馬銀良，劉爽，崔亞琦，康現(xiàn)江，劉秀華

(河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定　071002 )

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大腸桿菌O157中肽聚糖水解酶MpaA的克隆、表達(dá)、純化及晶體學(xué)研究

馬銀良，劉爽，崔亞琦，康現(xiàn)江，劉秀華

(河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071002 )

采用分子克隆方法將來源于大腸桿菌O157的mpaA基因構(gòu)建入pET-21b(+)表達(dá)載體.誘導(dǎo)MpaA蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中高效表達(dá)，通過Ni親和層析、離子交換層析和凝膠過濾層析三步法純化得到高純度蛋白.使用氣象擴(kuò)散法進(jìn)行蛋白質(zhì)晶體生長的初步篩選與優(yōu)化，得到MpaA蛋白質(zhì)單晶，并使用X射線衍射儀進(jìn)行衍射數(shù)據(jù)的收集與處理.MpaA晶體分辨率為0.26 nm，屬于P31空間群，晶胞參數(shù)為a=5.989 3 nm，b=5.989 3 nm，c=12.987 0 nm，β=90.000 °.MpaA晶體衍射數(shù)據(jù)的收集為后續(xù)結(jié)構(gòu)解析和催化機(jī)制的闡明提供了基礎(chǔ).

大腸桿菌O157；肽聚糖水解酶；MpaA；晶體

肽聚糖是微生物細(xì)胞壁不可缺少的組成成分，在維持細(xì)胞形態(tài)、保持細(xì)胞完整性和抗高滲透壓等方面具有重要作用[1-3].肽聚糖骨架是由N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid，MurNAc)和N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)以β-1,4糖苷鍵交替連接而形成的線狀聚糖鏈.在MurNAc上以共價鍵形式連接一短肽側(cè)鏈L-Ala-γ-D-Glu-meso-DAP(或L-Lys)-D-Ala.一般而言，在革蘭氏陽性細(xì)菌中，短肽分子上的第3個氨基酸是Lys，而在革蘭氏陰性細(xì)菌中，短肽上的第3個氨基酸殘基往往是meso-DAP(2,6-diaminopimelic acid,2,6-二氨基庚二酸)[2].

細(xì)菌肽聚糖處于不斷組裝與解聚的動態(tài)過程，在細(xì)胞生長、分裂和發(fā)育過程中進(jìn)行重建[4].對于大多數(shù)革蘭氏陰性菌而言，在每一代細(xì)胞中40%～50%的肽聚糖在水解之后，其產(chǎn)物都能夠被循環(huán)再利用重新形成肽聚糖[5-6].在營養(yǎng)元素匱乏時，肽聚糖的循環(huán)再生則可為整個細(xì)胞分裂周期的完成提供必須的基礎(chǔ)營養(yǎng)元素，并使之進(jìn)入靜止生長期.此外，在微生物之間存在碳氮源競爭時，肽聚糖的循環(huán)再利用對于微生物生存具有重要意義[5].

在大腸桿菌的肽聚糖循環(huán)再生過程中共涉及11種肽聚糖水解酶.這些酶能夠回收肽聚糖降解產(chǎn)物，用于肽聚糖的重新合成，或被細(xì)胞用作能源[5].肽聚糖水解酶MpaA含有262個氨基酸，負(fù)責(zé)切割中間降解產(chǎn)物胞壁質(zhì)三肽(L-Ala-γ-D-Glu-meso-DAP)中γ-D-Glu與meso-DAP之間的酰胺鍵，釋放L-Ala-D-Glu和DAP[3，7].二肽產(chǎn)物L(fēng)-Ala-D-Glu在差向異構(gòu)酶YcjG和肽酶PepD作用下轉(zhuǎn)化成L-Ala和L-Glu[8-9].在營養(yǎng)元素匱乏時，這些氨基酸產(chǎn)物能夠被細(xì)胞作為能源使用，從而能夠存活下來[5,10].MpaA專一性底物是胞壁質(zhì)三肽(L-Ala-γ-D-Glu-meso-DAP)，非特異性底物是L-Ala-γ-D-Glu-L-Lys-MurNAC三肽和γ-D-Glu-(L)- meso-DAP二肽；MpaA并不能夠識別胞壁質(zhì)四肽、二糖-肽或UDP-MurNAc-肽等前體分子[10].到目前為止，MpaA的底物特異性已被廣泛研究，但差異性產(chǎn)生的原因是未知的，分子水平的催化反應(yīng)機(jī)制也是未知的.鑒于此，本研究成功克隆、表達(dá)、純化了大腸桿菌O157中的MpaA，對其進(jìn)行了初步晶體學(xué)研究，從而為其三維結(jié)構(gòu)的解析、催化機(jī)理的闡明奠定了基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1材料

pET-21b(+)質(zhì)粒，大腸桿菌O157：H7str.Sakai基因組，大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)為本實驗室保存.質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購于TIANGEN公司；pfu DNA聚合酶和T4 DNA連接酶購于寶生物(大連)有限公司；限制性內(nèi)切酶購于NEB公司和寶生物(大連)有限公司；PCR引物 (表1)、重組質(zhì)粒測序由北京寶銳通公司完成；蛋白胨和酵母提取物購自O(shè)XOID公司.蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) AKTA explorer 100、親和層析基質(zhì)Ni-NTA His-Band resin、離子交換柱Source 15Q及分子篩預(yù)裝柱 Superdex-200 increase 均購于GE Healthcare公司.

表1　引物設(shè)計

1.2mpaA基因的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建

目標(biāo)基因(Gene ID:912455)使用PCR方法擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測及膠回收，使用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切，與經(jīng)同樣酶切后的pET-21b(+)表達(dá)載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞.挑取多個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行重組蛋白表達(dá)檢測，將蛋白有陽性表達(dá)的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR檢測，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)表達(dá)及質(zhì)粒PCR檢測均為陽性時可確定為陽性克隆子，并送測序.

1.3MpaA蛋白質(zhì)的大量表達(dá)與純化

挑取陽性克隆接種于50 mL含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)；按照1%的接種比例將菌液接入1 000 mL含有相應(yīng)抗生素的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)；當(dāng)菌體密度達(dá)到 OD600為0.8時，降溫至15 ℃，1 h后，加入IPTG至終濃度為0.15 mmol/L，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)；誘導(dǎo)10 h之后，4 ℃、4 500 r/min離心15 min，收集菌體.將菌體細(xì)胞懸浮在40 mL 重懸溶液(20 mmol/L Tris-HCl buffer pH 8.0，200 mmol/L NaCl)中，在冰水混合物條件下用超聲波法破碎細(xì)胞.細(xì)胞裂解液經(jīng)14 500 r/min、4 ℃下離心45 min，收集上清液.首先，含有可溶性蛋白的上清液經(jīng)Ni親和層析柱進(jìn)行純化.Ni親和層析柱預(yù)先用重懸溶液平衡，上樣后用wash buffer(25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl，15 mmol/L imidazole)除去非特異性吸附的雜蛋白；使用elution buffer(25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl，250 mmol/L imidazole)洗脫目的蛋白MpaA.然后，將可溶性的蛋白使用溶液A(25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)稀釋4倍，上樣到已使用溶液 A平衡好的離子交換柱 Source 15Q上，使用溶液A與溶液B(25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mol/L NaCl)進(jìn)行150 mL的線性梯度洗脫.收集目標(biāo)蛋白并濃縮.凝膠過濾層析柱 Superdex-200 increase 預(yù)先用溶液C(25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl)平衡，將濃縮蛋白樣品上樣，收集目標(biāo)蛋白峰.SDS-PAGE電泳檢測蛋白質(zhì)的純度及性狀.所有的蛋白純化步驟均在4 ℃進(jìn)行.

1.4MpaA蛋白結(jié)晶、衍射、數(shù)據(jù)分析

蛋白質(zhì)晶體生長條件的初篩采用20 ℃坐滴氣象擴(kuò)散法，使用Hampton research 公司的Index1-96、Crystal Screen、Crystal Screen 2試劑盒和Emerald公司的Wizard I、WizardII、WizardIII試劑盒，共336個條件.使用48孔坐滴板，池液100 μL，1 μL蛋白與1 μL 池液混合.在獲得晶體初步生長條件基礎(chǔ)上，通過改變結(jié)晶緩沖液中沉淀劑的濃度對MpaA晶體進(jìn)行優(yōu)化，得到衍射分辨率較高的蛋白質(zhì)單晶，從而進(jìn)行衍射數(shù)據(jù)的收集、處理及結(jié)構(gòu)解析.在收集衍射數(shù)據(jù)時，MpaA蛋白質(zhì)單晶在晶體防凍液(體積分?jǐn)?shù)為20%的甘油)中浸泡30 s，置于X光機(jī)，于-173 ℃條件下收集衍射數(shù)據(jù).衍射數(shù)據(jù)的收集在上海同步輻射光源(SSRF)線站BL17U1完成.衍射數(shù)據(jù)使用軟件HKL2000進(jìn)行處理[11].

2　結(jié)果

2.1pET-21b-MpaA表達(dá)載體構(gòu)建

mpaA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，在750 bp處可見特異性的PCR產(chǎn)物條帶，與mpaA基因理論值吻合，且無其他雜帶.該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收、NdeI和XhoI雙酶切，連接至同樣雙酶切的pET-21b(+)載體上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中.篩選出蛋白表達(dá)、質(zhì)粒PCR檢測均為陽性的轉(zhuǎn)化子送出測序，測序結(jié)果表明插入基因序列正確、無突變.

2.2重組蛋白MpaA的表達(dá)與純化

通過在液體LB培養(yǎng)基中大規(guī)模培養(yǎng)陽性克隆子pET-21b-mpaA，并誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá).在15 ℃條件下，MpaA可溶性表達(dá).使用Ni親和層析、離子交換層析和凝膠過濾層析三步法來純化MpaA蛋白.經(jīng)Ni親和層析柱洗脫下來的蛋白質(zhì)溶液，進(jìn)一步使用離子交換柱Source 15Q進(jìn)行純化，呈現(xiàn)單一蛋白質(zhì)洗脫峰，峰形對稱且尖銳，無肩膀峰的存在，蛋白無明顯損失(數(shù)據(jù)未顯示).收集該蛋白質(zhì)洗脫峰，濃縮至2 mL，高速離心后上樣至Superdex-200 increase層析柱，洗脫結(jié)果如圖1a所示，該蛋白質(zhì)洗脫峰平滑、對稱，說明MpaA蛋白性狀良好、處于均一狀態(tài).SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果如圖1b所示.SDS-PAGE凝膠電泳檢測顯示蛋白分子質(zhì)量為29 ku，與預(yù)測理論值大小相等，MpaA蛋白純度達(dá)到98%以上，質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/L，可用于蛋白晶體的生長.

圖1　MpaA蛋白的分子篩層析圖譜(a)與SDS-PAGE檢測(b)Fig.1　Gel-filtration chromatography profile of MpaA(a)and SDS-PAGE analysis of MpaA after chromatography(b)

2.3MpaA蛋白結(jié)晶、衍射及數(shù)據(jù)分析

MpaA晶體初篩2 d后，在Crystal screen 的18號條件(0.2 mol/L 乙酸鎂、0.1 mol/L 二鉀砷酸鈉和200 g/L PEG 8 000)長出小塊狀晶體.調(diào)整優(yōu)化沉淀劑和鹽濃度，在條件為0.15 mol/L乙酸鎂、0.1 mol/L二鉀砷酸鈉和170 g/L PEG 8 000時，晶體長成0.15 mm×0.15 mm×0.1 mm，如圖2a所示，能夠用于X射線衍射.MpaA晶體分辨率為0.26 nm(圖2b)，晶體衍射數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表2.晶體空間群是P31，晶胞參數(shù)為a=5.989 3 nm，b=5.989 3 nm，c=12.987 0 nm，β=90.000 °.

圖2　MpaA蛋白質(zhì)晶體(a)和X光衍射圖譜(b)Fig.2　Crystallization(a) and diffraction pattern(b) of MpaA

空間群a,b,c/nmα,β,γ/(°)鑲嵌度/(°)分辨率范圍/nm總衍射點(diǎn)數(shù)P315.9893,5.9893,12.987090.000,90.000,120.0001.39～1.855.00～0.26(0.269～0.26)87355非重復(fù)衍射點(diǎn)數(shù)完整度/%冗余度I/σ(I)Rmerge1596199.97(99.74)5.47(5.57)21.3(5.5)0.099(0.467)

括號內(nèi)的數(shù)據(jù)代表的是最高分辨率殼層的數(shù)據(jù).

3　討論

肽聚糖水解酶MpaA在肽聚糖循環(huán)再生系統(tǒng)發(fā)揮功能，負(fù)責(zé)切割中間產(chǎn)物胞壁質(zhì)三肽中γ-D-Glu與meso-DAP之間的酰胺鍵.釋放的氨基酸產(chǎn)物或被用作原料重新合成肽聚糖，或被微生物在營養(yǎng)元素匱乏時用作能源.本研究克隆和表達(dá)了來源于致病微生物大腸桿菌O157中的肽聚糖水解酶MpaA，經(jīng)三步驟純化后對其進(jìn)行晶體生長研究和初步晶體學(xué)分析，期望能夠解析MpaA的三維結(jié)構(gòu)，進(jìn)而從結(jié)構(gòu)生物學(xué)角度來揭示MpaA的底物特異性原因和催化反應(yīng)機(jī)制.在克隆mpaA基因時，考慮到mpaA基因來源于大腸桿菌O157，使用NCBI中的Blast軟件進(jìn)行搜索驗證，在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中也含有該基因.為避免假陽性結(jié)果的產(chǎn)生，在篩選基因mpaA陽性克隆子時，先進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)檢測，對蛋白誘導(dǎo)表達(dá)呈現(xiàn)陽性的克隆子提取其質(zhì)粒，當(dāng)質(zhì)粒的PCR檢測也呈現(xiàn)陽性時即可確認(rèn)為陽性克隆子，送出測序確認(rèn)克隆成功.在蛋白質(zhì)MpaA分離純化過程中，依次使用Ni親和層析、離子交換及凝膠過濾層析三步驟.離子交換和凝膠過濾層析結(jié)果均顯示出MpaA蛋白洗脫峰單一，對稱且平滑，說明了MpaA蛋白性狀良好、狀態(tài)均一；結(jié)合SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，MpaA蛋白能夠用于后繼的晶體生長實驗.在晶體生長條件初步篩選過程中，336個結(jié)晶溶液條件中僅有少數(shù)幾個條件有蛋白質(zhì)晶體長出，充分說明了蛋白質(zhì)晶體生長需要做大量篩選的必要性.通過對結(jié)晶溶液中乙酸鎂和PEG 8000的濃度分別優(yōu)化至0.15 mol/L和 170 g/L時，得到大小適中、能夠用于X線衍射的蛋白質(zhì)單晶,分辨率為0.26 nm.在使用液氮速凍晶體的過程中，為防止冰晶的產(chǎn)生，在結(jié)晶溶液中添加甘油作為防凍劑，其終體積分?jǐn)?shù)為20%.經(jīng)衍射實驗證實，20%的甘油不影響晶體的分辨率.此前，國外研究學(xué)者M(jìn)aqbool等人已克隆、表達(dá)、純化了來源于大腸桿菌O157的MpaA，遺憾的是該MpaA蛋白質(zhì)不長晶體.不得已，Maqbool課題組成員對MpaA的同源蛋白Vh_MpaA進(jìn)行了結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究[10].盡管具有近似催化功能的同源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以為解釋MpaA的催化機(jī)理提供一定的幫助，但最終需要測定其自身的結(jié)構(gòu)才能夠更好地回答重要的科學(xué)問題.這是因為蛋白質(zhì)功能的行使必須依賴于其正確的三維結(jié)構(gòu)的形成.本文的研究工作為正確解釋MpaA的催化機(jī)理奠定了良好的基礎(chǔ).目前，本課題組正嘗試?yán)梅肿又脫Q法解析MpaA三維結(jié)構(gòu).MpaA三維結(jié)構(gòu)的解析不僅能夠在分子水平闡明其催化反應(yīng)機(jī)制，而且也能夠為新型抗感染小分子藥物的設(shè)計提供結(jié)構(gòu)學(xué)數(shù)據(jù).

[1]WALDEMAR V，BERNARD J，PAULETTE C，et al.Bacterial peptidoglycan(murein)hydrolases [J].FEMS Microbiol Rev，2008a，32:259-286.DOI:10.1111/j.1574-6976.2007.00099.x.

[2]WALDEMAR V，DIDIER B，MIGUEL A D P.Peptidoglycan structure and architecture [J].FEMS Microbiol Rev，2008b，32:149-167.DOI:10.1111/j.1574-6976.2007.00094.x.

[3]HEIJENOORT J V.Peptidoglycan hydrolases of escherichia coli [J].Microbiol Mol Biol，2011，75(4):636-663.DOI:10.1128/mmbr.00022-11.

[4]ANANTHARAMAN V，ARAVIND L.Evolutionary history，structural features and biochemical diversity of the NlpC/P60 superfamily of enzymes [J].Genome Biology，2003，4:R11.DOI:10.1186/gb-2003-4-2-r11.

[5]JAMES T P，TSUYOSHI U.How bacteria consume their own exoskeletons(Turnover and recycling of cell wall peptidoglycan)[J].Microbiol Mol Biol，2008，72(2):211-227.DOI:10.1128/mmbr.00027-07.

[6]JACOBS C，HUANG LI-JUN，BARTOWSKY E，et al.Bacterial cell wall recycling provides cytosolic muropeptides as effectors for beta-lactamase induction [J].The EMBO Journal，1994，13(19):4684-4694.

[7]TSUYOSHI U，JAMES T P.Identification of MpaA，an amidase in Escherichia coli that hydrolyzes the gamma-D-glutamyl-meso-diaminopimelate bond in murein peptides [J].Journal of Bacteriology，2003，185(2):679-682.DOI:10.1128/jb.185.2.679-682.2003.

[8]SCHROEDER U，HENRICH B，F(xiàn)INK J，et al.Peptidase D of Escherichia coli K-12，a metallopeptidase of low substrate specificity [J].FEMS Microbiology Letters，1994，123(1-2):153-159.DOI:http://dx.doi.org/10.1111/j.1574-6968.1994.tb07215.x.

[9]GULICK A M，SCHMIDT D M Z，GERLT JOHN A，et al.Evolution of enzymatic activities in the enolase superfamily:crystal structures of the L-Ala-D/L-Glu epimerases fromEscherichiacoliandBacillussubtilis[J].Biochemistry，2001，40(51):15716-15724.DOI:10.1021/bi011641p.

[10]MAQBOOL A，HERVE M，LECREULX D M，et al.MpaA is a murein-tripeptide-specific zinc carboxypeptidase that functions as part of a catabolic pathway for peptidoglycan-derived peptides in gamma-proteobacteria [J].Biochem J，2012，448:329-341.DOI:10.1042/BJ20121164.

[11]OTWINOWSKI Z，WLANEK M.Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode [J].Methods Enzymol，1997，276:307-326.DOI:10.1016/S0076-6879(97)76066-X.

(責(zé)任編輯：趙藏賞)

Cloning，expression，purification and crystallization of murein-tripeptide amidase MpaA from Escherichia coli O157

MA Yinliang，LIU Shuang，CUI Yaqi，KANG Xianjiang，LIU Xiuhua

(College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China)

The genempaAfromEscherichiacoliO157 was inserted into pET-21b(+)vector using molecular cloning method.The recombinant protein MpaA was overexpressed inE.coliBL21(DE3)competent cells，and purified to homogeneity sequentially via a three-step protocol consisting of Ni-chelating affinity column，ion-exchange column and size-exclusion column chromatography.Crystallization search and optimization for MpaA were carried out using the sitting-drop vapour-diffusion method.The MpaA crystal diffracted to 0.26 nm resolution and belonged to the space group P31，with unit-cell parametersa=5.989 3 nm，b=5.989 3 nm，c=12.987 0 nm andβ=90.000 °.Preliminary crystallographic analysis builds up a good foundation for the structural determination and catalytic mechanism of MpaA.

EscherichiacoliO157;peptidoglycan hydrolase;MpaA;crystal

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.04.013

2015-10-16

國家自然科學(xué)基金資助項目(31300056)；河北省自然科學(xué)基金資助項目(C2014201039)；河北省教育廳優(yōu)秀青年基金資助項目(YQ2014007)；河北大學(xué)自然科學(xué)基金資助項目(2011-220)

馬銀良(1989—)，男，河北邢臺人，河北大學(xué)在讀碩士研究生.E-mail:mayinliang@outlook.com

劉秀華(1981—)，女，河北泊頭人，河北大學(xué)副教授，主要從事蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究.

E-mail:xiuhualiu@hbu.edu.cn

Q71

A

1000-1565(2016)04-0412-05