較為理想的污染土壤修復(fù)植物；而且，紫茉莉花色鮮艷，種類繁多，觀賞價值極高，所以，在進行土壤修復(fù)的同時還可美化環(huán)境[6～8]。雖然紫茉莉生物修復(fù)能力較強，但仍難以滿足高效修復(fù)嚴(yán)重污染土壤的需要。而將具有修復(fù)功能的外源基因引入植物，進而增強轉(zhuǎn)基因植物的生物修復(fù)功能，則為解決土壤污染問題提供了有效手段。本研究紫茉莉為材料，首次建立起較為穩(wěn)定的再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系，并成功的將p2300-rd29Apro-otsB植物表達載體導(dǎo)入到受體細胞，試圖利用擬南芥rd29A啟動子驅(qū)動大腸桿菌otsB基因在紫茉莉中高效表達，進而提高紫茉莉的生物修復(fù)功能和抗逆能力。但在紫茉莉轉(zhuǎn)化過程中，還存在篩選效果不佳，假陽性高，轉(zhuǎn)化率較低的不足之處，因此，轉(zhuǎn)化條件仍需要進一步優(yōu)化。當(dāng)前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)紫茉莉的遺傳轉(zhuǎn)化仍處于建立和優(yōu)化完善階段，初步獲得的研究結(jié)果對于今后建立高效的紫茉莉遺傳轉(zhuǎn)化體系和通過基因工程技術(shù)改善紫茉莉生物修復(fù)以及抗逆能力具有一定的參考和應(yīng)用價值。

1.陳軍.紫茉莉栽培管理[J].中國花卉園藝,2012,24(18):1-2.

2.王永飛.紫茉莉的種植和利用[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù),2005,25(5):83,101.

3.Peng S W,Zhou Q X,Cai Z,et al. Phytoremediation of petroleum contaminated soils byMirabilisjalapaL. in a field plot experiment [J]. J Hazard Mat,2009,168(2-3):1490-1496.

4.李光喜,楊培全.紫茉莉?qū)偎幱弥参镅芯窟M展[J].廣東醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報,1994,10(4):251-253.

5.Zachariah S M,Aleykutty N A,Viswanad V,et al. In-vitro antioxidant potential of methanolic extracts ofMirabilisjalapaLinn [J]. Free Rad Antiox,2011,1(4):82-86.

6.陳杰.2種強化措施輔助紫茉莉修復(fù)鎘污染土壤研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(24):13205-13206.

7.葉晟.紫茉莉?qū)︺U脅迫的響應(yīng)及耐性研究[D].長沙:中南大學(xué),2009:21-38.

8.劉家女,周啟星,孫挺,等.花卉植物應(yīng)用于污染土壤修復(fù)的可行性研究[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2007,18(7):1617-1623.

9.羅南書.干旱脅迫對紫茉莉種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(23):114-116,123.

10.白玉,高月,趙倩,等.紫茉莉愈傷組織誘導(dǎo)的激素優(yōu)化研究[J].園藝與種苗,2012(7):52-54.

11.趙倩,林景衛(wèi),馮雅萍,等.紫茉莉懸浮細胞培養(yǎng)體系的建立[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報,2013,21(5):453-458.

12.張俊蓮,王麗,秦舒浩,等.利用擬南芥rd29A啟動子驅(qū)動AtNHX1基因提高煙草耐鹽性[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2011,19(4):669-676.

13.張寧,司懷軍,王蒂.擬南芥rd29A基因啟動子克隆及其在馬鈴薯抗脅迫轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用[J].作物學(xué)報,2005,31(2):159-164.

14.押輝遠,秦廣雍,霍裕平.Prd29A及DREB1A的克隆和干旱誘導(dǎo)型植物表達載體的構(gòu)建與鑒定[J].植物生理學(xué)通訊,2005,41(3):371-375.

15.齊宏飛,陽小成.植物抗逆性研究概述[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué):2008,36(32):13943-13946.

16.Crowe J H,Hoekstra F A,Crowel M. Anhydrobiosis [J]. Anllu Rev Physiol,1992,54:579-599.

17.戴秀玉,王憶琴,楊波,等.大腸桿菌海藻糖合成酶基因?qū)μ岣邿煵菘鼓嫘阅艿难芯縖J].微生物學(xué)報,2001,41(4):427-431.

18.戴秀玉,王憶琴,周堅,等.大腸桿菌海藻糖的代謝調(diào)控[J].生物工程進展,2000,20(6):26-29.

19.張崗,康振生,孫燕飛,等.84K楊基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報,2005,33(4):87-90,96.

20.羅素蘭,陳若,長孫東亭,等.番茄組培苗的不同階段對抗生素和PPT的抗性篩選試驗[J].海南大學(xué)學(xué)報,2003,21(1):58-64.

21.楊廣東,朱禎,李燕娥,等.幾種抗生素對大白菜種子發(fā)芽及離體子葉再生的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報,2002,17(1):55-59.

22.王丹,吳燕民,劉水,等.利用農(nóng)桿菌浸種法建立白三葉草遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報,2009,11(1):96-101.

23.吳關(guān)庭,胡張華,郎春秀,等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)高羊茅遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].核農(nóng)學(xué)報,2005,19(5):340-346.

24.雷江麗,王丹,吳燕民,等.農(nóng)桿菌浸種法介導(dǎo)中華結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2009,17(5):865-871.

25.陸玉建,張韓杰,劉南南,等.大腸桿菌otsB基因的克隆與轉(zhuǎn)化本生煙草的初步研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,8:108-112.

26.張振霞.幾種牧草和草坪植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及其轉(zhuǎn)基因研究[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2002:1-7.

27.李玉婷.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的橡膠樹胚狀體遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及AtFT轉(zhuǎn)基因的初步研究[D].?？?海南大學(xué),2012:1-15.

TransformationofMirabilisjalapaL.withotsBGeneinE.coliDrivenbyrd29APromoterfromArabidopsisthaliana

LU Yu-Jian1,2,3ZHANG Han-Jie3HAN Wen-Yu2SHEN Zhi-Qiang1,4*

(1.Postdoctoral Programme,Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy,Binzhou 256600；2.Postdoctoral Programme,Jilin University,Changchun 130062；3.Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta,Department of Life Sciences,Binzhou University,Binzhou 256603；4.Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy,Binzhou 256600)

MirabilisjalapaL. is a perennial herb ofNyctaginaceae. Not only is it a high-value ornamental flowering and greening plants, but also can be used as medicine.M.jalapaL. has good bioremediation function.M.jalapaL. was used as experimental material, and the perfect regeneration system was initially established. Therd29Apromoter ofArabidopsisthalianaandotsBgene inE.coliwere cloned by PCR respectively. Afterwards, therd29Apromoter andotsBgene were ligated into plasmid p2300-GFP, which would lead to the construction of p2300-rd29Apro-otsBexpression vector. Then, the expression vector was introduced into the cells ofM.jalapaL. byAgrobacterium-mediated method. The genetic transformation results showed that when the concentration ofAgrobacteriumwas OD600=0.5, the time of infection of mature embryo or nodal stem segments was 60 min, and the co-culture time was 2 d, the transformation efficiency ofM.jalapaL. was the highest. By PCR detection,otsBgene was successfully integrated into the genome ofM.jalapaL., and the efficient transcription could be performed.

MirabilisjalapaL.;rd29Apromoter;otsBgene;Agrobacterium;genetic transformation

山東省自然科學(xué)基金(ZR2012CL14)；濱州學(xué)院博士基金(2010Y08)

陸玉建(1979—)，男，博士，講師，主要從事細胞工程及分子生物學(xué)研究。

* 通信作者：E-mail:bzshenzq@163.com

2015-11-19

S685.16

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.03.013