侯受權(quán)，左然濤，常亞青，李廣，宋堅，張偉杰，趙沖

（大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，大連116023）

飼料脂肪水平對中間球海膽幼膽生長、消化酶和熱脅迫后抗氧化酶活力的影響

侯受權(quán)，左然濤，常亞青，李廣，宋堅，張偉杰，趙沖

（大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，大連116023）

為了確定中間球海膽Strongylocentrotus intermedius幼膽飼料中適宜的脂肪水平，采用攝食生長試驗探討了飼料中脂肪水平（3％、6％、9％、12％和15％）對海膽幼膽存活、生長、消化酶和熱脅迫后抗氧化酶活力的影響，試驗共進(jìn)行96 d。結(jié)果表明：試驗結(jié)束時，6％飼料脂肪水平組海膽增重率最高，顯著高于15％脂肪組（P＜0.05）；隨著飼料脂肪水平的升高，中間球海膽消化道中脂肪酶活力顯著升高（P＜0.05），淀粉酶活力顯著下降（P＜0.05），胃蛋白酶活力有下降趨勢（P＞0.05）；飼料脂肪水平顯著影響熱脅迫后海膽體腔液中抗氧化酶活力，其中熱脅迫2 h后，12％脂肪組超氧化物歧化酶（SOD）活力最高，顯著高于15％脂肪組（P＜0.05）；熱脅迫6 h后，海膽體腔液過氧化氫酶（CAT）活力最高值出現(xiàn)在6％脂肪組，且高于12％和15％脂肪組。研究表明，6％飼料脂肪水平時中間球海膽幼膽的生長速率最快，6％～12％飼料脂肪水平能夠顯著提高熱脅迫后海膽的抗氧化能力。

中間球海膽；飼料脂肪水平；消化酶；抗氧化酶

中間球海膽Strongylocentrotus intermedius原產(chǎn)于日本北海道和俄羅斯遠(yuǎn)東沿海，由于其性腺色澤好、味甜，在國際市場廣受歡迎。1989年，大連海洋大學(xué)將其引入中國，現(xiàn)已成為中國北方重要的海水養(yǎng)殖品種［1］。海帶、裙帶菜、石莼是海膽?zhàn)B殖的主要餌料來源。但是，鮮活生物餌料供應(yīng)極不穩(wěn)定，尤其是每年夏季高溫季節(jié)，只能以干品替代，且高溫期極易腐爛變質(zhì)，嚴(yán)重降低了海膽的成活率、攝食量和生長速率［2］。配合飼料因其原料來源廣泛、營養(yǎng)搭配均衡、飼料利用率高成為海膽?zhàn)B殖產(chǎn)業(yè)獲得突破性發(fā)展的關(guān)鍵。目前，配合飼料用于北方球海膽Strongylocentrotus droebachiensis［3-5］、加州紅海膽S.franciscanus［6］、Evechinus chloroticus［7］和中間球海膽S.intermedius［8-9］親膽?zhàn)B殖的研究已有報道，結(jié)果表明，配合飼料在降低餌料系數(shù)，提高海膽性腺指數(shù)和營養(yǎng)品質(zhì)方面具有生物餌料無可比擬的優(yōu)勢。但有關(guān)海膽幼膽營養(yǎng)生理的研究卻少有報道。適宜的脂肪水平不僅能夠提高動物的生長性能，而且有助于促進(jìn)動物機(jī)體免疫和抗應(yīng)激能力的發(fā)揮［10］。棘皮動物對脂肪的需求量相對較低，廖明玲［10］研究發(fā)現(xiàn)，刺參的最適脂肪需求為0.19％～1.36％。Gibbs等［11］研究發(fā)現(xiàn)，飼料中磷脂添加量超過7％時，海膽的生長性能受到顯著抑制，低于1.0％～6.4％磷脂水平處理組。

有關(guān)高溫脅迫下飼料脂肪水平影響海膽幼膽抗氧化能力的研究至今尚未見報道。因此，本研究中探討了飼料中不同脂肪水平對中間球海膽幼膽生長、消化酶和熱脅迫后體腔液中抗氧化酶活力的影響，以期為高溫季節(jié)海膽幼膽配合飼料中適宜脂肪水平的添加提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用中間球海膽幼膽為農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室同一批卵孵化培育的幼海膽。

1.2 方法

1.2.1 飼料的配制以海藻粉和豆粕為主要蛋白源，通過梯度添加用魚油配制的5種等氮（粗蛋白質(zhì)為20％）試驗飼料，使飼料脂肪水平分別為3％、6％、9％、12％、15％，并依次命名為L-3、L-6、L-9、L-12和L-15組（表1）。將所有粉狀原料粉碎過100目，并按照配比將飼料干粉進(jìn)行充分混合，然后將魚油和卵磷脂的混合物均勻搓至上述干粉飼料中。隨后，向加過魚油的原料中添加30％的自來水并利用攪拌機(jī)充分混合均勻。用雙螺桿制片機(jī)（濟(jì)南鼎潤機(jī)械有限公司）制成海膽片狀飼料（100 mm×50 mm×1.2 mm）。制作好的飼料于烘箱（40℃）中烘干，冷卻后用雙層塑料袋包裝，儲存于陰涼干燥處備用。試驗飼料的原料組成及營養(yǎng)成分實測值見表1。

表1 試驗飼料的原料組成和營養(yǎng)成分（飼料干物質(zhì)）Tab.1 Ingredients and approximate compositions of the experimental diets（dry matter）w/％

1.2.2 試驗設(shè)計 試驗開始前將試驗海膽置于1000 L水槽中暫養(yǎng)，每天換水和投喂配合飼料各一次（17：00），換水比例為總體積的50％。經(jīng)過2周馴化，將大小均勻、健康無病的海膽（初始體質(zhì)量3.83 g±0.40 g）分養(yǎng)至15個網(wǎng)籠（直徑15 cm，高20 cm）中，再將試驗網(wǎng)籠掛放在1000 L藍(lán)色玻璃鋼水槽中，每個網(wǎng)籠投放15只海膽。

試驗在農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室進(jìn)行，試驗周期為96 d。試驗期間，每天換水一次，換水比例為玻璃鋼水槽容積的50％。換水時吸底，以清除水槽底部的殘餌和糞便，每次換水后投喂一次配合飼料（17：00）。試驗期間，溶氧＞5 mg/L，水溫保持在（15±2）℃，鹽度為28～30。攝食生長試驗結(jié)束后，對每個網(wǎng)籠中的海膽進(jìn)行計數(shù)并稱重，計算成活率和體增重。從每個網(wǎng)籠中隨機(jī)選取3只海膽，分離消化道并收集于1.5 mL離心管中，用1 mL注射器吸取體腔液，在4℃下，以3000 r/min離心5 min，將上清液移至新的1.5 mL離心管中，消化道和體腔液上清用液氮速凍后保存于冰箱（-80℃）中備用。

1.2.3 熱應(yīng)激試驗 在攝食生長試驗結(jié)束后，將各組海膽置于26℃恒溫水槽中，并于熱應(yīng)激后15 min、2 h、6 h，從每個網(wǎng)籠各取3只海膽，解剖海膽并收集體腔液，液氮速凍后保存于冰箱（-80℃）中備用。

1.2.4 消化酶活力的測定 將-80℃下保存的腸道樣品在冰上解凍，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）= 1∶9的比例加入生理鹽水，在冰水浴條件下機(jī)械勻漿，冷凍離心（4℃，2500 r/min）10 min后留取上清液。胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、總蛋白含量的測定均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。利用Epoch酶標(biāo)儀（美國Biotek公司）對顯色溶液吸光度進(jìn)行測定。各消化酶活力定義為：每毫克組織蛋白在37℃下每分鐘分解蛋白生產(chǎn)1μg氨基酸相當(dāng)于一個胃蛋白酶活力單位（U）；每毫克蛋白在37℃下與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為一個淀粉酶活力單位（U）；在37℃條件下，每克組織蛋白與底物反應(yīng)1 min，每消耗1μmol底物為一個脂肪酶活力單位（U）。

1.2.5 抗氧化酶活力測定 采用南京建成試劑盒測定海膽體腔液抗氧化酶活力。各抗氧化酶活力定義為：每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50％時對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位（U）；每毫升血清或血漿每秒鐘分解1μmol的H2O2的量為一個過氧化氫酶（CAT）活力單位（U）；在37℃條件下，每分鐘每毫升血清（漿）使反應(yīng)體系的吸光度（OD）值增加0.01時，為一個總抗氧化能力（AOC）單位（U）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±S.E）表示。采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Turkey's法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料脂肪水平對中間球海膽存活和生長的影響

從表2可見：中間球海膽的存活率均大于89％，且各處理組之間無顯著性差異（P＞0.05）；隨著飼料脂肪水平的升高，海膽增重率總體呈現(xiàn)降低的趨勢；在32 d和64 d時，海膽最大增重率出現(xiàn)在L-3組，顯著高于L-15組（P＜0.05）；在96 d時，L-6組中間球海膽的增重率最大，與L-3、L-9和L-12組無顯著性差異（P＞0.05），但顯著高于L-15組（P＜0.05）。

2.2 飼料脂肪水平對中間球海膽消化酶活力的影響

從表3可見：中間球海膽胃蛋白酶活力隨著飼料脂肪水平的升高呈降低的趨勢，但各組間無顯著性差異（P＞0.05）；脂肪酶活力隨飼料脂肪水平的升高而升高，其中L-15組脂肪酶活力最高（15.76 U/mg），顯著高于L-3組（P＜0.05）；海膽消化道淀粉酶活力隨著飼料脂肪水平的升高呈逐漸降低的趨勢，其中L-3組海膽淀粉酶活力最高（2.14 U/mg），顯著高于L-9和L-15組（P＜0.05）。

表2 飼料脂肪水平對中間球海膽存活和生長的影響Tab.2 Effects of dietary lipid level on survival and grow th of sea urchin Strongylocentrotus intermedius％

表3 飼料脂肪水平對中間球海膽消化酶活力的影響Tab.3 Effects of dietary lipid level on activities of digestive enzymes in sea urchin U/mg

2.3 飼料脂肪水平對中間球海膽抗氧化酶活力的影響

從表4可見：熱應(yīng)激之前，當(dāng)飼料脂肪水平由3％升高至12％時，海膽體腔液SOD活力由32.06 U/mL顯著升高至36.62 U/mL（P＜0.05），隨著飼料脂肪水平的進(jìn)一步升高，SOD活力下降至33.81 U/mL（P＞0.05）；熱應(yīng)激2 h時，海膽體腔液SOD變化趨勢與熱應(yīng)激前一致，其中L-12組海膽體腔液中SOD酶活力最高（40.21 U/mL），顯著高于L-15組（P＜0.05），但與其他各組無顯著性差異（P＞0.05）；熱應(yīng)激6 h時，當(dāng)飼料脂肪水平由3％升高至6％時，海膽體腔液SOD活力由34.27 U/mL顯著升高至37.92 U/mL（P＜0.05），之后隨著飼料脂肪水平的進(jìn)一步升高，SOD活力顯著降至30.02 U/mL（P＜0.05）。

從表5可見：熱應(yīng)激前，飼料脂肪水平未對海膽體腔液AOC活力產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）；熱應(yīng)激15 min時，AOC活力隨脂肪水平的升高呈先升高后降低的趨勢，L-6組AOC活力最高（0.41 U/mL），顯著高于L-12和L-15組（P＜0.05）；熱應(yīng)激6 h時，AOC活力隨脂肪水平的升高而降低，L-3組海膽體腔液AOC活力最高（0.31 U/mL），與L-6組相當(dāng)（0.26 U/mL），均顯著高于其余各組（P＜0.05）。

表4 飼料脂肪水平對中間球海膽SOD活力的影響Tab.4 Effects of dietary lipid level on the SOD activity in sea urchin

表5 飼料脂肪水平對中間球海膽總抗氧化力的影響Tab.5 Effects of dietary lipid level on the totalanti-oxidative capacity in sea urchin

從表6可見：海膽體腔液CAT活力在熱應(yīng)激前后均無顯著性變化（P＞0.05），但隨著飼料脂肪水平的升高均呈先升高后降低的趨勢，且熱應(yīng)急6 h后飼料脂肪水平為6％時，CAT活力最高。

表6 飼料脂肪水平對中間球海膽CAT活力的影響Tab.6 Effects of dietary lipid level on the activity of catalase in sea urchin

3 討論

3.1 適宜的飼料脂肪水平能夠提高中間球海膽消化酶活力和生長速率

脂肪不僅是水產(chǎn)動物重要的能量來源，而且所含的脂肪酸尤其是必需脂肪酸在動物正常生長、免疫、性腺發(fā)育和繁殖性能過程中發(fā)揮著重要作用［12］。適宜的脂肪水平不僅能夠滿足水產(chǎn)動物對必需脂肪酸的需求，而且可以節(jié)約部分蛋白質(zhì)，從而降低因蛋白質(zhì)氧化分解產(chǎn)生的氨氮和亞硝酸鹽的含量。本研究表明，隨著中間球海膽幼膽飼料中脂肪水平的升高，中間球海膽幼膽存活率及增重率總體呈下降趨勢。以增重率作為評價指標(biāo)，中間球海膽幼膽的脂肪需求量為3％。Gibbs等［11］研究表明，隨著飼料中磷脂水平的升高，綠海膽幼膽的生長速率顯著降低，其對磷脂的最適需求量為1.0％。對刺參的研究表明，0.19％～1.36％的飼料脂肪水平即可滿足其營養(yǎng)需求［10］。與其他水產(chǎn)動物相比，棘皮動物對脂肪的需求量較低，這可能與大型藻類中脂肪含量較低有關(guān)。海膽主要食用部分為性腺，其中脂肪含量約為4.8％，刺參主要食用部分為體壁，脂肪含量約為0.2％［13］，而魚類肌肉中脂肪含量約為10％，機(jī)體脂肪沉積量的不同可能是不同動物脂肪營養(yǎng)需求差異的原因。海膽為底棲動物，且運動能力遲緩，因此，對能量的需求低于游動能力較強(qiáng)的魚類。此外，有研究表明，海膽似乎具有利用亞油酸（C18：2n-6，LA）和亞麻酸（C18：3n-3，LNA）合成花生四烯酸（C20：4n-6，ARA）、二十碳五烯酸（C20：5n-3，EPA）和二十二碳六烯酸（C22：6n-3，DHA）的能力［14］。本研究中攝食3％脂肪水平的飼料（未添加魚油）的海膽具有較高生長速率，具體機(jī)理需要進(jìn)行更深入地研究。

動物消化酶活力的高低決定了其消化道對不同營養(yǎng)物質(zhì)消化能力的強(qiáng)弱，消化酶活力的變化不僅受到飼料營養(yǎng)組成的影響，而且受到環(huán)境、生長階段和健康狀況等因素的影響［15］。本研究中發(fā)現(xiàn)，海膽脂肪酶活力隨飼料脂肪水平的升高而增強(qiáng)，說明動物能夠通過提高自身脂肪酶活力來應(yīng)對不斷提高的脂肪水平，從而提高其對脂肪的消化和吸收能力。廖明玲［10］發(fā)現(xiàn)，刺參腸道脂肪酶活力隨著飼料中脂肪水平的增加而升高。也有研究表明，隨著飼料脂肪水平升高，大鱗副泥鰍Paramisgurnus dabryanus［16］和大西洋鯡Clupea harengus［17］幼魚脂肪酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。韓光明等［18］發(fā)現(xiàn)，高脂飼料可顯著降低吉富羅非魚Oreochromis niloticus前、中腸脂肪酶活力。本研究中并未觀察到高脂肪水平組海膽脂肪酶活力受到抑制的現(xiàn)象，這可能與本試驗中最高脂肪水平（15％）不足夠高有關(guān)。隨著飼料脂肪水平的升高，中間球海膽消化道蛋白酶和淀粉酶活力均具有降低的趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，白甲魚Onychostoma sima、胭脂魚Myxocyprinus asiaticus腸道蛋白酶活力隨著飼料脂肪水平的升高而降低［19］。向梟等［20］研究認(rèn)為，當(dāng)飼料脂肪水平低于最適需求（7.14％～9.26％）時，翹嘴紅鲌Erythroculter ilishaeformis幼魚淀粉酶和蛋白酶活力隨著脂肪水平的升高而升高；超過最適需求時，淀粉酶和蛋白酶活力會隨飼料脂肪水平的升高而降低。有關(guān)飼料脂肪水平調(diào)控蛋白酶和淀粉酶活力的機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)一步探討。

3.2 適宜的脂肪水平能夠提高中間球海膽抗熱脅迫能力

超氧化物歧化酶（SOD）與過氧化氫酶（CAT）共同組成了生物體內(nèi)活性氧防御系統(tǒng)，在清除超氧自由基、過氧化氫和過氧化物，阻止或減少羥基自由基形成等方面發(fā)揮著重要作用［21］。隨著飼料脂肪水平的升高，熱應(yīng)激前后海膽體腔液中SOD活力呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，且在脂肪水平為12％時具有最大值。這與對大鱗副泥鰍［16］、梭魚Chelon haematocheilus［22］、紅鰭東方鲀Takifugu rubripes［23］的研究結(jié)果相似。本試驗中飼料脂肪水平是通過梯度添加魚油來實現(xiàn)的，即隨著飼料脂肪水平的升高n-3長鏈多不飽和脂肪酶（LC-PUFA）隨之升高。在最適脂肪范圍內(nèi)，隨著飼料中n-3 LC-PUFA水平的提高，奧尼羅非魚Oreochromis niloticus［24］和褐昌鲉Sebastiscusmarmoratus［25］魚體的抗氧化性也隨之升高。過高水平的n-3 LC-PUFA在體內(nèi)會發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，致使機(jī)體產(chǎn)生較高含量的超氧陰離子，超氧陰離子會攻擊機(jī)體組織［26-27］，體內(nèi)SOD具有消除超氧陰離子的作用［28］，因此，脂肪水平最高的組海膽機(jī)體的SOD活力最低，可能與高含量的n-3 LC-PUFA有關(guān)。本研究中同時發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激（26℃）15 min時，海膽SOD活力較應(yīng)激前有較大幅度的降低，這可能是因為動物體在感受熱應(yīng)激時，機(jī)體動用大量的SOD來應(yīng)對外源性的氧化應(yīng)激，而在應(yīng)激2 h之后，各處理組SOD活力雖有差異，但總體上活力恢復(fù)至熱應(yīng)激之前的水平，這說明海膽為了適應(yīng)外界溫度變化而合成了大量SOD以補充前期消耗。相比于SOD，熱應(yīng)激之前各飼料處理組海膽體腔液中AOC活力均處于較低水平，且各處理組間差異不顯著。在熱應(yīng)激之后，AOC活力有較大幅度提高，在15 min時，6％脂肪水平組AOC活力最高，2 h時15％脂肪水平組活力最高，說明在熱應(yīng)激初期，n-3 LC-PUFA會逐漸發(fā)揮其抗氧化功能。但隨著氧化應(yīng)激程度的加劇，在應(yīng)激后6 h，AOC活力隨著飼料脂肪水平的升高而顯著降低，說明n-3 LC-PUFA可能是通過自身氧化來保護(hù)機(jī)體抗氧化酶活力，而一旦全部被氧化，脂肪酸的氧化產(chǎn)物超氧陰離子會嚴(yán)重危害機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)，致使高脂肪組海膽抗氧化酶活力降至最低。

綜上所述，隨著飼料脂肪水平的升高，中間球海膽生長速率、淀粉酶和蛋白酶活力降低，且在飼料脂肪水平6％時具有最大生長速率，而較高脂肪水平（6％～12％）能顯著提高中間球海膽體腔液中抗氧化酶活力。

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Effects of dietary lipid level on grow th performance，digestive enzyme activity and anti-oxidative capacity after heat stress in juvenile sea urchin Strongylocentrotus intermedius

HOU Shou-quan，ZUO Ran-tao，CHANG Ya-qing，LIGuang，SONG Jian，ZHANGWei-jie，ZHAO Chong

（Key Laboratory of Mariculture＆amp;Stock Enhancement in North China's Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Juvenile sea urchin Strongylocentrotus intermedius were fed diets containing 3％，6％，9％，12％and 15％of lipid for 96 days to investigate the effects of dietary lipid levels on growth performance，digestive enzyme activity and anti-oxidative capacity.Results showed that there was significantly higher or themaximal weight gain rate（WGR）in the sea urchin fed the diet containing 3％lipid than that in the sea urchin fed the diet containing 15％lipid（P＜0.05）.The amylase activity was shown to be significantly lower（P＜0.05）and lower in pepsin in the sea urchin juveniles fed the elevated lipid diets.Lipase activity was increased significantly with the increase in dietary lipid（P＜0.05）.Relatively high dietary lipid（6％-12％）led to improve activity of superoxide dismutase（SOD）and anti-oxidant capacity（AOC）in the thermal stress sea urchin，with the maximal SOD activity in the sea urchin exposed to 2 and 6 hour thermal stress in the 12％dietary lipid group，and significantly higher than that in the 15％dietary lipid group（P＜0.05）.Themaximal catalase（CAT）activity in coelomic fluid was observed in the sea urchin exposed to 15 min and 6 hour thermal stress in the 6％dietary lipid group，significantly higher than that in the 12％and 15％dietary lipid groups，and higher than that in the 15％dietary lipid group（P＜0.05），indicating that6％-12％lipid was of the optimal for improvement of anti-oxidative capacity in response to thermal stress，though 6％lipid was suggested to be optimal for the growth of sea urchin.

Strongylocentrotus intermedius；dietary lipid level；digestive enzyme；anti-oxidative enzyme

S917.4

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.05.012

2095-1388（2016）05-0538-06

2016-07-19

遼寧省農(nóng)業(yè)攻關(guān)及成果產(chǎn)業(yè)化項目（2015203003）；中國科協(xié)“青年人才托舉工程”資助；國家自然科學(xué)基金資助項目（41606180）

侯受權(quán)（1990—），男，碩士。E-mail：ythsq2014@163.com

左然濤（1985—），男，博士，講師。E-mail：rtzuo@dlou.edu.cn