徐 靜，曲 偉，孫義峰（青島市環(huán)境監(jiān)測中心站，山東青島266000）

辛酰溴苯腈高效降解菌的篩選、分離與鑒定研究

徐 靜，曲 偉，孫義峰（青島市環(huán)境監(jiān)測中心站，山東青島266000）

本研究從生產(chǎn)辛酰溴苯腈農(nóng)藥廠廢水處理池中污泥中經(jīng)過富集、分離、篩選得到一株能以辛酰溴苯腈為唯一碳源生長的菌株，根據(jù)表型特征、生理生化特性，結(jié)合16SrRNA基因序列同源性比較，將菌株初步鑒定為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.），命名為XB2。在辛酰溴苯睛最終濃度為100mg·L-1的工業(yè)廢水經(jīng)菌株XB2處理7d后，辛酰溴苯睛的去除率達(dá)到92.78%，說明菌株XB2在廢水處理中具有很好的應(yīng)用前景。

辛酰溴苯睛；不動(dòng)桿菌屬；分離鑒定

辛酰溴苯腈（Bromoxynil octanoate）是一種選擇性除草劑，廣泛應(yīng)用于小麥和玉米田中防除雜草，化學(xué)名稱為3，5-二溴-4-辛酰氧苯甲腈［1］。該藥對(duì)土壤、環(huán)境造成嚴(yán)重危害，對(duì)人類健康也帶來潛在危害。經(jīng)研究證明，微生物對(duì)土壤和水環(huán)境中的農(nóng)藥降解起著關(guān)鍵作用［2～3］。

本研究從生產(chǎn)辛酰溴苯腈農(nóng)藥廠污水處理池的活性污泥中分離篩選出一株能夠以辛酰溴苯腈為唯一碳源生長并將其快速降解的高效降解菌，并經(jīng)過鑒定為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.），命名為XB2，并對(duì)其進(jìn)行了降解效果研究，以期為在實(shí)踐中利用微生物消除環(huán)境中辛酰溴苯腈的污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑

無機(jī)鹽培養(yǎng)基 （g·L-1）：NaCl1.0，（NH4）2SO41.0，KH2PO40.5，K2HPO41.5，MgSO4·7H2O 0.2，去離子水補(bǔ)足至1000mL，pH7.0。

LB培養(yǎng)基（g·L-1）：NaCl 10.0，蛋白胨 10.0，酵母粉 5.0，pH7.0；添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂即為固體培養(yǎng)基。

富集分離培養(yǎng)基：無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加辛酰溴苯腈儲(chǔ)備液作為唯一碳源，濃度視要求添加，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂即為固體培養(yǎng)基。

辛酰溴苯腈（純度≥97%）購自江蘇蘇州某農(nóng)藥廠。使用前將辛酰溴苯睛原藥溶于丙酮溶液并過濾除菌，試驗(yàn)按所需濃度添加到各培養(yǎng)基中。二氯甲烷、丙酮為分析純，甲醇為色譜純，購自Sigma公司。活性污泥取自江蘇蘇州某農(nóng)藥廠的污水處理池。

1.2 辛酰溴苯腈含量的測定

取待測定辛酰溴苯睛無機(jī)鹽培養(yǎng)基，加等體積二氯甲烷，振蕩萃取后取下層有機(jī)相過無水硫酸鈉柱，紫外掃描。再利用液相色譜儀進(jìn)一步定量，待二氯甲烷吹干后，加入甲醇（色譜純）重新溶解，經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定，測定條件如下：ultimate C18（2μm，250mm×4.6mm）色譜柱，流速1.0mL/min；流動(dòng)相：甲醇（色譜純），經(jīng)0.45μm濾膜過濾，并用超聲波清洗器脫氣30min；檢測波長229nm，進(jìn)樣體積20μL，采用外標(biāo)法按峰面積定量。

1.3 降解菌株的富集、分離與純化

取農(nóng)藥廠污水處理池中的活性污泥5g，加入到100mL辛酰溴苯腈濃度為 100mg·L-1的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃、160r· min-1條件下培養(yǎng)，每隔5d以5%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的接種量接入到新鮮富集分離培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)接4次。富集液經(jīng)紫外掃描儀和液相色譜法測定，富集培養(yǎng)液經(jīng)測定降解效果達(dá)90%以上的富集液，即為有活性的富集液。取1mL活性富集液作梯度稀釋，用無菌水分別稀釋到10-2～10-6五個(gè)梯度，取稀釋過的液體各0.2mL涂布于300mg·L-1無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)，挑取單菌落劃線分離純化。純化后的菌株轉(zhuǎn)接至加有100mg·L-1辛酰溴苯腈的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃、160r· min-1搖床培養(yǎng)5d后檢測其降解效果。

1.4 降解菌株的鑒定

1.4.1 降解菌株的培養(yǎng)特征及生理生化鑒定

將降解菌株采用平板涂布法接種于LB固體培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)48h后觀察菌落形態(tài)。并用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)，降解菌的鑒定參照 《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［4］和《Bergey’smanual of determinative bacteriology》［5］進(jìn)行。

1.4.2 降解菌株16SrRNA基因序列測定與分析

采用SDS高鹽沉淀法［6］提取菌體總DNA。提取菌體總DNA作為模板，進(jìn)行16SrRNA基因擴(kuò)增。16S rRNA基因采用通用引物［7］進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′（Escherichia colibases8 to27），下游引物為5′-TACCTTGTTACGACTT-3′（Escherichiacolibases1507 to1492）。采用PCR回收試劑盒回收目的片段，將回收的DNA酶連到T載體上。參照《精編分子生物學(xué)指南》［8］進(jìn)行質(zhì)粒DNA的小量提取，提取的質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證，將質(zhì)粒正確的轉(zhuǎn)化子送至測序公司。測序結(jié)果通過在線分析，與EzTaxon server 2.1基因庫中已有的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 含辛酰溴苯睛廢水的生物處理

取農(nóng)藥廠含辛酰溴苯睛廢水200mL，加入100mL的去離子水，再加入20mL的5倍濃度的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH至7.0，按10%的體積分?jǐn)?shù)接入降解菌株XB2種子液，在30℃、160r·min-1搖床培養(yǎng)7d，測定辛酰溴苯睛殘留量。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌株的分離篩選及降解效果驗(yàn)證

通過多次富集轉(zhuǎn)接，得到降解效果明顯的富集液，從該富集液中，分離純化得到一株能以辛酰溴苯腈為唯一碳源生長的菌株，命名為XB2，降解辛酰溴苯腈的效果如圖1所示，通過HPLC測定，經(jīng)過XB2處理后辛酰溴苯腈含量由100mg·L-1降為3.28mg·L-1，降解率高達(dá)96%以上，降解效果顯著。

圖1 XB2降解辛酰溴苯腈的液相色譜檢測

2.2 菌株XB2的生理生化特征及系統(tǒng)發(fā)育定位

表1 XB2的生理生化特征

測序結(jié)果顯示擴(kuò)增所得的16SrRNA總共1496個(gè)堿基，登錄號(hào)是 HM149349。發(fā)現(xiàn)菌株 XB2與 Acinetobacter calcoaceticus同源性為99%。根據(jù)生理生化結(jié)果及序列特征，菌株XB2被鑒定為Acinetobacter sp.，其系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖2 菌株XB2的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株XB2處理含辛酰溴苯睛的廢水

由于高濃度的辛酰溴苯睛對(duì)菌株具有一定毒性抑制其生長，所以對(duì)辛酰溴苯睛廢水進(jìn)行了稀釋，再把菌株接種到廢水中進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過稀釋處理后的廢水，辛酰溴苯睛的去除效果良好。在經(jīng)過稀釋處理后的含辛酰溴苯睛濃度為100mg·L-1的工業(yè)廢水中，加入一定體積的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，接種10%體積的菌株XB2培養(yǎng)7d后，辛酰溴苯睛的殘留量為7.22mg·L-1，去除率達(dá)到92.78%，所以菌株XB2在含辛酰溴苯睛的工業(yè)廢水的生物處理中具有很好的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

（1）通過富集培養(yǎng)，獲得一株能以辛酰溴苯睛為唯一碳源的降解菌株XB2，運(yùn)用16S rRNA基因擴(kuò)增和Blastn軟件分析等方法，XB2菌株初步鑒定為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）。該菌株為革蘭氏陰性菌。不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）是一種比較常見的微生物［9～10］，廣泛存在于土壤和水體中。

（2）經(jīng)過辛酰溴苯睛降解菌株XB2處理后辛酰溴苯腈含量由100mg·L-1降為3.28mg·L-1，降解率高達(dá)96%以上，降解效果顯著。

（3）廢水小試實(shí)驗(yàn)表明，在經(jīng)過稀釋處理后的含辛酰溴苯睛濃度為100mg·L-1的工業(yè)廢水中，加入一定體積的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，接種10%體積的菌株XB2培養(yǎng)7d后，辛酰溴苯睛的去除率達(dá)到92.78%，所以菌株XB2在含辛酰溴苯睛的工業(yè)廢水的生物處理中具有很好的應(yīng)用潛力。

［1］徐 妍，馬 超，胡奕俊.辛酰溴苯腈生產(chǎn)現(xiàn)狀與市場分析［J］.山東農(nóng)藥信息，2009（08）：18～20.

［2］Courteix A，Bergel A.Horseradish peroxidase-catalyzed hydroxylation of phenol：I.Thermodynamic analysis［J］.Enzyme and Microbial Technology，1995，17（12）：1087～1093.

［3］Sogorb M A，Vilanova E.Enzymes involved in the detoxification of orga nophosphorus，carbamate and pyrethroid insecticides through hydrolysis［J］.Toxicology Letters，2002，128（1～3）：215～228.

［4］東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.科學(xué)出版社，2001：267～273.

［5］Buchanan，R.E.and N.E.Gibbons.Bergey′s manual of determinative bacteriology［M］.8thedition.TheWilliams&wilkins Company，1986.

［6］Miller，S.A.，D.D.Dykes，H.F.Polesky.A simple salting out procedure for extractingDNA from human nucleated cells［J］.Nucleic AcidsRes，1988，16（3）：12～15.

［7］Stackebrandt E，Goodfellow M.Nuecleic acid techniques in bacterial systematics［M］.UK：John Wiley&Sons，1991：371～375.

［8］F·奧斯伯，R·布倫特，R·E·金斯頓，等.精編分子生物學(xué)指南［M］.北京：科學(xué)技術(shù)出版社，1999：36～40.

［9］鄭永良，高強(qiáng)，王 瑋，等.甲胺磷農(nóng)藥降解菌HS-A32的分離鑒定及降解特性［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2006，12（3）：399～403.

［10］王永杰，李順鵬，沈 標(biāo).有機(jī)磷農(nóng)藥樂果降解菌的分離及其活性研究［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24（2）：71～74.

X172

A

2095-2066（2016）29-0004-02

2016-10-3