冀雄飛， 王力東， 王春琳， 宋微微， 母昌考， 李榮華

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室浙江海洋高效健康水產(chǎn)養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心， 寧波 315211)

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D-半乳糖致糖基化小鼠模型的評價

冀雄飛， 王力東， 王春琳， 宋微微， 母昌考， 李榮華

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室浙江海洋高效健康水產(chǎn)養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心， 寧波 315211)

采用200 mg·kg-1·d-1的D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠45 d建立糖基化模型，通過新物體識別檢測模型組與正常對照組小鼠行為學(xué)差異，進(jìn)一步利用酶聯(lián)免疫法檢測小鼠腦、心、肝、脾、肺、腎、皮膚、肌肉和血清中的糖基化末端產(chǎn)物和相關(guān)受體的表達(dá)量(AGEs、RAGE、sRAGE和esRAGE)，分析該模型中4種指標(biāo)的變化情況。結(jié)果表明模型組小鼠的辨別指數(shù)顯著低于空白組(P<0.01)，模型組小鼠各組織器官中的糖基化末端產(chǎn)物和相關(guān)受體的表達(dá)量顯著高于空白組(P<0.01)；D-半乳糖慢性處理45 d后的小鼠從行為上有一定的遲緩，同時在對各個不同組織器官的生理指標(biāo)的檢測中發(fā)現(xiàn)機(jī)體處于高糖基化狀態(tài)，可用于研究AGEs及其受體的發(fā)病機(jī)理和藥物治療作用途徑，并且可以選用多個組織器官作為實驗靶點。旨在為頸背部皮下注射D-半乳糖致糖基化小鼠模型提供理論依據(jù)。

D-半乳糖；糖基化模型；AGEs；RAGE；sRAGE；esRAGE

晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products，AGEs)是指在非酶條件下，還原糖與蛋白質(zhì)等一些有機(jī)大分子物質(zhì)的游離氨基端反應(yīng)形成不可逆的、形式多樣的聚合物。隨著年齡的增加，AGEs會不斷在體內(nèi)積累，對機(jī)體造成損傷或?qū)е履承┘膊〉陌l(fā)生。AGEs 導(dǎo)致機(jī)體疾病或損傷的途徑有多種，除了與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的直接作用，導(dǎo)致機(jī)體病變外，還通過與其細(xì)胞表面的晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products， RAGE)相互結(jié)合，激活細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，從而干擾細(xì)胞功能，間接引發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)，對機(jī)體造成損害[1]；也可與一些游離的不具有激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的RAGE異構(gòu)體，如可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(soluble receptor for advanced glycation end products，sRAGE)、內(nèi)源性分泌型晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(endogenous secretory receptor for advanced glycation end products，esRAGE)等結(jié)合，使其無法與RAGE結(jié)合，以減少對機(jī)體的威脅。

近幾年研究發(fā)現(xiàn)AGEs及其受體與肝病、腎病[3]、心血管疾病[4]、動脈粥樣硬化[5]、阿爾茨海默病[6-7]、腫瘤、骨質(zhì)疏松、慢性阻塞性肺疾病等密切相關(guān)，并在多種疾病中有舉足輕重的作用。目前有關(guān)糖基化的研究，大多建立在某種疾病動物模型的基礎(chǔ)上，把AGEs及其某些受體的水平變化與某些疾病聯(lián)系到一起，例如：衰老模型、糖尿病模型等，但還沒有一個公認(rèn)的用來研究處于高糖基化狀態(tài)下的動物模型。糖基化動物模型是揭示糖基化致病和藥物治療機(jī)制的實驗工具。隨著非酶糖基化研究的深入，簡單、可靠的糖基化模型成為熱點。

D-半乳糖是目前用來建立亞急性衰老模型的工具藥，該模型被廣泛應(yīng)用于藥物抗衰老的研究之中。D-半乳糖作為一種還原性的醛糖可通過非酶促途徑和多元醇途徑增強(qiáng)體內(nèi)糖基化反應(yīng)，產(chǎn)生大量的AGEs。同時，D-半乳糖長期處理小鼠，致使其血糖水平升高，體內(nèi)的醛糖還原酶活性增強(qiáng)，加速AGEs的合成，造成AGEs的蓄積。所以頸背部注射D-半乳糖可以使小鼠處于高糖基化狀態(tài)。

實驗采用D-半乳糖誘導(dǎo)糖基化模型小鼠，以糖基化過程的主要產(chǎn)物AGEs以及多種產(chǎn)物受體(RAGE、sRAGE、esRAGE)作為該模型的評價指標(biāo)，為用D-半乳糖建立糖基化模型進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1實驗動物

6周齡ICR雄性小鼠(SPF)20只，由北京花阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號：SCXK(京) 2014-0004。

1.1.2藥品與儀器

D-半乳糖(上海伯奧生物科技有限公司)；晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)酶聯(lián)免疫試劑盒、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)酶聯(lián)免疫試劑盒、可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(sRAGE)酶聯(lián)免疫試劑盒、內(nèi)源性分泌型晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(esRAGE)酶聯(lián)免疫試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司)；離心機(jī)(Eppendorf 公司)；酶標(biāo)儀(Molecular 公司)；T-18Basic內(nèi)切式勻漿機(jī)(IKA公司)。

1.2模型的建立

將健康ICR小鼠，隨機(jī)平均分成2組。模型組頸部皮下注射半乳糖200 mg·kg-1·d-1，對照組頸部皮下注射等量生理鹽水，連續(xù)給藥45 d后處死，建立D-半乳糖致糖基化模型。

1.3新物體識別試驗檢測方法

造模40 d后，進(jìn)行試驗。測試在白色塑料盒(60 cm×60 cm×40 cm)中進(jìn)行，3個物體分別為A、B、C，其中A、B為大小形狀完全相同的黑色長方形物體(5cm×5cm×6cm)，C為白色的正三角錐體(5cm×6cm)。測試第1天為適應(yīng)期，每只小鼠需在盒子內(nèi)自由活動，適應(yīng)5 min，盒中不放任何物體。測試第2天進(jìn)入熟悉期，物體A、B分別放置在盒子相對的兩側(cè)，距離盒壁10 cm，小鼠在兩物體中間輕輕放下，觀察并記錄5 min內(nèi)小鼠對每個物體的探索時間(以鼠嘴湊近物體約2cm范圍內(nèi)計時，鼠爬在玩具上玩或者只是在物體附近走則不能計入)，然后將動物放回鼠籠。測試第3天進(jìn)入識別期，識別期與熟悉期步驟一樣，將物體B換成物體C。鼠的物體識別能力以第3天新舊物體的探索時間而計算的分辨指數(shù)(discrimination index，DI)來評價。

分辨指數(shù)計算公式為：DI(%)=(N-F)/(N+F)×100%，式中N為小鼠在識別期探索新物體C所用的時間，F(xiàn)為探索舊物體A所用的時間。

1.4AGEs、RAGE、sRAGE和esRAGE的測定及方法

本實驗分別采用AGEs ELISA劑盒、RAGE ELISA試劑盒、RAGE ELISA試劑盒、sRAGE ELISA試劑盒檢測4種糖基化指標(biāo)(上海雅吉生物科技有限公司)，檢測范圍為30～800pg/mL，3.0～120pg/mL，1.0～50 pg/mL和1～40 pg/mL。結(jié)果分別以每毫克組織或每毫升血清中AGEs、RAGE、sRAGE、esRAGE含量來表示，即pg/mg。給藥結(jié)束后，小鼠眼眶取血，3000 r/min離心5 min，取血清低溫保存。斷頸處死，取心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉和皮膚，用生理鹽水將各組織制成組織勻漿并離心，取上清液待測。指標(biāo)檢測按相應(yīng)試劑盒說明書操作。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1新物體識別能力檢測

新物體識別實驗結(jié)果顯示空白對照組小鼠的分辨指數(shù)較模型組顯著增高(P< 0.01)，見圖1。該差異證明模型組老鼠的物體識別記憶能力較空白組低下顯著，從行為觀察來看，小鼠出現(xiàn)明顯的物體識別障礙。

2.2糖基化模型中小鼠各組織AGEs及其受體的水平變化

2.2.1D-半乳糖對小鼠各組織器官中AGEs的變化

D-半乳糖處理小鼠45 d后，模型組小鼠各組織器官中AGEs的水平均顯著高于空白組(P<0.01)，見表1。表明頸背部注射D-半乳糖可以顯著地提高小鼠體內(nèi)各組織器官中AGEs的水平，致使AGEs在小鼠體內(nèi)各部位快速積累，使其快速進(jìn)入高糖基化狀態(tài)。

圖1 實驗各組的分辨指數(shù)比較Fig 1 DI comparison of experimental groups表1 D-半乳糖對小鼠各組織器官中AGEs的影響Table 1 Effects of D-galactose on the AGEs in tissuepg/mg

與空白組比較，*：P< 0.05，**：P< 0.01；下同2.2.2D-半乳糖對小鼠各小鼠各組織中RAGE的變化

D-半乳糖處理小鼠45 d后，模型組小鼠各組織器官中的RAGE的水平均顯著高于空白組(P<0.01)，見表2。說明頸背部注射D-半乳糖也會導(dǎo)致小鼠體內(nèi)各部位RAGE水平的顯著升高，可能是由于AGEs水平的顯著升高，激活了RAGE的表達(dá)通路，使其大量表達(dá)，水平顯著升高，這也說明受體RAGE的水平與AGEs的水平呈正相關(guān)。

2.2.3D-半乳糖對小鼠各組織中sRAGE的變化

D-半乳糖處理小鼠45 d后，模型組小鼠各組織器官中sRAGE的水平均顯著高于空白組(P<0.01)，見表3。說明頸背部注射D-半乳糖也會導(dǎo)致小鼠體內(nèi)各部位sRAGE水平的顯著升高，sRAGE的水平與AGEs的水平呈正相關(guān)。sRAGE是RAGE的異構(gòu)體，隨著RAGE的增加，機(jī)體可能通過增加sRAGE的表達(dá)拮抗RAGE介導(dǎo)的病理過程。

2.2.4D-半乳糖對小鼠各組織中esRAGE的變化

D-半乳糖處理小鼠45 d后，模型組小鼠各組織器官中RAGE的水平均顯著高于空白組(P<0.01)，見表 4。表明頸背部注射D-半乳糖也會導(dǎo)致小鼠體內(nèi)各部位esRAGE水平的顯著升高，esRAGE的水平與AGEs的水平呈正相關(guān)。其原因可能是esRAGE是由RAGE的RNA選擇性剪切而成，隨著AGEs水平的升高，RAGE的表達(dá)量增加，致使esRAGE的表達(dá)量升高；也可能由于RAGE水平的升高，為了拮抗RAGE介導(dǎo)的病理生理過程，機(jī)體增加esRAGE的表達(dá)。

3　討論

正常情況下，高水平的AGEs需要機(jī)體長期的積蓄才能形成，但當(dāng)機(jī)體長期處于高血糖或者某些疾病狀態(tài)下時，也會導(dǎo)致機(jī)體AGEs的水平顯著升高[12]。D-半乳糖是一種立體結(jié)構(gòu)的特異性D型糖類，能夠增加多元醇通路中的首要限速酶(醛糖還原酶)的活性，加快糖醇-山梨醇類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為果糖，果糖經(jīng)過磷酸化、水解、重組、脫氫、交聯(lián)后，形成不可逆的AGEs[11]，所以采用頸背部皮下注射D-半乳糖處理小鼠可以快速升高機(jī)體內(nèi)的AGEs水平，迅速構(gòu)建糖基化模型。AGEs作為糖基化過程的終末產(chǎn)物，能直接反映出體內(nèi)糖基化水平[13]。

RAGE、sRAGE和esRAGE是AGEs的3種常見受體，并且互為異構(gòu)體。RAGE為多配體的細(xì)胞表面免疫球蛋白超家族受體成員之一，與AGEs結(jié)合后，激活NF-κB，導(dǎo)致多種細(xì)胞因子、炎癥因子、生長因子表達(dá)增加，對機(jī)體造成影響，與糖尿病[1]、心肌細(xì)胞損傷[14]、炎癥[15-16]等密切相關(guān)。esRAGE是由細(xì)胞膜上RAGE 直接分泌到細(xì)胞外的一種剪切異形體，因其缺少信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，故與AGEs結(jié)合后，無法激活信號途徑，從而阻斷AGEs-RAGE通路對組織損傷作用[17]。sRAGE是esRAGE與基質(zhì)金屬蛋白酶剪切細(xì)胞膜表面的RAGE后釋放到血液中的游離RAGE的總稱，同樣不具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，可以降低AGEs-RAGE通路對組織的損傷，并且與AGEs結(jié)合后，可以抑制AGEs的蛋白交聯(lián)功能，抑制動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展[18]，緩解心室肥厚硬化[19]，對心力衰竭患者心臟功能有一定的保護(hù)作用[20]。3種受體都可直接與AGEs結(jié)合，對機(jī)體各組織產(chǎn)生作用，且實驗證明小鼠體內(nèi)各組織中3種受體的水平與各組織內(nèi)的AGEs水平呈正相關(guān)，其水平高低也直接或間接地對機(jī)體有一定的影響，可以推測出3種受體的水平可能也反映出機(jī)體的糖基化水平。

本實驗采用頸背部皮下注射D-半乳糖的方法，使模型小鼠在45 d內(nèi)各組織器官中的AGEs及其受體水平顯著高于空白對照組(P<0.01)，使其處于高糖基化狀態(tài)，這符合自然衰老的行為學(xué)和糖基化產(chǎn)物水平的變化規(guī)律。本實驗在前人[11]研究的基礎(chǔ)上，以AGEs及其受體作為模型的新檢測指標(biāo)，為驗證模型建立的成功提供理論依據(jù)。新物體識別實驗證明，高糖基化狀態(tài)下的小鼠其認(rèn)知能力受到影響，這可能是由于糖基化在腦部的蓄積對小鼠腦部功能造成一定的損壞。實驗證明此動物模型可以作為研究AGEs及其受體的發(fā)病機(jī)理和藥物治療作用途徑的動物模型，并且可將小白鼠的腦、心、肝、脾、肺、腎、皮膚、血清以及肌肉等各組織器官作為靶點進(jìn)行研究。

[1]李平靜, 李 雷, 楊榮禮. 晚期糖基化終產(chǎn)物受體、可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物受體與2型糖尿病心血管并發(fā)癥的關(guān)系[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2015, 21(15): 2783-2786.

[2]蔡曉波, 范建高. 糖基化終末產(chǎn)物與肝病[J]. 國際消化病雜志, 2006, 26(1): 8-10.

[3]鄧義斌, 陳香美, 葉一舟, 等. 糖基化終末產(chǎn)物對腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)纖溶酶原激活物抑制物1的影響[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 1997, 77(9):672-675.

[4]劉軍鋒, 孔美娟, 賈克剛. 晚期糖基化終產(chǎn)物與冠心病發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 檢驗醫(yī)學(xué), 2014, 29(1):76-80.

[5]CIPOLLONE F, IEZZI A, FAZIA M, et al. Thereceptor RAGE as a progression factor amplifying arachidonate-dependent inflam-matory and proteolytic response in human atherosclerotic plaques: role ofglycemiccontrol[J]. Circulation, 2003, 108(9): 1070-1077.

[6]TAKEDA A, YASUDA T, MIYATA T, et al. Immunohistochemical study of advanced glycation end products in aging and Alzheimer′s disease brain[J]. Neuroscience Letters, 1996, 221(1):17-20.

[7]HORIE K, MIYATA T, YASUDA T, et al. Immunohistochemical localization of advanced glycation end products, pentosidine, and carboxymethyllysine in lipofuscin pigments of alzheimer′s disease and aged neurons[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 1997, 236(2):327-332.

[8]馮華國, 魯 靈, 吳傳新. 晚期糖基化終末產(chǎn)物受體及其配體的腫瘤生物學(xué)效應(yīng)[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2012, 32(21): 4831-4833.

[9]鄒玉婷, 沈建國. 晚期糖基化終末產(chǎn)物與骨質(zhì)疏松癥[J]. 國外醫(yī)學(xué)(老年醫(yī)學(xué)分冊), 2008, 29(1): 12-15.

[10]雷 超, 胡占升. 慢性阻塞性肺疾病患者血漿晚期糖基化終末產(chǎn)物和可溶性糖基化終末產(chǎn)物受體濃度變化及其臨床意義[J]. 中國全科醫(yī)學(xué), 2014, 17(8): 875-879.

[11]張世平, 譚海榮, 潘竟鏘, 等. D-半乳糖致蛋白質(zhì)糖基化動物模型的建立[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2006, 26(1):92-95.

[12]PEPPA M, URIBARRI J, VLASSARA H. The role of advanced glycation end products in the development of atherosclerosis[J]. Curr Diab Rep, 2004, 4(1):31-36.

[13]張世平, 方文娟, 呂俊華, 等. 葛根素抑制D-半乳糖致大鼠蛋白糖基化的實驗研究[J]. 中藥材, 2006, 29(3): 266-269.

[14]PETROVA R, YAMAMOTO Y, MURAKI K, et al. Advanced glycation endproduct-induced calcium handling impairment in mouse cardiac myocytes[J]. Journal of Molecular & Cellular Cardiology, 2002, 34(10):1425-1431.

[15]LILIENSIEK B, WEIGAND M A, BIERHAUS A, et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE) regulates sepsis but not the adaptive immune response[J]. Journal of Clinical Investigation, 2004, 113(11):1641-1650.

[16]BASTA G, SCHMIDT A M, DE CATERINA R. Advanced glycation end products and vascular inflammation: implications for accelerated atherosclerosis in diabetes[J]. Cardiovascular Research, 2004, 63(4):582-592.

[17]KOYAMA H, YAMAMOTO H, NISHIZAWA Y. Endogenous Secretory RAGE as a Novel Biomarker for Metabolic Syndrome and Cardiovascular Diseases[J]. Biomarker Insights, 2007, 2: 331 339.

[18]BUCCIARELLI L G, WENDT T, QU W, et al. RAGE blockade stabilizes established atherosclerosis in diabetic apolipoprotein E-null mice[J]. Circulation, 2002, 106(22):2827-2835.

[19]BAICU C, BRADSHAW A D, BOGGS J M, et al. Effects of inhibition of AGE-RAGE interaction in pressure-overload hypertrophy by treatment with sRAGE[J]. Journal of Cardiac Failure, 2008, 14(6):S15.

[20]孫利娜. 可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體與心力衰竭關(guān)系的臨床研究[D]. 濟(jì)南, 山東大學(xué), 2014.

Establishment and evaluation of glycation model induced by D-galactose in mice

JI Xiong-fei, WANG Li-dong, WANG Chun-lin, SONG Wei-wei, MU Chang-kao, LI Rong-hua

(Key Laboratory of the Ministry of Education for Applied Marine Biotechnology, Collaborative Innovation Center for Zhejiang Marine High-efficiency and Healthy Aquaculture, School of Marine Schences,Ningbo University, Ningbo315211, China)

To provide a theoretical basis of a new rat model of glycation, the mice of glycation were induced by injecting D-galactose (200 mg kg-1d-1) using injecting method for 45 days, which were measured the behavioral differences from model group to others and detected the index related to the glycation as AGEs, RAGE, sRAGE and esRAGE in variety organs of mice ( as brain, heart, liver, spleen, lung, kidney, skin, muscles and serum). The results showed that the DI of model group was decreased compared with that of the control group (P<0.01), though the number value of AGEs, RAGE, sRAGE and esRAGE of each tissues in mice were higher than that of control (P<0.01). This experiment investigated that it could make organism in a state of high glycosylation when they were injected by D-galactose (200 mg kg-1d-1) for 45 days. The model could be used in the study of the etiopathogenesis of AGEs which could discover the receptors and the pathway of pharmaceutical drug. And the index changing form in multiple tissues would give the researchers some suggestions in experimental targets using the model.

D-galactose； glycation model； AGEs； RAGE； sRAGE； esRAGE

2015-12-24；

2016-01-19

國家自然科學(xué)基金項目(41206114，41176124)；浙江省教育廳項目(Y201224605)；浙江省自然科學(xué)基金項目(LQ12C19002)；浙江省自然科學(xué)基金重點項目(Z3110482)；寧波大學(xué)“水產(chǎn)”浙江省重中之重開放基金

冀雄飛，碩士，研究方向為動物遺傳育種研究，E-mail:jixiongfei821@163.com

宋微微，講師，研究方向為水產(chǎn)動物遺傳育種，E-mail: songweiwei@nbu.edu.cn

R392.8

A

2095-1736(2016)05-0063-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.063