陳麗園，桑子陽，陳發(fā)菊，馬履一

(1 北京林業(yè)大學 森林培育與保護教育部重點實驗室，北京 100083；2 三峽大學 生物技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 443002)

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紅花玉蘭大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育的研究

陳麗園1，桑子陽1，陳發(fā)菊2，馬履一1

(1 北京林業(yè)大學 森林培育與保護教育部重點實驗室，北京 100083；2 三峽大學 生物技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 443002)

【目的】 對紅花玉蘭(Magnoliawufengensis)大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體發(fā)育過程進行顯微觀察，探討其自然狀態(tài)下結(jié)籽率低的原因。【方法】 于2012年5月紅花玉蘭花芽分化開始每月采花芽1次，直至次年開花，采用常規(guī)石蠟切片法制片,對紅花玉蘭大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體發(fā)育進行詳細的細胞學觀察?！窘Y(jié)果】 紅花玉蘭雌蕊成熟時倒生胚珠，雙珠被，厚珠心，大孢子為單胞子發(fā)生型，成熟胚囊為7胞8核胚囊，蓼型胚囊發(fā)育方式。雄蕊花藥四室，腺質(zhì)型絨氈層，成熟花粉粒為二細胞型?！窘Y(jié)論】 紅花玉蘭大、小孢子發(fā)生以及雌、雄配子體發(fā)育過程中未見異?，F(xiàn)象，因此該物種雌、雄蕊發(fā)育不是導致其瀕危的因素。

紅花玉蘭；大孢子發(fā)生；小孢子發(fā)生；雌、雄配子體發(fā)育；細胞學觀察

紅花玉蘭(MagnoliawufengensisL.Y.Ma et L.R.Wang)屬木蘭科木蘭屬玉蘭亞屬,主要分布在湖北省五峰縣西南部，生長于海拔1 000～1 500 m的山坡[1-2]。紅花玉蘭性狀原始，自然變異豐富，具有很高的研究價值。該樹種樹形優(yōu)美，花大芬芳，具有極高的觀賞利用價值。但是由于該物種種群分布區(qū)域狹小，加上大量采挖，生境破壞嚴重，導致其數(shù)量稀少，處于瀕危狀態(tài)。

對木蘭科幾個種的胚胎發(fā)育過程進行研究發(fā)現(xiàn)，生殖發(fā)育中的異?，F(xiàn)象成為導致其瀕危的重要因素，如對西疇含笑的研究發(fā)現(xiàn)，其花粉胚胎發(fā)育異常，授粉昆蟲少且近親繁殖[3]；香港木蘭在空氣濕度低的條件下，單核花粉敗育[4]；觀光木在陽光不足的條件下花粉大量敗育[5]，而且大孢子發(fā)生與雌配子體發(fā)育各個階段都會出現(xiàn)敗育現(xiàn)象，導致其瀕危[6]；廣西含笑在小孢子母細胞減數(shù)分裂時期敗育[7]；凹葉厚樸的大、小孢子和雌、雄配子體都會部分敗育[8]。然而，對煥鏞木[9]、天女木蘭[10]和紅花木蓮[11]的研究發(fā)現(xiàn)，生殖生物學變化不是造成樹種瀕危的主要原因。近年來，對紅花玉蘭的研究主要集中在種質(zhì)資源保護、抗逆性、遺傳多樣性以及花發(fā)育調(diào)控等[12-15]方面，而對該物種胚胎發(fā)育的細胞學研究未見報道。因此，本研究采用常規(guī)石蠟切片技術(shù)，對紅花玉蘭大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體發(fā)育進行了詳細的細胞學觀察，擬從生殖生物學角度分析該物種結(jié)實率低的原因，為該物種的保護提供決策依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

用于紅花玉蘭胚胎學研究的材料采自湖北五峰縣梨子坪，從2012年5月花芽分化開始，每月采花芽1次,直至次年開花，每次采5個花芽于FAA溶液(體積分數(shù)70%乙醇90 mL,醋酸5 mL,福爾馬林5 mL)中固定24 h，然后轉(zhuǎn)入體積分數(shù)70%乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

采用石蠟切片法[16]制片，切片厚度8 μm，連續(xù)切片，用番紅-固綠(Safranin-Fast Green)對染法染色[17]，脫水透明，加拿大樹膠封片，最后于Nikon Eclipse 80i顯微鏡下觀察并照相。

2　結(jié)果與分析

2.1紅花玉蘭大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育

紅花玉蘭大孢子的發(fā)生和雌配子體的發(fā)育見圖版Ⅰ。

紅花玉蘭具淡紫紅色的離心皮雌蕊群，呈螺旋狀排列(圖版Ⅰ-1)。1個雌蕊由1個類似葉片的心皮向內(nèi)折疊卷曲，與邊緣連接形成一室子房，并在邊緣形成胎座，其表皮下層細胞分裂產(chǎn)生突起，形成一團珠心組織，即初生的胚珠原基，珠心組織中間產(chǎn)生1個孢原細胞(圖版Ⅰ-2)，繼而通過有絲分裂(圖版Ⅰ-3)形成1個初生周緣細胞和1個初生造孢細胞(圖版Ⅰ-4)。在圖版Ⅰ-5中可見紅花玉蘭的子房具1室，每室2個胚珠，每個胚珠含1個大孢子母細胞。

胚珠近珠孔端的初生周緣細胞經(jīng)過垂周和平周分裂形成2～4層細胞，將合點端由初生造孢細胞發(fā)育的大孢子母細胞包裹在其中(圖版Ⅰ-6)。大孢子母細胞經(jīng)過2次減數(shù)分裂形成大孢子四分體，其中合點端的1個成為功能大孢子，而其余3個退化，隨后進入胚囊發(fā)育階段。

胚囊發(fā)育之初，功能大孢子的體積開始增大，同時出現(xiàn)了液泡，即單核胚囊(圖版Ⅰ-7)。第1次有絲分裂后形成2個游離核(圖版Ⅰ-8)，分別移到胚囊兩極，中間無細胞壁，即二核胚囊。第2次有絲分裂后形成四核胚囊，第3次有絲分裂后共生成8個游離的核，4個在珠孔端，4個在合點端；在珠孔端與合點端的4個核中，各有1個核向胚囊中心靠攏(圖版Ⅰ-9)，融合成為中央極核。與此同時，核之間出現(xiàn)細胞膜，把胚囊隔成7個細胞，中央極核同處于一個中央細胞(圖版Ⅰ-10)；合點端的另外3個細胞聚在一起成為反足細胞；珠孔端的3個核形成2個助細胞(圖版Ⅰ-11)，與長梨形卵細胞組成卵器(圖版Ⅰ-12)。從大孢子發(fā)生到雌配子體發(fā)育完成，胚珠的珠柄與珠被的不對稱生長使胚珠的珠孔一端逐漸向下方彎轉(zhuǎn)，形成倒生型胚珠，雙珠被，厚珠心。紅花玉蘭大孢子發(fā)生與雌配子體發(fā)育的特點與木蘭科其他植物的細胞學特征[18]一致。

2.2紅花玉蘭小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育

紅花玉蘭雄蕊多數(shù)，離生，螺旋狀排列，花絲極短，基部著生在圓錐狀的花托上，上部花藥原基的下表皮細胞體積增大，細胞核明顯且富含細胞質(zhì)(圖版Ⅱ-1)；4個角隅細胞快速分裂形成4個瓣裂(圖版Ⅱ-2)，后期發(fā)育成4個花粉囊，在近軸面呈線性排列。每一瓣表皮下分化出孢原細胞(圖版Ⅱ-3)，較其他細胞大，徑向延長并有顯著的細胞核。孢原細胞進行一次平周分裂，形成2個細胞，外面的是初生周緣細胞，里面是初生造孢細胞(圖版Ⅱ-4)。經(jīng)過有絲分裂形成次生造孢細胞(圖版Ⅱ-5)，并進一步發(fā)育為小孢子母細胞。

初生周緣細胞進行一次平周分裂，生成兩層次生周緣細胞，外層發(fā)育為藥室內(nèi)壁，即纖維層；內(nèi)層再進行一次平周分裂，所形成的兩層細胞分別發(fā)育為中層和絨氈層(圖版Ⅱ-6),在雄配子體的整個形成過程中提供充足的營養(yǎng)。小孢子形成初期，絨氈層為單核，細胞質(zhì)濃厚并緊貼小孢子母細胞，在小孢子發(fā)育時期絨氈層細胞十分活躍，可見其細胞核多分裂為二核或多核。小孢子母細胞經(jīng)過減數(shù)分裂形成四分體小孢子，被共同的胼胝質(zhì)壁包圍并分隔，隨著胼胝質(zhì)壁溶解消失，小孢子釋放到藥室中，即單核花粉(圖版Ⅱ-7)。這時的絨氈層已經(jīng)開始解體，小孢子體積增大，細胞質(zhì)液泡化，細胞壁加厚，核轉(zhuǎn)移到細胞壁邊，在這里又進行一次有絲分裂。接著發(fā)生胞質(zhì)分裂，大液泡、大部分細胞質(zhì)和營養(yǎng)核被圍在同一個細胞內(nèi)，形成二細胞型花粉而生殖核呈梭狀貼于細胞壁上(圖版Ⅱ-8)，僅含少量細胞質(zhì)。此時中層貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被吸收而解體，生殖細胞逐漸脫離花粉內(nèi)壁，游離在營養(yǎng)細胞的細胞質(zhì)中(圖版Ⅱ-9)。當花藥發(fā)育成熟時，藥室內(nèi)壁細胞徑向延長并呈帶狀加厚，加厚的物質(zhì)主要是纖維素，絨氈層幾乎消失殆盡，繼而相鄰2個小孢子囊連接處裂開，花粉散出。

圖版Ⅰ紅花玉蘭大孢子的發(fā)生和雌配子體的發(fā)育

1． 雌蕊縱切；2.孢原細胞；3.孢原細孢有絲分裂；4.初生造孢細胞和初生周緣細胞；5.子房1室,2胚珠；6.大孢子母細胞；

7.單核胚囊；8.單核胚囊有絲分裂后期；9.未融合的中央細胞；10.反足細胞和中央細胞；11.2個助細胞；12.卵器

Plate ⅠMegasporogenesis and female gametophyte development ofMagnoliawufengensis

1.Pistil;2.Sporogonium;3.Mitosis of sporogonium;4.Primary sporogenous cell and primary parietal cell;5.Ovary with 1 room and 2 ovules;6.Megasporocyte;7.Mononuclear embryo sac;8.Mitosis anaphase of mononuclear embryo sac;9.Nuclear-merging central cell;10.Antipodal cell and central cell;11.2 synergid cells;12.Egg apparatus

圖版Ⅱ紅花玉蘭小孢子的發(fā)生和雄配子體的發(fā)育

1.花藥原基下表皮細胞；2.花藥原基的4個角隅；3.花藥橫切，4個花粉囊和藥隔，孢原細胞；4.初生周緣細胞和初生造孢細胞；5.次生造孢細胞；6.從外到內(nèi)依次為表皮、纖維層、中層、絨氈層；7.單核花粉；8.二細胞型花粉，生殖核；9.成熟花粉囊

Plate ⅡMicrosporogenesis and male gametophyte development ofMagnoliawufengensis

1.Anther primordia epidermal cells;2.Anther primordial 4 corners;3.Anther,4 pollen sac and sporogonium;4.Primary sporogenous cell and primary parietal cell;5.Secondary sporogenous cell;6.From outside to inside:epidermis,ffibrous layer,middle lamella,tapetum;7.Mononuclear pollen;8.Two-cellulae pollen;9.Mature pollen sac

3　討論與結(jié)論

從對紅花玉蘭大、小孢子發(fā)生和雌、雄配子體形成過程的大量切片觀察結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，紅花玉蘭胚珠倒生，雙珠被，厚珠心，四分體呈直線排列，合點端為功能大孢子，胚囊為單孢子發(fā)生類型，胚囊的發(fā)育方式與木蘭科其他植物的胚囊發(fā)育類型相同，屬于原始的發(fā)育類型[11,18-22]。在同科植物香木蓮和紅花木蓮有性生殖過程研究中發(fā)現(xiàn)，紅花木蓮成熟胚囊的卵細胞敗育率高達79.1%[18]；香木蓮功能大孢子退化率為27.9%，受精前卵器退化率高達80%[20]。

紅花玉蘭的花藥有4個花粉囊。在花粉發(fā)育過程中，花藥壁由外到內(nèi)依次為表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層，但是當花粉發(fā)育成熟時，藥室內(nèi)壁細胞纖維化并增厚，最終破裂并釋放出成熟的二核細胞的花粉，這些發(fā)育特征與香木蓮、紅花木蓮、灰木蓮以及華木蓮等木蘭科植物基本相同[18-20,22]。但紅花玉蘭的絨氈層僅由一層大型多核細胞構(gòu)成，與巴東木蓮和華木蓮[22-23]一致，而與香木蓮、紅花木蓮、灰木蓮由多層細胞構(gòu)成的絨氈層不同[11,19-20]，這種發(fā)育上的差異值得進一步研究。

由于在紅花玉蘭大、小孢子發(fā)生發(fā)育以及雌、雄配子體形成過程中，未觀察到胚珠敗育、卵器退化和小孢子敗育等異?，F(xiàn)象，因此紅花玉蘭大、小孢子發(fā)生發(fā)育以及雌、雄配子體的形成過程對該物種的結(jié)實影響不大，其結(jié)實率低及瀕危原因有待進一步研究。

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Sporogenesis and gametophytes development ofMagnoliawufengensis

CHEN Liyuan1,SANG Ziyang1,CHEN Faju2，MA Lüyi1

(1KeyLaboratoryforSilvicultureandConservationoftheMinistryofEducation,BeijingForestryUniversity,Beijing100083,China;2BiotechnologyResearchCenter,ChinaThreeGorgesUniversity,Yichang,Hubei443002,China)

【Objective】 The genesis of megaspore,microspore,and development of male and female gametophyte populations ofMagnoliawufengensiswere studied to understand the causes of natural regeneration difficulties.【Method】 The genesis of megaspore and microspore, and development of male and female gametophyte were observed and studied by cytology observation ofM.wufengensisparaffin section every month from May 2012 to flowering of next year.【Result】 Characteristics of matureM.wufengensispistil include anatropous ovule,two layers of integument,thick nucellus,single-spore megasporogenesis,and seven-cell structured polygonum embryo sac assembling with eight nuclei.Stamens have four roomed anthers,glandular tapetum,and two-cellular mature pollen.【Conclusion】 Microsporogenesis and development of female and male gametophytes ofM.wufengensiswere normal,which is not the reason of species scarcity.

Magnoliawufengensis;megasporogenesis;microsporogenesis;female and male gametophyte development;cytological observation

時間:2016-08-0909:41DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.09.024

2015-01-30

國家自然科學基金項目“紅花玉蘭及多瓣紅花玉蘭花器官特征決定B類基因表達模式和功能分析”(31170625)；國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項“紅花玉蘭品種選育與規(guī)?；敝臣夹g(shù)研究”(201504704)；北京市科技計劃項目“首都平原百萬畝造林科技支撐工程”(Z121100008512002)；國家林業(yè)局林業(yè)科學技術(shù)研究項目“紅花玉蘭種質(zhì)資源收集保護、遺傳測定與開發(fā)”(2006-39)

陳麗園(1985-)，女，山西晉中人，博士，主要從事森林培育研究。E-mail：yuanyuan.0009@163.com

馬履一(1957-)，男，云南大理人，教授，博士，博士生導師，主要從事森林培育研究。E-mail：maluyi@bjfu.edu.cn

S685.15

A

1671-9387(2016)09-0181-05

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