張貞發(fā),翁艷英,彭金云,黃孫娟,農(nóng)克良,2,*

(1.廣西民族師范學(xué)院化學(xué)與生物工程系,桂西南特色植物資源化學(xué)廣西高校重點實驗室培育基地,廣西崇左 532200;2.廣西教育學(xué)院,廣西南寧 530023)

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山藍(lán)紅色素的微波提取工藝及抑菌活性

張貞發(fā)1,翁艷英1,彭金云1,黃孫娟1,農(nóng)克良1,2,*

(1.廣西民族師范學(xué)院化學(xué)與生物工程系,桂西南特色植物資源化學(xué)廣西高校重點實驗室培育基地,廣西崇左 532200;2.廣西教育學(xué)院,廣西南寧 530023)

以植物山藍(lán)為原料,采用水溶劑微波輔助提取紅色素。通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化提取工藝,并經(jīng)過柱層析初步純化紅色素部分進(jìn)行抑菌實驗。結(jié)果表明:微波功率300 W,料液比1∶40(m/V),提取溫度60 ℃,提取時間9 min為山藍(lán)紅色素微波提取的最佳工藝條件,提取率為0.323%;提取得到的山藍(lán)紅色素對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌有抑制作用,最小抑菌濃度分別為500、400、700、500 mg·L-1。

紅色素,微波提取,抑菌活性

山藍(lán)又名紫藍(lán)、紅蘭、紅絲線、紅藍(lán)草,為爵床科山藍(lán)屬植物的全草,味微甘淡、氣香、性涼,具有化瘀、止血、止咳、化痰、解毒、消炎等功效[1-3],莖近似圓柱形,略有彎曲,易斷。山藍(lán)提取液為紅色,天然紅色素具有抗氧化、抗癌、抗衰老等保健作用[4],一些少數(shù)民族用山藍(lán)汁液著色食品。目前對山藍(lán)的研究主要集中在化學(xué)成分[1,5]、黃酮提取[6-7]、多糖提取[8]、紅絲線素提取[9]和色素提取[10-11]等方面。此外,還有一些其它植物紅色素提取及其抑菌活性的報道[12-15]可供參考。這些有關(guān)紅色素提取工藝研究的報道,均以紅色素溶液的吸光度為指標(biāo),由于沒有采用對照品,無法計算紅色素的提取率。本實驗采用羥基紅花黃色素A為紅色素的對照品,采用分光光度法檢測其含量,計算紅色素的提取率,得到最佳提取工藝和紅色素的提取率,并對提取的紅色素進(jìn)行初步純化,探討抑菌效果,對充分利用山藍(lán)這種可再生植物資源制作民族特色食品有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

山藍(lán)購自廣西崇左市江南市場,去離子水洗凈,60 ℃烘干,粉碎,過40目篩,冷藏備用;羥基紅花黃色素A(紅色素測定對照品)中國食品藥品檢定研究院(ID:DSQA-BZ4H);石油醚(bp 60～90 ℃)、乙酸乙酯、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸均為分析純,購自成都市科龍化工試劑廠;胰蛋白胨、瓊脂、柱層析硅膠購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌購自北京北納凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、去離子水1000 mL、pH7.0～7.2,高壓蒸汽滅菌備用;實驗用水為實驗室自制去離子水。

XH-200A型電腦微波固液相合成/萃取儀北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;UV-6100S型紫外可見分光光度計上海元析儀器有限公司;AR124CN型電子分析天平奧豪斯儀器有限公司;LDZM-60KCS型立式高壓蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械有限公司;DGX-9053B-1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海福瑪實驗設(shè)備有限公司;RHP-600A型不銹鋼中藥粉碎機(jī)浙江榮浩工貿(mào)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1色素的提取準(zhǔn)確稱取已粉碎過40目篩的山藍(lán)粉末1 g,置于100 mL圓底燒瓶中,按設(shè)計的料液比加入去離子水,置于電腦微波固液相合成/萃取儀中提取,過濾,定容。

1.2.2色素的檢測以去離子水為溶劑,配制濃度為4 mg·L-1羥基紅花黃色素A水溶液,用紫外可見分光光度計在200～800 nm范圍內(nèi)全波長掃描,最大吸收波長為405 nm。在405 nm波長下檢測吸光度,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以去離子水做參比,405 nm作為測定波長,測定在不同條件下提取出的山藍(lán)紅色素的吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求算濃度,根據(jù)下列公式計算紅色素的提取率。

紅色素的提取率(%)=所稱樣品中提取的紅色素的量/稱樣量×100

1.2.3單因素實驗設(shè)計以紅色素(以羥基紅花黃色素A為對照)的提取率為指標(biāo),固定稱樣量為1 g,微波功率150 W,料液比為1∶40(m/V),提取溫度為50 ℃,提取時間為6 min,依次改變微波功率(150、300、450、600、750 W),料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 m/V),提取溫度(40、50、60、70、80 ℃),提取時間(3、6、9、12、15 min),考察微波功率、料液比、溫度和時間對色素提取得率的影響。

1.2.4正交實驗設(shè)計根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取微波功率、料液比、溫度和時間的較優(yōu)水平,進(jìn)行L9(34)正交實驗,優(yōu)化山藍(lán)紅色素的提取工藝。正交實驗因素水平見表1。

表1　因素水平表

1.2.5分離純化將提取出的山藍(lán)色素在40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,得到浸膏。采用200～300目硅膠層析柱進(jìn)行純化分離[5],洗脫劑為乙酸乙酯和石油醚(體積比1∶1),主要得到淡綠色、紅黃色和不被洗脫的深褐色三部分,收集紅黃色部分溶液。

1.2.6抑菌實驗采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,徹底滅菌。將山藍(lán)提取物柱層析分離后的紅黃色部分的溶液收集,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,配制成含浸膏質(zhì)量濃度分別為100～1000 mg·L-1的溶液,滅菌備用,同時以無菌水做空白對照。

用打孔器將濾紙制成直徑為6 mm的圓形濾紙片,并在121 ℃、0.103 MPa蒸汽滅菌20 min,分別浸泡到浸膏溶液中6～8 h。將制好的培養(yǎng)基平板,均勻的涂抹上實驗用到的四種菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌)。含菌平板的濾紙片按圖1所示擺放。順時針為梯度從低到高,中間為空白對照。將有濾紙片的培養(yǎng)皿放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)菌的生長情況,使用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的大小,并記錄。

圖1　含菌培養(yǎng)皿中濾紙片的放置Fig.1　Paper with bacterium in the culture dish

1.2.7最小抑菌濃度的測定將柱層析初步純化后的紅黃色部分溶液配制成含浸膏濃度分別為100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 mg·L-1的溶液,測定對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度,以無菌水替代浸膏溶液作空白對照。放入37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h后,以培養(yǎng)皿中完全無菌生長的最低濃度作為相應(yīng)的樣品對相應(yīng)菌的最小抑菌濃度。

1.3數(shù)據(jù)處理

單因素實驗均取3次平行實驗的平均值進(jìn)行分析,用Excel作圖并進(jìn)行分析處理,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素實驗

2.1.1微波功率對紅色素提取結(jié)果的影響實驗結(jié)果如圖2所示,隨著微波功率從150 W增加到750 W,提取率呈現(xiàn)出先變大后減小的趨勢。當(dāng)微波功率從150 W增大時,加熱效率提高,加熱速度也加快,水溶性的紅色素就更容易從植物體內(nèi)溶出,當(dāng)功率達(dá)到450 W時,提取率達(dá)到0.287%,繼續(xù)增大功率,提取率并不上升,說明提取接近完成,或紅色素在微波功率太高的情況下發(fā)生了分解變質(zhì),也有可能是微波輻射的能量相對提取體系吸收等能量過剩,超過了提取體系所能吸收微波的最大量。

圖2　微波功率對紅色素提取結(jié)果的影響Fig.2　Effect of microwave power on the extraction results

2.1.2料液比對紅色素提取結(jié)果的影響料液比對紅色素的提取率隨著提取劑用量的增加而增加。料液比對紅色素提取效果的影響如圖3所示,當(dāng)料液比大于1∶30(m/V)時,吸光度值增加趨勢變緩甚至不變。說明紅色素基本被提取完全,繼續(xù)增加提取劑用量對提取效果影響不大,并且會增大旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)是溶劑的回收量,增加了能耗。

圖3　料液比對紅色素提取結(jié)果的影響Fig.3　Effect of material liquid ratio on the on the extraction results

2.1.3提取溫度對紅色素提取結(jié)果的影響提取溫度對紅色素提取結(jié)果的影響如圖4所示,隨著提取溫度的升高,提取率逐漸增大,當(dāng)溫度超過60 ℃時,提取率反而開始下降。溫度從30 ℃升高至60 ℃時,熱運動劇烈,溶解出的紅色素越多,提取率升高,但是當(dāng)溫度繼續(xù)升高會對紅色素產(chǎn)生破壞,因此提取率降低。

圖4　提取溫度對紅色素提取結(jié)果的影響Fig.4　Effect of temperature on the extraction results

2.1.4提取時間對紅色素提取結(jié)果的影響提取時間對提取效果的影響如圖5所示,隨著提取時間增大,紅色素的提取率先是大幅度升高,然后逐漸呈現(xiàn)不同幅度的下降。推測原因可能是時間過短時,紅色素還沒能充分溶解出,當(dāng)提取一定時間后,紅色素的擴(kuò)散速度逐漸變慢直至兩相間的濃度平衡,提取基本完成,如果繼續(xù)延長提取時間可能會使紅色素在提取溫度下遭到破壞或其他成分部分溶出產(chǎn)生影響等,導(dǎo)致提取率降低。

圖5　提取時間對紅色素提取結(jié)果的影響Fig.5　Effect of time on the extraction results

2.2正交實驗

在提取山藍(lán)紅色素中,四種因素對提取結(jié)果的影響程度依次為D>B>C>A,即提取時間>提取溫度>料液比>微波功率。提取山藍(lán)紅色素的最佳工藝條件為A1B2C3D3,即微波功率為300 W,料液比為1∶40(m/V),提取溫度為60 ℃,提取時間為9 min。

表2　正交實驗結(jié)果

以最佳提取條件為實驗條件實驗3次,得到的提取率分別為0.323%、0.324%、0.323%,平均值為0.323%,標(biāo)準(zhǔn)差為0.05%。結(jié)果表明微波輔助提取山藍(lán)紅色素的實驗重現(xiàn)性較好,而且3次實驗結(jié)果的平均值高于正交實驗中其他9次實驗的提取率,因此確定出的最優(yōu)條件是可靠的。

2.3抑菌效果

從山藍(lán)提取液中柱層析分離出的紅色素,在測試條件下對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出抑菌效果見表3。說明山藍(lán)提取液柱層析分離得到的紅色素含有抑制該四種供試菌種的物質(zhì),與其他植物紅色素[14-15]的抑菌活性相比,有的差異比較大,有的相差不多。由于初步純化后得到的依然是混合物,也可能是該混合物中還有一些能夠抑制實驗所用四種菌種的物質(zhì)。

表3　抑菌效果

3　結(jié)論

采用微波萃取儀對山藍(lán)植物進(jìn)行了水溶液提取,通過柱層析分離收集紅顏色部分進(jìn)行抑菌實驗。微波提取時間、料液比、提取溫度和微波功率對提取效果有影響,影響程度依次為提取時間>提取溫度>料液比>微波功率,微波功率300 W,料液比1∶40(m/V),提取溫度60 ℃,提取時間9 min為最佳提取條件,山藍(lán)紅色素提取率達(dá)到0.323%,并具有比較好的穩(wěn)定性。抑菌實驗表明,山藍(lán)紅色素對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出抑菌效果。

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Microwave-assisted extraction and antibacterial activity of red pigment from Shanlan

ZHANG Zhen-fa1,WENG Yan-ying1,PENG Jin-yun1,HUANG Sun-juan1,NONG Ke-liang1,2,*

(1.Department of Chemical and Biological Engineering,Guangxi Normal University for Nationalities,Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory Breeding Base of Chemistry of Guangxi Southwest Plant Resources,Chongzuo 532200,China;2.Guangxi College of Education,Nanning 530023,China)

Red pigment was extracted from Shanlan when water as solvent with microwave-assisted extraction. Optimization of extraction conditions was carried out through single factor and orthogonal experiments. The red pigment was separated and purified by column chromatography for bacteriostatic experiment. The optimum conditions were obtained as microwave power 300 W,ratio of solid to liquid 1∶40,temperature 60 ℃ and the extracting time 9 min,and the extraction rate was 0.323%. The red pigment had inhibitory effect onEscherichiacoli,Bacillussubtilis,CandidaalbicansandStaphylococcusaureus,and the minimum inhibitory concentration was respectively 500,400,700,500 mg·L-1.

red pigment;microwave extraction;antibacterial activity

2016-02-19

張貞發(fā)(1982-)，男，碩士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物提取及分析，E-mail：865289575@qq.com。

農(nóng)克良(1964-)，男，碩士，教授，研究方向：藥物化學(xué)，E-mail：2453802800@qq.com。

廣西優(yōu)勢特色重點學(xué)科項目(ZDXK-A2012002)；廣西民族師范學(xué)院科研項目(XYYB2011018)。

TS201.2

B

1002-0306(2016)16-0312-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.053