李 信，楊曉菲，馬 兵，陳志剛，王長有，陳春環(huán)，田增榮，吉萬全

(1.西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院/旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室,陜西楊凌 712100;2.陜西省種子管理站,陜西西安 710021；3.陜西省興平市種子管理站，陜西興平 713100)

?

抗條銹病小麥-濱麥衍生后代的分子細胞遺傳學鑒定

李 信1，楊曉菲1，馬 兵2，陳志剛3，王長有1，陳春環(huán)1，田增榮1，吉萬全1

(1.西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院/旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室,陜西楊凌 712100;2.陜西省種子管理站,陜西西安 710021；3.陜西省興平市種子管理站，陜西興平 713100)

為了有效挖掘濱麥優(yōu)異的基因資源，利用形態(tài)學、細胞學、熒光原位雜交 (FISH)、基因組原位雜交(GISH) 和分子標記等技術，對小麥-濱麥衍生后代M13063-3-3進行了鑒定。結果表明，M13063-3-3的染色體構型為2n=44=22Ⅱ。以濱麥基因組DNA為探針的原位雜交結果顯示，二條染色體有雜交信號，且能配對，表明兩條外源染色體是濱麥的一對同源染色體。SSR、EST和PLUG標記分析表明，M13063-3-3附加的濱麥染色體歸屬于第6部分同源群染色體。A-PAGE電泳分析表明，M13063-3-3在α區(qū)具有濱麥染色體特征帶，進一步驗證了附加的濱麥染色體與小麥第6部分同源群染色體有部分同源關系。田間條銹病調(diào)查結果表明，M13063-3-3對條銹菌生理小種條中31號、條中32號和條中33號混合菌種表現(xiàn)高抗。因此，M13063-3-3是一個附加了一對濱麥第6部分同源群染色體的抗條銹病的普通小麥材料，為小麥抗病育種提供了新的種質(zhì)資源。

普通小麥；濱麥；衍生后代；條銹病；原位雜交；分子標記

Molecular Cytogenetics Identification of a Wheat-LeymusmollisDerivative with Resistance to Stripe Rust

條銹病是由小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的一種世界性小麥氣傳病害，具有爆發(fā)強、流行快、發(fā)生范圍廣和危害性大等特點，對我國小麥生產(chǎn)有著嚴重影響[1]。通過抗病品種來防治條銹病是最經(jīng)濟、有效和環(huán)境可接受的措施[2]。然而由于病原菌毒性小種的變異和抗病品種抗源的單一化，導致許多品種很快就喪失了抗病性，因此，篩選和利用新的和有效的抗條銹病基因，是實現(xiàn)有效防治條銹病的當務之急和長遠任務。

濱麥(Leymusmollis，2n=28)是禾本科(Poaceae)小麥族(Triticeae)大麥亞族(Hordinae)賴草屬(LeymusHochst.)的一個異花授粉異源四倍體多年生植物，對小麥條銹病、白粉病、葉銹病等多種真菌病害具有良好抗性，同時還具有耐鹽堿、莖稈粗壯、大穗多花等許多其他優(yōu)良性狀，是進行小麥品種改良的三級基因源。早在20世紀50年代，蘇聯(lián)科學家開始進行小麥和賴草屬包括濱麥的雜交，經(jīng)胚拯救技術獲得了四倍體、六倍體小麥與濱麥的雜種。20世紀60年代獲得了雜種的雙二倍體。20世紀70年代獲得了硬粒小麥與濱麥的不完全雙二倍體。20世紀90年代，傅 杰等[3-5]通過秋水仙堿處理和回交的方法首次獲得了八倍體小濱麥(Octoploidtritileymus)，進而利用八倍體小濱麥和缺體小麥雜交和回交，創(chuàng)造了大穗、多花、優(yōu)質(zhì)、抗多種病害的小麥-濱麥異代換系；利用八倍體小濱麥和普通小麥雜交和回交，創(chuàng)造了大穗、大粒、優(yōu)質(zhì)、抗病的小麥-濱麥異附加系。周兗晨等[6]從普通小麥和濱麥的雜交后代篩選到一個抗條銹病的小麥-濱麥異易位系93784，熒光原位雜交結果表明，易位的濱麥染色體片段位于一對小麥染色體的短臂端部。王獻平等[7]通過GISH技術在小麥-濱麥異代換系與離果山羊草異附加系的雜交后代中獲得3株小麥-濱麥異易位系，進而利用C-分帶技術證明其中一個異易位系是整臂易位。趙繼新等[8]將八倍體小濱麥M842-12與硬粒小麥Trs372雜交，利用細胞學、GISH、SSR和PAGE的方法鑒定出一個普通小麥-濱麥的多重異代換系。王金平等[9]利用抗性接種鑒定、細胞學和SSR分子標記技術相結合的方法對兼抗白粉病和條銹病的小濱麥種質(zhì)系山農(nóng)6343進行鑒定。陸文輝等[10]利用細胞學、RAPD分析和熒光原位雜交技術鑒定出一個抗條銹小濱麥易位系山農(nóng)0096。Yang等[11]通過細胞學、GISH、FISH-GISH、EST和PLUG分子標記技術鑒定出一個抗條銹病的普通小麥-濱麥的二體異代換系M11003-3-1-15-8。

M13063-3-3是由普通小麥7182和濱麥雜交，用普通小麥山農(nóng)20回交了一次，然后連續(xù)自交所得的體細胞染色體數(shù)目為44的小麥-濱麥衍生后代。本研究應用細胞學、原位雜交(FISH和GISH)、分子標記和生化標記等技術，結合形態(tài)學和條銹病抗性調(diào)查，對小麥-濱麥衍生后代M13063-3-3進行鑒定，以期了解其遺傳行為和染色體構成，明確其所攜帶的濱麥的染色體及其抗病特性，并對其外源染色體的同源群歸屬進行確定，為小麥抗病育種和染色體工程育種提供新的種質(zhì)資源。

1　材料與方法

1.1材 料

供試材料包括八倍體小濱麥、濱麥、普通小麥-濱麥衍生后代M13063-3-3及普通小麥品種7182、山農(nóng)20、中國春和輝縣紅，均由西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院染色體工程實驗室提供。條銹病抗性鑒定所用條銹菌生理小種條中31號、條中32號和條中33號混合小種由西北農(nóng)林科技大學植物保護學院提供。

1.2方 法

1.2.1形態(tài)學調(diào)查和條銹病抗性鑒定

在成熟期調(diào)查材料的株高、穗長、小穗粒數(shù)、每穗小穗數(shù)、穗型和芒型等性狀，記載標準參照文獻[12]。成株期條銹病抗性鑒定在西北農(nóng)林科技大學試驗田進行。10月初播種鑒定材料和感病對照輝縣紅，翌年3月中旬采用撒粉接種法接種條中31號、條中32號和條中33號混合小種，在輝縣紅充分發(fā)病時調(diào)查鑒定材料的反應型，5 d后復查一次。反應型記載標準參照文獻[13]。

1.2.2DNA提取

采用CTAB法[14]提取供試材料的基因組DNA。

1.2.3細胞學觀察

(1)根尖細胞染色體數(shù)目鑒定

將M13063-3-3種子放入培養(yǎng)皿內(nèi)，室溫下浸泡至露白，4 ℃低溫處理24 h，然后將露白種子用鑷子轉移到墊有2層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，放入23 ℃培養(yǎng)箱發(fā)芽，當根長為1.2～2.0 cm時切下根尖放入冰水中處理24 h，然后用卡諾氏Ⅰ固定液(乙醇∶冰乙酸=3∶1)固定，于-20 ℃冰箱保存。一周后，根尖轉入70%酒精中，45%醋酸洋紅染色后制片，鏡檢。

(2)花粉母細胞減數(shù)分裂中期I(PMC MI)染色體構型觀察

田間選取適齡幼穗，用卡諾氏Ⅱ固定液(乙醇∶氯仿∶冰乙酸=6∶3∶1)固定24 h，轉入70%酒精中，45%醋酸洋紅染色后制片，鏡檢。

1.2.4原位雜交

(1)材料處理

將M13063-3-3的根尖和幼穗固定2～5 d后分別用體積分數(shù)45%的醋酸壓片，液氮冷凍揭片，氣干備用。

(2)探針標記

采用切口平移法用Dig-Nick-Translation Mix(Roche Germany)標記濱麥基因組DNA。

(3)原位雜交

參照Tang等[15]的方法，利用寡核苷酸探針Oligo-pTa535、Oligo-pSc119.2和濱麥基因組DNA探針先后對根尖體細胞進行FISH和GISH分析。參照Cuadrado等[16]的方法，對花粉母細胞進行分析。OLYMPUS BX53熒光顯微鏡觀察檢測，用CCD成像系統(tǒng)照相，并用軟件Adobe Photoshop CS6進行圖像處理。

1.2.5SSR標記和EST-STS標記分析

根據(jù)R?der等[17]和Pestsova等[18]公布的小麥SSR標記，選取定位于小麥7個部分同源群上的70對SSR引物進行擴增。根據(jù)網(wǎng)站http://wheat.pw.usda.gov/SNP/new /pcr_primers.shtml公布的STS引物信息，選取定位于小麥7個部分同源群上的70對引物進行擴增。所選引物均由北京奧科鼎盛生物技術有限公司合成。PCR反應在擴增儀ABI-9700上進行。反應體系(10 μL)：1.0 μL 10 × PCR Buffer(Mg2+)，1.0 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，每個引物(5 μmol·L-1)1.0 μL，0.1 μL 5 U·μL-1Taq酶，50～100 ng基因組DNA，加ddH2O補至10 μL。反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，50/55/60 ℃(根據(jù)引物選擇)退火45 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，具體參照吳金華等[19]的方法，經(jīng)硝酸銀染色后觀察并照相。

1.2.6PLUG標記分析

根據(jù)Ishikawa等[20]發(fā)表的引物序列，選取分布于小麥7個部分同源群上的56對PLUG(PCR-based landmark unique gene)引物(由北京奧科鼎盛生物技術有限公司合成)進行擴增。PCR反應在擴增儀ABI-9700上進行。反應體系(10 μL)：1.0 μL 10 × PCR Buffer(Mg2+)，1.0 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，每個引物(5 μmol·L-1)1.0 μL，0.1 μL 5 U·μL-1Taq酶，50～100 ng基因組DNA，加ddH2O補至10 μL。反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，60 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用TaqⅠ酶進行酶切后，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，110 V穩(wěn)壓電泳30 min，溴化乙錠(EB)染色觀察并拍照。

1.2.7A-PAGE分析

取單粒種子，研碎后按1 mg樣品加5 μL樣品提取液的比例加入樣品提取液，室溫浸提過夜，15 000 r·min-1離心10 min，取上清液，5 μL點樣電泳。凝膠溶液質(zhì)量濃度(T)為100 g·L-1，1倍體積的冰乙酸-甘氨酸電極緩沖液在500 V條件下恒壓電泳，電泳時間為甲基綠前沿指示劑遷移至板底所需時間的3倍。最后用質(zhì)量分數(shù)1%考馬斯亮藍和10%三氯乙酸染色過夜，經(jīng)7%乙酸脫色后觀察并照相。

2　結果與分析

2.1形態(tài)學分析

普通小麥7182、濱麥及二者的衍生后代M13063-3-3的農(nóng)藝性狀調(diào)查結果(表1)表明，M13063-3-3的株高、穗長、小穗粒數(shù)、每穗小穗數(shù)、芒型與親本7182無顯著性差異，株高、穗長與親本濱麥具有顯著性差異，每穗小穗數(shù)、穗型與親本濱麥無顯著性差異。整體來看，M13063-3-3農(nóng)藝性狀穩(wěn)定，是較好的遺傳材料。

2.2條銹病抗性分析

成株期條銹病抗性鑒定結果(圖1)表明，感病對照品種輝縣紅對條銹菌生理小種條中31號、條中32號和條中33號混合小種的反應型為4級，表現(xiàn)高感條銹?。挥H本普通小麥7182的反應型為3級，表現(xiàn)中感條銹??；濱麥的反應型為0級，表現(xiàn)為對條銹病免疫；M13063-3-3的反應型為1級，表現(xiàn)高抗條銹病。說明M13063-3-3具有條銹病抗性基因，攜帶的抗性基因來自濱麥。

2.3細胞學分析

對M13063-3-3進行根尖有絲分裂及花粉母細胞減數(shù)分裂中期I染色體制片觀察，發(fā)現(xiàn)M13063-3-3根尖細胞染色體數(shù)目為2n=44(圖2a)；在觀察的59個細胞中，56個花粉母細胞減數(shù)分裂中期I染色體具有22II構型，其中環(huán)狀二價體平均為19.01個，棒狀二價體平均為1.86個，沒有三價體和四價體的出現(xiàn)(圖2b和表2)，表明M13063-3-3在細胞遺傳學上基本穩(wěn)定，可能是普通小麥附加一對濱麥染色體。

表1　M13063-3-3及其親本的農(nóng)藝性狀Table 1　Agronomic characters of M13063-3-3 and its parents

-代表沒有數(shù)據(jù)；同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示不同材料間差異在0.05水平上顯著

- represents no data; Values followed by different letters are significantly different at 0.05 level

1：輝縣紅；2：7182；3：濱麥；4：M13063-3-3　　1:Huixianhong; 2:7182; 3:Leymus mollis; 4:M13063-3-3圖1　M13063-3-3及其親本的條銹病抗性Fig.1　Stripe rust reactions of M13063-3-3 and its parents

圖2　M13063-3-3根尖細胞(a)和花粉母細胞(b)觀察Fig.2　Cytogenetic observation of root-tip cell (a) and pollen mother cell (b) of M13063-3-3

2.4原位雜交分析

以Oligo-pTa535、Oligo-pSc119.2、濱麥基因組DNA為探針，對M13063-3-3根尖體細胞進行原位雜交鑒定，結果顯示，根尖體細胞中有42條完整的小麥染色體 (圖3a) 和2條帶有明顯藍綠色雜交信號的染色體 (圖3b)，表明該材料含有42條普通小麥染色體和2條濱麥染色體?；ǚ勰讣毎麥p數(shù)分裂中期I基因組原位雜交結果顯示，有1個二價體顯示黃色雜交信號，表明這2條外源染色體能夠完全配對 (圖3c)，說明M13063-3-3中的2條外源染色體是濱麥的一對染色體。

表2　M13063-3-3花粉母細胞減數(shù)分裂中期 I (PMC MI)不同染色體結構數(shù)目Table 2　Number of different chromosome configurations at metaphase I in pollen mother cells of M13063-3-3

括號中的數(shù)值為變化范圍

The values in the brackets are the ranges

a：以Oligo-pTa535(紅色)、Oligo-pSc119.2(綠色)為探針在根尖細胞進行熒光原位雜交；b：以濱麥基因組DNA(藍綠色)為探針在根尖細胞進行熒光原位雜交；c：以濱麥基因組DNA(黃色)為探針在花粉母細胞進行基因組原位雜交

a:FISH analysis using Oligo-pTa535 (red) and Oligo-pSc119.2 (green) as probes on root tip cell chromosome; b:FISH analysis usingLeymusmollisgenomic DNA (blue-green) as probes on root tip cell chromosome; c:GISH analysis usingLeymusmollisgenomic DNA (yellow) as probes on pollen mother cell chromosome

圖3M13063-3-3熒光原位雜交和基因組原位雜交

Fig.3 Fluorescenceinsituhybridization and genomicinsituhybridization of M13063-3-3

2.5SSR、EST-STS和PLUG標記分析

用分布在小麥7個部分同源群上的70對SSR引物、70對EST-STS引物和56對PLUG引物對M13063-3-3及其親本進行分子標記分析表明，3對定位于小麥第6部分同源群上的SSR標記Xwmc417、Xwmc487和Xwmc748在M13063-3-3及濱麥基因組DNA均擴增出特異條帶，分別約150 bp(圖4a)、175 bp(圖4b)和80 bp(圖4c)，而在普通小麥7182中無此條帶。3對定位于小麥第6部分同源群上的EST-STS標記CD452568、BQ167013和BF483643在M13063-3-3及濱麥基因組DNA均擴增出特異條帶，分別約248 bp和260 bp(圖4d)、400 bp(圖4e)和875 bp(圖4f)，而在普通小麥7182中無此條帶。2對定位于小麥第6部分同源群上的PLUG引物TNAC1677和TNAC1679在M13063-3-3及濱麥基因組DNA均擴增出特異條帶，分別約850 bp(圖4g)和900 bp(圖4h)，而在普通小麥7182中無此條帶。這些結果表明，M13063-3-3附加的一對濱麥染色體歸屬于第6部分同源群染色體。

2.6A-PAGE分析

醇溶蛋白A-PAGE電泳圖譜分析結果表明，M13063-3-3除具有親本7182的帶型之外，在α區(qū)還具有來自濱麥的特異帶型，而在該位置親本7182沒有譜帶(圖5)。由于編碼α區(qū)蛋白的基因定位在第6部分同源染色體臂上，因此A-PAGE電泳分析進一步證明附加的一對濱麥染色體屬于第6部分同源群。

M：DNA marker DL2000；1：7182；2：濱麥；3：M13063-3-3；箭頭所指為濱麥特異條帶

M:DNA marker DL2000; 1:7182; 2:Leymusmollis; 3:M13063-3-3; Arrows indicate the specific band ofLeymusmollis

圖4SSR、EST-STS和PLUG引物擴增圖譜

Fig.4Amplification profile of SSR,EST-STS and PLUG markers

1：中國春；2:7182；3：八倍體小濱麥；4：M13063-3-3；箭頭為濱麥特異條帶

1:Chinese Spring; 2:7182; 3:Octoploidtritileymus; 4:M13063-3-3; Arrow indicates the specific band ofLeymusmollis

圖5A-PAGE電泳結果

Fig.5A-PAGE analysis

3　討 論

小麥近緣種屬遺傳物質(zhì)導入到普通小麥后，常用的檢測手段包括形態(tài)學觀察、細胞學鑒定、原位雜交、生化和分子標記技術等。與其他幾種檢測方法相比，分子標記具有簡便快捷、多態(tài)性高、重復性好等優(yōu)點，已被廣泛應用于現(xiàn)代作物遺傳育種研究的各個方面。吳金華等[21]通過SSR標記分析小麥-黑麥二體異附加系N9436-0-2-29-9附加的黑麥染色體來自第6部分同源群。韓顏超[22]等通過EST-STS標記分析發(fā)現(xiàn)小麥-華山新麥草二體異附加系H1-1-3-1-9-8附加的華山新麥草染色體來自第1部分同源群。Hu等[23]通過PLUG引物分析發(fā)現(xiàn)小麥-中間偃麥草異代換系AS1677中代換的中間偃麥草染色體來自第1部分同源群。詹海仙等[24]通過PLUG引物成功鑒定出小麥品系CH5383中的滲入的中間偃麥草DNA片段來自第3部分同源群。本研究利用分布于小麥7個部分同源群的SSR、EST-STS和PLUG引物明確了抗條銹病小麥-濱麥衍生后代M13063-3-3的遺傳組成，并將其附加的一對濱麥染色體歸屬于第6部分同源群。

濱麥是小麥重要的條銹病抗性基因來源。本研究發(fā)現(xiàn)M13063-3-3在成株期對條銹菌條中31號、條中32號和條中33號混合菌種表現(xiàn)高抗，而親本普通小麥7182表現(xiàn)中感條銹病，表明附加的濱麥染色體攜帶抗條銹病基因。由于附加的濱麥染色體與小麥第6部分同源群染色體具有部分同源關系，因此在濱麥的第6部分同源群染色體上攜帶抗條銹病基因。Yang等[25]利用細胞學、GISH、SSR和EST分子標記技術在普通小麥7182與濱麥雜交后代中鑒定了3個普通小麥-濱麥的衍生系M42、M47和M51，并發(fā)現(xiàn)M42和M47對條銹病均具有抗性。王金平等[26]通過微衛(wèi)星標記分析將小濱麥易位系山農(nóng)0096的抗條銹基因定位在4A染色體上。宋曉賀等[27]將小麥-濱麥易位系M8657-1的抗條銹病基因進行了遺傳分析和SSR分子標記，并將其抗條銹基因定位在7DL染色體上。本實驗小麥-濱麥衍生后代M13063-3-3攜帶的抗病基因所位于部分同源染色體與前面報道的均不同，可能是新的抗條銹病基因，有待進一步研究明確。

[1]蒲宗君,陳國躍,陳 華,等.小麥品系ICA56抗條銹病鑒定及其抗性基因SSR標記 [J].植物病理學報,2009,39(1):61-66.

Pu Z J,Chen G Y,Chen H,etal.Identification and SSR mapping of a stripe rust resistance gene in wheat line ICA56 [J].ActaPhytopathologicaSinica,2009,39(1):61-66.

[2]萬安民,牛永春,吳立人,等.1991-1996年我國小麥條銹菌生理?；芯?[J].植物病理學報,1999,29(1):15-21.

Wan A M,Niu Y C,Wu L R,etal.Physiologic specialization of stripe rust of wheat in China during 1991-1996 [J].ActaPhytopathologicaSinica,1999,29(1):15-21.

[3]傅 杰,陳漱陽,張安靜.八倍體小濱麥的形成及細胞遺傳學研究 [J].遺傳學報,1993,20(4):317-323.

Fu J,Chen S Y,Zhang A J.Studies of the formation and cytogenetics of octoploidTritileymus[J].ActaGeneticaSinica,1993,20(4):317-323.

[4]傅 杰,陳漱陽,張安靜,等.八倍體小濱麥與普通小麥雜交后代的細胞遺傳學研究 [J].遺傳學報,1996,23(1):24-31.

Fu J,Chen S Y,Zhang A J,etal.Cytogenetic studies on the cross progenies between octoploidTritileymusandTriticumaestivum[J].ActaGeneticaSinica,1996,23(1):24-31.

[5]傅 杰,徐 霞,楊群慧,等.八倍體小濱麥與缺體小麥雜交的細胞遺傳學研究 [J].遺傳學報,1997,24(4):350-357.

Fu J,Xu X,Yang Q H,etal.Cytogenetic studies on the cross progenies between octoploidTritileymusand nullisomic wheat [J].ActaGeneticaSinica,1997,24(4):350-357.

[6]周兗晨,張相岐,王獻平,等.濱麥抗條銹病基因的染色體定位和分子標記 [J].遺傳學報,2001,28(9):864-869.

Zhou Y C,Zhang X Q,Wang X P,etal.Chromosomal location and molecular marker of resistance gene toPucciniastriiformiswest.inLeymusmollisTrin.Hara [J].ActaGeneticaSinica,2001,28(9):864-869.

[7]王獻平,初敬華,張相岐.小麥異源易位系的高效誘導和分子細胞遺傳學鑒定 [J].遺傳學報,2003,30(7):619-624.

Wang X P,Chu J H,Zhang X Q.Efficient production of wheat alien translocation lines and characterization by molecular cytogenetics [J].ActaGeneticaSinica,2003,30(7):619-624.

[8]Zhao J X,Du W L,Wu J,etal.Development and identification of a wheat-Leymusmollismultiple alien substitution line [J].Euphytica,2013,190(1):45-52.

[9]王金平,王洪剛.兼抗白粉和條銹病小濱麥種質(zhì)系山農(nóng)6343的細胞學和SSR鑒定 [J].植物遺傳資源學報,2009,10(1):46-50.

Wang J P,Wang H G.Cytological and SSR analysis ofTritileymusgermplasm line Shannong 6343 with resistance to both powdery mildew and yellow rust [J].JournalofPlantGeneticResources,2009,10(1):46-50.

[10]陸文輝,林小虎,李興峰,等.抗條銹小濱麥易位系的鑒定 [J].作物學報,2005,31(1):88-91.

Lu W H,Lin X H,Li X F,etal.Identification ofTritileymustranslocation line with stripe rust resistance [J].ActaAgronomicaSinica,2005,31(1):88-91.

[11]Yang X F,Wang C Y,Li X,etal.Development and molecular cytogenetic identification of a novel wheat-LeymusmollisLm#7Ns(7D) disomic substitution line with stripe rust resistance [J].PLoSOne,2015,10(10):e0140227.

[12]李立會,李秀全,楊欣明.小麥種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準 [M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2006:17-22.

Li L H,Li X Q,Yang X M.Descriptors and Data Standard for Wheat (TriticumaestivumL.) [M].Beijing:China Agriculture Press,2006:17-22.

[13]董玉琛,鄭殿升.小麥遺傳資源 [M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2000:223-224.

Dong Y C,Zheng D S.Wheat Genetic Resources [M].Beijing:China Agriculture Press,2000:223-224.

[14]Cota-sánchez J H,Remarchuk K,Ubayasena K.Ready-to-use DNA extracted with a CTAB method adapted for herbarium specimens and mucilaginous plant tissue [J].PlantMolecularBiologyReporter,2006,24(2):161-167.

[15]Tang Z X,Yang Z J,Fu S L.Oligonucleotides replacing the roles of repetitive sequences pAs1,pSc119.2,pTa-535,pTa71,CCS1,and pAWRC.1 for FISH analysis [J].JournalofAppliedGenetics,2014,55(3):313-318.

[16]Cuadrado A,Schwarzacher T,Jouve N.Identification of different chromatin classes in wheat usinginsituhybridization with simple sequence repeat oligonucleotides [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2000,101(5-6):711-717.

[17]R?der M S,Korzun V,Wendehake K,etal.A microsatellite map of wheat [J].Genetics,1998,149(4):2007-2023.

[18]Pestsova E,Ganal M W,R?der M S.Isolation and mapping of microsatellite markers specific for the D genome of bread wheat [J].Genome,2000,43(4):689-697.

[19]吳金華,吉萬全,王長有,等.普通小麥-黑麥抗白粉病異附加系的鑒定 [J].中國農(nóng)學通報,2005,21(10):279-281.

Wu J H,Ji W Q,Wang C Y,etal.Identification of wheat-rye addition lines resistant to powdery mildew [J].ChineseAgriculturalScienceBulletin,2005,21(10):279-281.

[20]Ishikawa G,Nakamura T,Ashida T,etal.Localization of anchor loci representing five hundred annotated rice genes to wheat chromosomes using PLUG markers [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2009,118(3):499-514.

[21]吳金華,王長有,王秋英,等.小麥-黑麥二體異附加系分子細胞遺傳學鑒定 [J].西北植物學報,2008,28(1):59-64.

Wu J H,Wang C Y,Wang Q Y,etal.Molecular cytogenetics identification of wheat-rye alien disomic additional line [J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica,2008,28(1):59-64.

[22]韓顏超,王長有,陳春環(huán),等.普通小麥-華山新麥草1Ns二體異附加系的分子細胞遺傳學研究 [J].麥類作物學報,2015,35(8):1044-1049.

Han Y C,Wang C Y,Chen C H,etal.Molecular cytogenetic study on wheat-Psathyrostachyshuashanica1Ns disomic addition line [J].JournalofTriticeaeCrops,2015,35(8):1044-1049.

[23]Hu L J,Li G R,Zeng Z X,etal.Molecular cytogenetic identification of a new wheat-Thinopyrumsubstitution line with stripe rust resistance [J].Euphytica,2011,177(2):169-177.

[24]詹海仙,暢志堅,李光蓉,等.小麥-中間偃麥草抗條銹病滲入系的分子細胞學鑒定 [J].農(nóng)業(yè)生物技術學報,2014,22(7):841-845.

Zhan H X,Chang Z J,Li G R,etal.Cytogenetic and molecular identification of a wheat (Triticumaestivum)-Thinopyrumintermediumintrogression line with resistance to stripe rust [J].JournalofAgriculturalBiotechnology,2014,22(7):841-845.

[25]Yang X F,Wang C Y,Chen C H,etal.Chromosome constitution and origin analysis in three derivatives ofTriticumaestivum-Leymusmollisby molecular cytogenetic identification [J].Genome,2014,57(11-12):583-591.

[26]王金平,王洪剛,趙 瑾,等.小濱麥易位系山農(nóng)0096抗條銹基因的微衛(wèi)星標記和染色體定位 [J].分子植物育種,2008,6(3):475-479.

Wang J P,Wang H G,Zhao J,etal.Microsatellite marker and chromosomal location of the yellow rust resistance gene inTritileymustranslocation line shannong 0096 [J].MolecularPlantBreeding,2008,6(3):475-479.

[27]宋曉賀,侯 璐,楊敏娜,等.小麥-濱麥易位系M8657-1抗條銹病基因遺傳分析和分子標記 [J].植物病理學報,2008,38(6):652-655.

Song X H,Hou L,Yang M N,etal.Genetic analysis and molecular mapping of stripe rust resistance gene in wheat translocation line M8657-1 derived fromLeymusmollisTrin.Hara [J].ActaPhytopathologicaSinica,2008,38(6):652-655.

LI Xin1,YANG Xiaofei1,MA Bing2,CHEN Zhigang3,WANG Changyou1,

CHEN Chunhuan1,TIAN Zengrong1,JI Wanquan1

(1.College of Agronomy,Northwest A&F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,Yangling,Shaanxi 712100,China; 2.Seeds Management Station of Shaanxi Province,Xi’an,Shaanxi 710021,China;3.Xingping Seeds Management Station of Shaanxi Province,Xingping,Shaanxi 713100,China)

Exploiting and utilizing excellent gene(s) from wild species has become an essential strategy for wheat improvement.The derivative line M13063-3-3,which was developed from the progeny of common wheat (TriticumaestivumL.) cv.7182 andLeymusmollis,was characterized based on cytological observation,fluorescenceinsituhybridization (FISH),genomicinsituhybridization (GISH),simple sequence repeat (SSR),expressed sequence tag (EST),PCR-based landmark unique gene (PLUG) markers and morphological analysis.M13063-3-3 contained 22 bivalents during meiosis,while GISH results detected two alien chromosomes.Three SSR markers,three EST markers and two PLUG markers,which were located on the homoeologous group 6 chromosomes of wheat,amplified polymorphic bands in the derivative line M13063-3-3,which were unique toL.mollis.A-PAGE indicated that α region of M13063-3-3 had the specific band ofL.mollis.The results further showed that the additive chromosomes belong to the homoeologous group 6 chromosomes ofL.mollis.After inoculation using the mixed races of stripe rust (CYR31,CYR32 and CYR33) at the adult stage,M13063-3-3 exhibited high resistance to stripe rust,which was possibly derived fromL.mollis.The high levels of disease resistance make M13063-3-3 a promising germplasm for wheat breeding.

Triticumaestivum;Leymusmollis; Derivative; Strip rust; FISH; GISH; Molecular markers

時間：2016-05-10

2016-01-04

2016-02-14

國家科技支撐計劃項目(2013BAD01B02-6)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2015KTZDNY01-01-02)；西北農(nóng)林科技大學唐仲英育種基金項目

E-mail:lixin4327@126.com(李 信); yangxiaofei2007@yeah.net(楊曉菲,與第一作者同等貢獻)

吉萬全(E-mail:jiwanquan2008@126.com)

S512.1；S332

A

1009-1041(2016)05-0556-08

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160510.1623.006.html