程鈺蓉,孫志杰,崔　球

(1.山東省能源生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所,山東青島 266100;2.青島單細(xì)胞油脂工程實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266100;3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100040;4.生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所,山東青島 266100)

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丙酮酸脫氫酶競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑調(diào)控裂殖壺菌脂肪酸合成的研究

程鈺蓉1,2,3,孫志杰1,*,崔球1,2,4,*

(1.山東省能源生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所,山東青島 266100;2.青島單細(xì)胞油脂工程實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266100;3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100040;4.生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所,山東青島 266100)

本研究以合成乙酰輔酶A的丙酮酸脫氫酶復(fù)合體為擾動(dòng)目標(biāo),通過(guò)應(yīng)用底物特異競(jìng)爭(zhēng)抑制劑——氟化丙酮酸(FP)來(lái)擾動(dòng)乙酰輔酶A的合成,在考察擾動(dòng)后裂殖壺菌的碳消耗、菌體生長(zhǎng)、油脂合成、脂肪酸成分的基礎(chǔ)上,分析了工業(yè)生產(chǎn)二十二碳六烯酸(DHA)菌株——裂殖壺菌中的乙酰輔酶A在普通脂肪酸合成途徑(FAS途徑)和類聚酮合酶途徑(PKS途徑)的分配比例變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)裂殖壺菌可轉(zhuǎn)化利用FP;1 mmol/L FP在抑制總油脂合成的同時(shí)也顯著改變了乙酰輔酶在FAS和PKS途徑中的分配比率;降低了生物質(zhì)合成,增強(qiáng)了二氧化碳生成量。表明裂殖壺菌的FAS途徑對(duì)乙酰輔酶A的親和力可能高于PKS途徑;通過(guò)降低乙酰輔酶A供給量并不能提高總脂肪酸中多不飽和脂肪酸(DHA和DPA)的含量。這一結(jié)果解釋了FAS途徑和PKS途徑的碳流分配調(diào)控機(jī)制,對(duì)于選育DHA高產(chǎn)菌株以及工業(yè)發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化具有重要意義。

氟化丙酮酸,二十二碳六烯酸,丙酮酸脫氫酶復(fù)合體,乙酰輔酶A,裂殖壺菌

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA,C22∶6 n-3)又稱“腦黃金”,在人體中具有重要的生理和保健功能[1-3]。裂殖壺菌(Aurantiochytrium)由于其具有DHA含量高、生長(zhǎng)快、易于大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì),是目前工業(yè)生產(chǎn)DHA使用的主要菌株。但由于缺乏精確的分子靶向調(diào)控工具和深入的脂肪酸代謝調(diào)控機(jī)制的了解[4],目前提高裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA產(chǎn)量主要依賴于培養(yǎng)基組分優(yōu)化以及控制發(fā)酵條件[1,5-6]。了解裂殖壺菌脂肪酸合成和油脂積累調(diào)控機(jī)制有利于優(yōu)化DHA工業(yè)發(fā)酵工藝和菌株的代謝工程改造。

線粒體中的丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(pyruvate dehydrogenase complex,PDC)將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A,而后三羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系再將線粒體內(nèi)的乙酰輔酶A轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)中進(jìn)行脂肪酸的合成。已有大量研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)PDC活性可以改變細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量[7-8]。目前研究表明,裂殖壺菌具有非常復(fù)雜而特殊的脂肪酸合成途徑,其飽和脂肪酸(包括棕櫚酸和油酸)是由生物界普遍利用的脂肪酸合成途徑(FAS途徑)合成,而多不飽和脂肪酸(DHA和DPA)卻是由特殊的類聚酮合酶途徑(PKS途徑)合成[9-10]。雖然,目前已知乙酰輔酶A是這兩個(gè)途徑的共同碳源前體分子,但研究人員對(duì)于乙酰輔酶A在這兩種途徑中的分配調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清晰[11]。

因此,本研究以乙酰輔酶A在FAS和PKS途徑中的分配調(diào)控機(jī)制為研究目標(biāo),通過(guò)應(yīng)用PDC的底物特意競(jìng)爭(zhēng)抑制劑——FP(fluoropyruvate,FP)來(lái)調(diào)節(jié)乙酰輔酶A供給量,在考察擾動(dòng)后裂殖壺菌的碳消耗、菌體生長(zhǎng)、油脂合成、脂肪酸成分的基礎(chǔ)上,分析乙酰輔酶A在FAS和PKS途徑中分配比例的變化。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株裂殖壺菌菌株(Aurantiochytriumsp. SD116,CG-MCC No. 6208)由青島生物能源與過(guò)程研究所代謝物組學(xué)實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏[12];FPFP美國(guó)Sigma公司,純度≥98%;尿素氮檢測(cè)試劑盒南京建成生物工程研究所;酵母粉英國(guó)Oxoid公司;葡萄糖、丙磺酸、海水晶、硫酸銨、磷酸二氫鉀、七水合硫酸鋅、四水合氯化錳、七水合硫酸亞鐵、六水合氯化鈷、五水合硫酸銅、二水合鉬酸鈉國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海分公司,分析純。

RIGOL-L3000液相色譜北京普源精電科技有限公司;Agilent GC-6890氣相色譜安捷倫科技公司;SBA-40葡萄糖分析儀山東省科學(xué)院生物研究所;MiniSpin小型高速離心機(jī)Eppendorf公司；vario EL Ⅲ元素分析儀Elementar公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基:葡萄糖60 g/L,酵母粉20 g/L,海水晶15 g/L,pH6.4。

分析培養(yǎng)基:葡萄糖60 g/L,丙磺酸60 g/L,硫酸銨7 g/L,磷酸二氫鉀4 g/L,海水15 g/L,七水合硫酸鋅22 mg/L,四水合氯化錳5 mg/L,七水合硫酸亞鐵5 mg/L,六水合氯化鈷1.6 mg/L,五水合硫酸銅1.6 mg/L,二水合鉬酸鈉7.5 mg/L。

1.2.2培養(yǎng)方法

1.2.2.1種子活化從菌種保存平板上挑取單菌落,接入裝有50 mL新鮮種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,培養(yǎng)溫度25 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min,培養(yǎng)時(shí)間48 h。

1.2.2.2FP濃度篩選配制分別含有0、0.1、0.5、1、2、5 mmol/L FP的分析培養(yǎng)基。按照接種OD600為0.02的接種量將種子接入裝有50 mL新鮮分析培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,培養(yǎng)溫度25 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min,培養(yǎng)時(shí)間96 h。從36 h開(kāi)始每12 h對(duì)葡萄糖消耗進(jìn)行測(cè)定,培養(yǎng)60 h時(shí)對(duì)生物量以及油脂含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2.3FP代謝擾動(dòng)分析按照接種密度為0.02 OD600的接種量將種子接入裝有50 mL新鮮分析培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,培養(yǎng)溫度25 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min。培養(yǎng)至40 h時(shí),分別向擾動(dòng)組發(fā)酵液中添加FP母液至1 mmol/L和對(duì)照組加入等體積的水后繼續(xù)在25 ℃、200 r/min培養(yǎng)至84 h。在培養(yǎng)40、48、60、72、84 h分別取樣,測(cè)定發(fā)酵參數(shù)。

1.2.3發(fā)酵參數(shù)測(cè)定

1.2.3.1葡萄糖含量測(cè)定采用生物傳感器分析儀測(cè)定上清液中葡萄糖含量。

1.2.3.2銨根離子含量測(cè)定采用尿素氮檢測(cè)試劑盒分析上清液中氨離子含量。

1.2.3.3FP含量測(cè)定采用高效液相色譜法分析發(fā)酵液中胞外代謝物和FP濃度變化。色譜柱:Bio-RadAminex HPX-87H Colum,300 mm×7.8 mm;柱溫:50 ℃;流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相:5 mmol/L H2SO4。等度洗脫25 min。紫外檢測(cè)器:320 nm。通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定FP在320 nm的紫外吸收,通過(guò)外標(biāo)法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到發(fā)酵液中FP的含量,并計(jì)算FP的消耗速率。FP標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2=0.9913)：不同濃度FP標(biāo)準(zhǔn)品(mmol/L)=色譜峰面積×(7×10-6)+0.0076。FP消耗速率計(jì)算:FP消耗速率(mmol/g·h)=樣品中FP濃度÷生物量÷加入FP的時(shí)間。

1.2.3.4生物量的測(cè)定取2 mL菌體,經(jīng)蒸餾水洗滌、4000×g離心和真空冷凍干燥后,稱得菌體干重。

1.2.3.5菌體油脂含量和脂肪酸組成的測(cè)定按文獻(xiàn)報(bào)道方法提取菌體油脂并稱重[12]。硫酸-甲醇法處理油脂后,GC-MS分析脂肪酸成分。色譜分離條件:色譜柱(Agilent HP-INNOWax 30 m×250 μm×0.25 μm)。程序升溫條件:初始溫度為100 ℃,升溫過(guò)程為15 ℃/min直至240 ℃并保持10 min,進(jìn)樣口溫度為250 ℃,FID檢測(cè)器溫度為260 ℃。含油率(%)=提取的油脂重量/細(xì)胞干重×100;特定油脂百分含量(%)=該油脂氣相色譜峰面積/總油脂氣相色譜峰面積×100。

1.2.3.6菌體元素分析取2 mg干燥后的菌體,經(jīng)元素分析儀測(cè)定菌體中C、H、N、S元素的組成。

2　結(jié)果與分析

2.1FP濃度的確定

FP是丙酮酸的結(jié)構(gòu)類似物,由于它與丙酮酸脫氫酶亞基的親和力是丙酮酸的100倍,因此在非常低的濃度下FP就可以有效抑制PDC的催化活性[13]。本研究首先考察了不同濃度FP對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)行為和代謝特征的影響研究。

圖1　不同F(xiàn)P濃度下裂殖壺菌生長(zhǎng)和代謝行為變化Fig.1　The growth and metabolism changesin Aurantiochytrium sp. under different concentration of FP注:(A)葡萄糖消耗;(B)培養(yǎng)60 h后生物量積累;(C)培養(yǎng)60 h后油脂含量。

由圖1A中的對(duì)照組可知,60 h處于細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,這一時(shí)期的細(xì)胞代謝處于平衡狀態(tài),可以更真實(shí)的反應(yīng)胞內(nèi)正常代謝水平,且60 h的細(xì)胞較多，帶來(lái)的分析誤差更小,因此本研究比較了對(duì)照組和FP處理組在該時(shí)期細(xì)胞生物量和油脂含量的差異。由圖1A和B可知,FP濃度為0.1 mmol/L和0.5 mmol/L時(shí),葡萄糖消耗速率和生物量積累并沒(méi)有受到明顯影響;當(dāng)濃度增加到1 mmol/L時(shí),葡萄糖消耗速率為對(duì)照組的94.28%,生物量為對(duì)照組的75.85%;濃度為2 mmol/L時(shí),生物量為對(duì)照組的48.75%,達(dá)到了半抑制生長(zhǎng)濃度;當(dāng)FP濃度為5 mmol/L時(shí),葡萄糖殘?zhí)橇可?生物量?jī)H為對(duì)照組的32.57%,生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重抑制。根據(jù)未添加FP的實(shí)驗(yàn)組結(jié)果,這種培養(yǎng)條件下裂殖壺菌在40～70 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,這一階段細(xì)胞處于快速分裂狀態(tài),從發(fā)酵水平上來(lái)說(shuō)可以認(rèn)為這是細(xì)胞生長(zhǎng)的代謝穩(wěn)態(tài)。由圖1C可知,加入FP后雖然會(huì)抑制生物量的增長(zhǎng),油脂含量也隨之下降,但是油脂占細(xì)胞干重的比例基本維持在28%左右。當(dāng)FP濃度達(dá)到2 mmol/L和5 mmol/L時(shí),由于生物量和油脂含量都較低導(dǎo)致測(cè)量誤差較大,這會(huì)嚴(yán)重干擾代謝擾動(dòng)分析結(jié)果。因此本研究最終選取了1 mmol/L作為后續(xù)擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)中的FP濃度,因?yàn)樵谶@一濃度下既可以顯示FP的抑制作用,也保證了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2FP代謝擾動(dòng)分析

2.2.1FP的利用由FP作為丙酮酸脫氫酶復(fù)合體競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的作用機(jī)制可知,丙酮酸脫氫酶每消耗1摩爾FP就會(huì)減少1摩爾丙酮酸的利用,因而就會(huì)相應(yīng)的減少1摩爾的乙酰輔酶A的合成。因此圖2的數(shù)據(jù)也反映了裂殖壺菌胞內(nèi)乙酰輔酶A合成量降低的現(xiàn)象。由圖2可知,加入FP后的前8 h(發(fā)酵48 h),FP的平均消耗速率為0.831 μmol/L·g·h,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),FP的消耗速率降低,加入44 h后(發(fā)酵84 h)FP的消耗速率為0.21 μmol/L·g·h。在培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)細(xì)胞代謝進(jìn)行擾動(dòng)時(shí),胞內(nèi)代謝途徑會(huì)受到極大干擾,但是需要經(jīng)過(guò)一定的代謝積累達(dá)到擾動(dòng)穩(wěn)態(tài)后,在擾動(dòng)因子(此處是FP抑制劑)依然存在的情況下對(duì)細(xì)胞代謝水平做出評(píng)價(jià)會(huì)更加準(zhǔn)確。

圖2　FP在胞內(nèi)的代謝速率Fig.2　FP degradation rate in Aurantiochytrium cells

圖3　擬穩(wěn)態(tài)下1 mmol/L FP對(duì)生長(zhǎng)的影響Fig.3　Effects of 1 mmol/L FPto cell growth during homoeostasis state注:FP:FP擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)組。

2.3油脂積累和脂肪酸成分變化

由圖4對(duì)照組結(jié)果可見(jiàn),發(fā)酵初期(前40 h)在碳源和氮源充足的情況下細(xì)胞增殖占據(jù)了主導(dǎo)地位,油脂積累基本穩(wěn)定在35%左右,發(fā)酵72～84 h后,細(xì)胞逐漸進(jìn)入碳源、氮源缺乏的狀態(tài),細(xì)胞進(jìn)入油脂積累期,油脂含量可達(dá)45%以上。實(shí)驗(yàn)組在加入FP之前,即前40 h和對(duì)照組的結(jié)果基本一致,油脂含量基本在35%左右,但是加入FP后,油脂含量出現(xiàn)明顯下降,84 h樣品細(xì)胞油脂含量為22%,僅為同時(shí)期對(duì)照組細(xì)胞油脂含量的40%。

圖4　裂殖壺菌含油率的變化Fig.4　Different ratio of total oil to dry cell weight

裂殖壺菌油脂的脂肪酸組成較為簡(jiǎn)單,主要是由 FAS途徑合成的飽和脂肪酸——十六酸和十八酸以及PKS途徑合成的多不飽和脂肪酸——DHA和DPA組成。由圖5和圖6可知,加入FP后的8 h,脂肪酸分布并沒(méi)有顯著變化,這可能是因?yàn)榘麅?nèi)代謝途徑到代謝終產(chǎn)物受到影響的過(guò)程中有一個(gè)適應(yīng)過(guò)程,當(dāng)代謝擾動(dòng)始終存在且對(duì)胞內(nèi)代謝有較大影響的情況下,代謝終產(chǎn)物還是會(huì)體現(xiàn)出差異的。而后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)照組細(xì)胞油脂中FAS途徑生成的脂肪酸比率由40 h的58%下降到84 h的50%,PKS途徑合成的多不飽和脂肪酸比率則由40 h的42%上升為50%。FP處理組則呈現(xiàn)截然不同的變化趨勢(shì),加入FP后,FAS途徑合成的脂肪酸比率卻呈上升趨勢(shì),其比率從40 h的58%升至84 h的60%,而PKS途徑的占比從40 h的44%下降至84 h的40%。

圖5　裂殖壺菌胞內(nèi)油脂中飽和脂肪酸比率的變化Fig.5　Different percentage of saturated fatty acids注:FAS百分含量指油脂中飽和脂肪酸占總脂肪酸的比率。

圖6　裂殖壺菌胞內(nèi)油脂中不飽和脂肪酸比率的變化Fig.6　Different percentage of unsaturated fatty acid注:PKS百分含量指油脂中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的比率。

利用圖4數(shù)據(jù)計(jì)算可知,加入FP后裂殖壺菌的含油率明顯下降,合成油脂的FAS和PKS途徑均受到抑制。在油脂合成受到抑制的前提下,不同油脂合成途徑受抑制的程度有顯著差別,FAS途徑的抑制率為54%,而PKS途徑的抑制率高達(dá)68%。因此可以說(shuō)FP擾動(dòng)降低乙酰輔酶A合成量對(duì)PKS的影響大于FAS。

胞內(nèi)乙酰輔酶A的去向包括三羧酸循環(huán)、氨基酸合成和脂肪酸合成,由于已有裂殖壺菌的低溫?cái)_動(dòng)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明乙酰輔酶A在FAS途徑和PKS途徑的分配比例與脂肪酸組成密切相關(guān)[14]。因此,首先由測(cè)定的脂肪酸組成和脂肪酸含量可以計(jì)算出用于合成脂肪酸的乙酰輔酶A總量,再根據(jù)脂肪酸的組成計(jì)算出分別由FAS途徑和PKS途徑消耗的乙酰輔酶A量,具體結(jié)果如表1所示。綜合了前述生物量積累、葡萄糖消耗、元素平衡分析、油脂組成等諸多參數(shù),設(shè)定對(duì)照組和FP處理組用于合成脂肪酸的乙酰輔酶A的總量分別為100%,進(jìn)而計(jì)算出乙酰輔酶A在FAS和PKS途徑中的分配比例變化,最終乙酰輔酶A在兩個(gè)脂肪酸合成途徑中的通量分布如圖7所示。由計(jì)算結(jié)果可知添加FP后用于合成脂肪酸的乙酰輔酶A量由對(duì)照組的8.62 mmol降低為4.38 mmol,正常培養(yǎng)時(shí)乙酰輔酶A在FAS和PKS途徑中的分配比例為幾乎1∶1,但添加FP后其分配比例變?yōu)?∶2,即通過(guò)1 mmol/L FP處理來(lái)降低乙酰輔酶A的供給量會(huì)擴(kuò)大乙酰輔酶A在FAS途徑的分配比例。

表1　FP對(duì)裂殖壺菌油脂積累及乙酰輔酶A代謝的影響

圖7　裂殖壺菌胞內(nèi)乙酰輔酶A分支位點(diǎn)的分配比率Fig.7　Flux ratio of AcCoA metabolic branch point in cytoplasm注:乙酰輔酶A用于合成脂肪酸的量設(shè)定為100%。

由表1和圖7的結(jié)果可知,加入FP后,PDC合成乙酰輔酶A的量降低,也就導(dǎo)致脂肪酸合成的碳源前體供給量減少,從而一方面降低了總油脂的合成,另一方面也顯著影響了乙酰輔酶A在FAS和PKS之間的分配。FAS途徑和PKS途徑可以類似的看作兩種酶體系,對(duì)底物乙酰輔酶A具有不同的Km值,即對(duì)底物乙酰輔酶A具有不同的親和力。兩種酶體系競(jìng)爭(zhēng)性與同一種底物結(jié)合,Km值較小的酶體系容易與底物結(jié)合。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,在降低乙酰輔酶A 供給的情況下FAS占有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),因此推測(cè)FAS途徑與乙酰輔酶A的親和性高于PKS。因此為了保證PKS途徑更多地合成DHA、DPA等不飽和脂肪酸,保證充足的乙酰輔酶A供給是十分有必要的。已有研究表明,通過(guò)在裂殖壺菌發(fā)酵過(guò)程中添加適當(dāng)濃度的乙酸可以提高乙酰輔酶A的供給,并提高不飽和脂肪酸的合成[15],與本結(jié)果互為補(bǔ)充證明。

2.4碳分配變化

經(jīng)計(jì)算對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組碳原子分配結(jié)果:葡萄糖中有52.42%的碳原子流向生物質(zhì)合成途徑;FP處理后這一比率降低為45.12%,而二氧化碳得率則相應(yīng)地從對(duì)照組的47.59%上升至54.88%。以上結(jié)果表明抑制PDC降低了底物碳利用效率。

FP降低了丙酮酸脫氫酶復(fù)合體將丙酮酸轉(zhuǎn)化成為乙酰輔酶A的效率,造成了胞內(nèi)的丙酮酸積累以及乙酰輔酶A和NADH的減少。由于NADH是細(xì)胞代謝的能量來(lái)源之一[16],細(xì)胞可能將線粒體中的乙酰輔酶A優(yōu)先供給三羧酸循環(huán)的中心代謝途徑,造成了CO2的生成速率升高。

在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中為了提高DHA的產(chǎn)量,通常利用代謝調(diào)控的方法將底物葡萄糖更高效地轉(zhuǎn)化成為DHA,因此提高細(xì)胞內(nèi)的碳轉(zhuǎn)化效率是十分必要的。在裂殖壺菌中油脂合成機(jī)制的研究過(guò)程中,提高和降低碳轉(zhuǎn)化率都有利于對(duì)合成機(jī)理的進(jìn)一步解析。在后期研究中,可以通過(guò)13C標(biāo)記代謝通量分析實(shí)驗(yàn)對(duì)中心代謝途徑的分配比率進(jìn)行模擬計(jì)算,以利于深入研究乙酰輔酶A供給對(duì)PKS途徑的影響[17]。在生產(chǎn)應(yīng)用中,應(yīng)該保證充足的乙酰輔酶A的供給,提高丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的活性,利于細(xì)胞積累更多的DPA、DHA,進(jìn)一步接近理論產(chǎn)率。

3　結(jié)論

通過(guò)降低乙酰輔酶A供給可知丙酮酸脫氫酶復(fù)合體抑制劑FP可抑制裂殖壺菌的生長(zhǎng)和油脂合成,同時(shí)FP會(huì)隨之代謝消耗。同時(shí),在裂殖壺菌生長(zhǎng)擬穩(wěn)態(tài)下(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期),1 mmol/L FP可顯著改變乙酰輔酶A在合成飽和脂肪酸的FAS途徑和合成不飽和脂肪酸的PKS途徑分配比率,從而導(dǎo)致總油脂中飽和脂肪酸含量上升而不飽和脂肪酸含量下降。經(jīng)過(guò)物料平衡分析可知在降低了生物質(zhì)合成途徑碳通量比率的同時(shí),應(yīng)用FP來(lái)抑制PDC活性也顯著增加了二氧化碳生成途徑的碳通量比率。裂殖壺菌生物質(zhì)降低的同時(shí)二氧化碳生成量增加。

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Research of a specific competitive inhibitor of pyruvate dehydrogenase complex onAurantiochytriumsynthesizing fatty acids

CHENG Yu-rong1,2,3,SUN Zhi-jie1,*,CUI Qiu1,2,4,*

(1.Shandong Provincial Key Laboratory of Energy Genetics,Qingdao Institute of Bioenergy and BioprocessTechnology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266100,China;2.Qingdao Engineering Laboratory of Single Cell Oil,Qingdao 266100,China;3.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100040,China;4.Key Laboratory of Biofuels,Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266100,China)

Aurantiochytriumsynthesizes polyunsaturated fatty acid(docosahexenoic acid(DHA)and docosapentaenoic acid(DPA))through polyketide synthase(PKS)pathway,and saturated fatty acid(mainly palmic acid and oleic acid)through fatty acid synthase(FAS)pathway. Both pathways competitively used acetyl-CoA as carbon precursor. Understanding the mechanism to regulate the carbon partition between FAS pathway and PKS pathway was helpful for designation of high-DHA-yield strains and optimization of industrial fermentation process. In this research,the pyruvate dehydrogenase complex,which catalyzing the synthesis of acetyl-CoA,was treated by fluoropyruvate(FP)-a specific substrate-competitive inhibitor. Based on determination of carbon consumption,biomass,total oil accumulation and the distribution ratio of acetyl-CoA between FAS and PKS pathways were investigated. The results showed that FP could be assimilated and metabolized byAurantiochytriumand FP could inhibit lipid synthesis and significantly change the partition ratioof acetyl-CoA between FAS and PKS pathways. Production of carbon-dioxide was enhanced by FP,but the accumulation of biomass was inhibited. These results hinted that the affinity of FAS pathway to acetyl-CoA was higher than that of PKS pathway and the content of polyunsaturated fatty acid(DHA and DPA)in total oil could not be increased by reducing supply of acetyl-CoA.

fluoropyruvate;docosahexenoic acid;pyruvate dehydrogenase complex;acyl-CoA;Aurantiochytrium

2016-03-08

程鈺蓉(1991-),女,碩士研究生,研究方向:代謝通量分析,E-mail:chengyr@qibebt.ac.cn。

孫志杰(1978-),男,副研究員,研究方向:代謝通量分析,E-mail:sunzj@qibebt.ac.cn。

崔球(1975-),男,研究員,研究方向:微生物代謝工程及蛋白質(zhì)工程,E-mail:cuiqiu@qibebt.ac.cn。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2014AA021701);國(guó)家自然科學(xué)基金(41306132;3150078)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0161-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.024