張宇鵬+田燚+宸帆+海龍+亞青

摘 要：以刺參溶菌酶基因（lysozyme gene， LYZ）為靶基因探索構(gòu)建刺參體內(nèi)RNA干擾體系。構(gòu)建了3個刺參溶菌酶基因特異性的RNA干擾重組質(zhì)粒，以刺參體腔液原代培養(yǎng)細(xì)胞為靶細(xì)胞進(jìn)行篩選；分別以口腔注射和腹腔注射的方式以及不同的注射劑量對刺參LYZ進(jìn)行體內(nèi)RNA干擾，并運(yùn)用qPCR技術(shù)測定刺參LYZ的表達(dá)量；最后，對刺參LYZ進(jìn)行體內(nèi)RNA干擾，并分別運(yùn)用qPCR技術(shù)和比濁法測定刺參LYZ的表達(dá)量及其酶活性。結(jié)果顯示：3種RNA干擾重組質(zhì)粒的沉默效率分別為40%、45%、0%；體腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒時，各組織中LYZ的表達(dá)量均出現(xiàn)了顯著的上升（P<0.05），而從口腔注射時，體腔液和肌肉中LYZ的表達(dá)量均出現(xiàn)極為顯著的下降（P <0.01），而在管足中未出現(xiàn)明顯變化；當(dāng)其注射劑量為0.5 μg和5 μg時未對LYZ的表達(dá)產(chǎn)生有效的抑制作用；當(dāng)注射劑量為10 μg和25 μg時，刺參體內(nèi)LYZ的表達(dá)受到了明顯抑制，但是注射劑量為25 μg時，部分刺參個體出現(xiàn)吐腸現(xiàn)象；在轉(zhuǎn)染12 h后，刺參體腔液、肌肉、體壁、疣足和管足組織中LYZ的表達(dá)量開始下降，到第四天后開始回升。表明：只有從口腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒且注射劑量達(dá)到10 μg時才能有效地抑制靶基因的表達(dá)；刺參體內(nèi)RNA干擾具有系統(tǒng)性，可以在各個組織間相互傳導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：刺參；溶菌酶基因；RNA干擾

中圖分類號：S917.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

RNA干擾（RNA interference）是指雙鏈RNA（dsRNA）在細(xì)胞內(nèi)特異性的誘導(dǎo)與之同源互補(bǔ)的mRNA的降解，從而使相應(yīng)基因的表達(dá)關(guān)閉，最終引發(fā)基因轉(zhuǎn)錄后水平沉默的現(xiàn)象（PTGS）[1-3]。到目前為止，RNA干擾是最準(zhǔn)確和有效的在“體外”和“體內(nèi)”條件下抑制特異基因表達(dá)的方法[4]?，F(xiàn)在，RNA干擾技術(shù)被越來越廣泛地應(yīng)用于水生動物基因組學(xué)的研究中。Genciana Terova等[5]利用dsRNA和shRNA抑制肌肉生長抑制素（MSTN）的表達(dá)，從而驗(yàn)證該基因的功能。Liu等[6]使用dsRNA使QM表達(dá)沉默，表明QM對于凡納濱對蝦和太平洋白蝦的主動防御起到了正向調(diào)節(jié)作用。在進(jìn)行體內(nèi)RNA干擾時，可以通過浸泡、飼喂和注射等方式將人工構(gòu)建的RNA干擾序列導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)。Genciana Terova等[5]分別通過電脈沖和注射的方式成功地將dsRNA和shRNA導(dǎo)入海鱸體內(nèi)。Naoki等[7]的研究表明動物體內(nèi)RNA干擾存在劑量和時間依賴性的效應(yīng)。

刺參（Apostuchopus japonicas）具有較高的經(jīng)濟(jì)價值和藥用價值[8]，是目前中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的主要養(yǎng)殖品種之一。但是，近年來刺參細(xì)菌性和病毒性病害屢屢大面積發(fā)生，給養(yǎng)殖業(yè)者帶來了巨大損失[9-10]。故提升刺參養(yǎng)殖業(yè)者的防病和治病能力顯得愈發(fā)迫切。溶菌酶是生物體內(nèi)極為重要的一種非特異性免疫因子，在機(jī)體免疫過程中不僅能催化水解細(xì)菌細(xì)胞壁而導(dǎo)致細(xì)菌溶解死亡[11-12]，還可誘導(dǎo)其他免疫因子。水生動物血清溶菌酶活力的高低是衡量機(jī)體免疫狀態(tài)的指標(biāo)之一。血清溶菌酶活力提高，其免疫能力也相應(yīng)提高[13]。Nermeen M Abu-Elala等[14]使用生物活性免疫增強(qiáng)劑-殼源殼聚糖刺激尼羅羅非魚（Oreochrmis niloticus），吞噬活性/指數(shù)、NBT、溶菌酶活性及ACH50等免疫參數(shù)均顯著上升，且對嗜水氣單胞菌的抗感染能力增強(qiáng)。Patrizia Pagliara等[15]使用高濃度鋅處理海膽（Paracentrotus lividus）后，溶菌酶活性等免疫指標(biāo)出現(xiàn)短暫下降，同時抗溶藻弧菌V. alginolyticus活性也相應(yīng)下降，表明海膽的免疫力下降。

本研究以刺參溶菌酶基因的cDNA序列為依據(jù)，設(shè)計用于RNA干擾的miRNA前體序列，分析不同注射方式和注射劑量條件下刺參溶菌酶基因的表達(dá)量變化，為構(gòu)建刺參體內(nèi)RNA干擾體系提供參考依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用刺參取自遼寧省大連市東北部海域，暫養(yǎng)于水槽內(nèi)，飼養(yǎng)溫度為12～16℃，飼料為海參配合飼料。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和壯觀霉素購自美國Sigma公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自北京天根公司，Entranster-in vivo轉(zhuǎn)染試劑購自北京英格恩公司，Trizol總RNA提取試劑購自Life Technologies公司，EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，SYBR Premix Ex TaqTMII購自大連寶生物工程有限公司， BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP 均購置于Invitrogen公司，HQ高純度質(zhì)粒抽提試劑盒購置Invitrogen公司。引物合成和測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

2 方法與操作

2.1 刺參溶菌酶基因miRNA干擾前體序列及主要引物的設(shè)計

根據(jù)刺參溶菌酶基因（GenBank： KF773759.1）序列設(shè)計刺參溶菌酶基因的miRNA干擾前體序列。設(shè)計所得序列見表1。

2.2 刺參溶菌酶基因RNA干擾重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將合成的寡聚單鏈DNA退火連接成雙鏈DNA，然后將退火的雙鏈DNA與RNA干擾載體按下列體系在室溫連接30 min構(gòu)建RNA干擾重組質(zhì)粒：5×ligation buffer 4 μL、pcDNA6.2-GW/EmGFP 2 μL、ds oligo（10 nm） 4 μL、T4 DNA ligase（1 U/μL）1 μL、ddH2O 9 μL。接下來將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中并涂布于含壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上于37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)至平板上有可見菌落。最后，挑取一個單菌落放入1.5 mL離心管中（試管內(nèi)有1 mL含壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基），于200 r/min、37 ℃培養(yǎng)箱中搖菌過夜培養(yǎng)。運(yùn)用PCR技術(shù)對菌液進(jìn)行檢測后選取含正確條帶的陽性克隆菌液送上海生工公司測序。

2.3 制備RNA干擾重組質(zhì)粒

在含壯觀霉素的LB培養(yǎng)基中接種目標(biāo)菌株，于37 ℃搖床200 r/min振蕩培養(yǎng) 16 h，按照北京天根公司的質(zhì)粒提取試劑盒的說明書提取質(zhì)粒，完成后將質(zhì)粒置于-20℃保存以用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 RNA干擾重組質(zhì)粒的篩選

轉(zhuǎn)染前一天將刺參體腔液原代培養(yǎng)細(xì)胞以5×106個/mL 濃度接種于24孔板中。轉(zhuǎn)染前換用1 mL無血清和抗生素的LB液體培養(yǎng)基。每孔加入的轉(zhuǎn)染復(fù)合物體積為18 μL，其中含2 μg RNA干擾重組質(zhì)粒、2 μL Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和相應(yīng)體積的待用培養(yǎng)液。接下來將細(xì)胞在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后，換上含抗生素的完全培養(yǎng)液，放置在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h更換一次培養(yǎng)液。在細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染48 h后，提取細(xì)胞樣品中的總RNA用于測定溶菌酶基因的表達(dá)量，所用引物如表2所示。qPCR反應(yīng)體系的總體積為20 μL且各組分的體積如下：SYBR 10 μL，Primer F/R 各0.8 μL，ROX 0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL；反應(yīng)條件如下：預(yù)熱階段為95 ℃，30 s，PCR反應(yīng)階段共40個循環(huán)分別為95 ℃，5 s、60 ℃，32 s，獲得熔解曲線階段為95 ℃，15 s，60 ℃，60 s，95 ℃，15 s，60 ℃，15 s。

2.5 刺參體內(nèi)RNA干擾方法的探索

2.5.1 刺參體內(nèi)RNA干擾的最佳注射方式 選取生長一致、健康狀況良好的刺參隨機(jī)分為5組，每組3頭，使用250 μL規(guī)格的微量進(jìn)樣器注射RNA干擾重組質(zhì)粒，每頭刺參的注射劑量為0.625 μg/g。其中：第一、二組為實(shí)驗(yàn)組，第一組為體腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒miRNA-2，第二組為口腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒miRNA-2；第三、四組為陰性對照組，第三組以體腔注射陰性對照質(zhì)粒，第四組以口腔注射陰性對照質(zhì)粒；第五組為空白對照組，未做任何處理。注射48 h后，提取刺參體腔液、管足和肌肉組織的總RNA，使用qPCR技術(shù)檢測刺參溶菌酶基因的相對表達(dá)量。

2.5.2 刺參體內(nèi)RNA干擾的最佳注射劑量 選取生長一致、健康狀況良好的刺參隨機(jī)分為6組，每組3頭，第一、二、三和四組為實(shí)驗(yàn)組，第五組為陰性對照組，第六組為空白對照組。均以口腔注射的方式將轉(zhuǎn)染復(fù)合物注射進(jìn)入刺參體內(nèi)。其中，第一組每頭刺參注射0.5 μg RNA干擾重組質(zhì)粒miRNA-2，第二組每頭刺參注射5 μg RNA干擾重組質(zhì)粒miRNA-2，第三組每頭刺參注射10 μg RNA干擾重組質(zhì)粒miRNA-2，第四組每頭刺參注射25 μg RNA干擾重組質(zhì)粒miRNA-2，第五組每頭刺參注射等體積的陰性對照質(zhì)粒，第六組刺參不做任何處理。注射48 h后，分別提取各實(shí)驗(yàn)組刺參體腔液、管足和肌肉組織的總RNA，使用qPCR技術(shù)檢測溶菌酶基因的相對表達(dá)量。

2.5.3 刺參體內(nèi)RNA干擾的時間效應(yīng) 選取生長一致、健康狀況良好的刺參隨機(jī)分為7組，每組3頭，用250 μL微量進(jìn)樣器以口腔注射的方式注射RNA干擾重組質(zhì)粒。其中：第一、二組分別為空白對照組和陰性對照組，每頭刺參分別注射等體積的PBS和10 μg陰性對照質(zhì)粒，然后提取刺參各組織總 RNA；第三至七組為實(shí)驗(yàn)組，每頭刺參分別注射10 μg RNA干擾重組質(zhì)粒miRNA-2，依次于12、24、48 h及4 d和8 d后提取各組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。最后，應(yīng)用qPCR技術(shù)檢測溶菌酶基因的相對表達(dá)量，并使用溶菌酶活性檢測試劑盒檢測各組織樣品中的溶菌酶活性（具體操作見南京建成生物科技有限公司的產(chǎn)品說明書）。

2.6 數(shù)據(jù)處理

基因相對表達(dá)量的計算采用2-ΔΔCT法。溶菌酶基因的表達(dá)量是與內(nèi)參基因CYTB相比的相對表達(dá)量。△△CT=（待測樣品目的基因CT的平均值-待測樣本內(nèi)參基因CT的平均值）-（對照樣品目的基因CT的平均值-對照樣本內(nèi)參基因CT的平均值）。基因的表達(dá)量F=2-△△CT ，目標(biāo)基因的干擾效率為1-2-△△CT。

此外，溶菌酶活性按下述公式計算：

待測樣本蛋白濃度（g/L）= [（測定OD值-空白OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）]

×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.563 g/L）

溶菌酶的活力（U/mL）=（空白OD值-測定OD值）×1 000×稀釋倍數(shù)

溶菌酶的比活（U/mg）=測試物溶菌酶活力（U/mL）/測試物蛋白濃度（mg/mL）

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 RNA干擾重組質(zhì)粒的鑒定與測序

將轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中的RNA干擾重組質(zhì)粒進(jìn)行普通PCR檢測后，使用瓊脂糖凝膠電泳觀察片段長度，電泳圖顯示目的片段長度與預(yù)期一致，282 bp（圖1 ）；為進(jìn)一步檢測插入RNA干擾重組質(zhì)粒中的DNA片段是否為相應(yīng)的目的片段及插入方向是否正確，將菌檢正確的菌樣送至生工公司測序，結(jié)果表明各個RNA干擾重組質(zhì)粒中插入的DNA片段均為正確的目的片段且插入方向正確（圖2 ）。

3.2 溶菌酶基因特異性的RNA干擾重組質(zhì)粒篩選結(jié)果

將溶菌酶基因特異性的RNA干擾重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的刺參體腔液原代細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞并提取總RNA進(jìn)行qPCR檢測。3種RNA干擾重組質(zhì)粒對溶菌酶基因的沉默效率分別為40 %、45 %、0 %（見表3）。

3.3 刺參體內(nèi)RNA干擾的最佳注射方式

為了探索刺參體內(nèi)RNA干擾時RNA干擾重組質(zhì)粒的最佳注射方式，運(yùn)用qPCR技術(shù)對分別從刺參口腔和腹腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒48 h后的刺參各組織樣品中溶菌酶基因表達(dá)量進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖3所示：從體腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒后，各組織中溶菌酶基因表達(dá)量均出現(xiàn)了顯著的上升；而從口腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒后，體腔液和肌肉中溶菌酶基因表達(dá)量均出現(xiàn)非常顯著的下降，而管足中溶菌酶基因表達(dá)量略微上升。

3.4 刺參體內(nèi)RNA干擾的最佳注射劑量

為確定RNA干擾重組質(zhì)粒的最佳注射劑量，分別以口腔注射的方式給各實(shí)驗(yàn)組刺參注射不同劑量的RNA干擾重組質(zhì)粒。結(jié)果如圖4所示：注射劑量為0.5 μg時刺參各組織中溶菌酶基因表達(dá)量均出現(xiàn)顯著上升（P<0.05）；注射劑量為5 μg時管足和體腔液中的溶菌酶基因表達(dá)量出現(xiàn)極為顯著的上升（P<0.01），而在肌肉的表達(dá)量則顯著下降（P<0.05）；注射劑量為10 μg時，管足、肌肉和體腔液中溶菌酶基因表達(dá)量均出現(xiàn)顯著地下降（P<0.05）；注射劑量為25 μg時，管足、肌肉和體腔液中溶菌酶基因表達(dá)量亦出現(xiàn)顯著下降（P<0.05），且刺參個體中出現(xiàn)吐腸現(xiàn)象。

3.5 刺參體內(nèi)RNA干擾的時間效應(yīng)

為探索刺參體內(nèi)RNA干擾在其各個組織中的表達(dá)模式，使用 RNA干擾重組質(zhì)粒miRNA -2對刺參進(jìn)行體內(nèi)RNA干擾，以口腔注射的方式將其注射進(jìn)入刺參體內(nèi)，分別在轉(zhuǎn)染后12、24、48 h、4 d和8 d提取刺參體腔液、肌肉、體壁、疣足和管足組織樣品測定其mRNA表達(dá)量和溶菌酶活性，計算每個實(shí)驗(yàn)組3個平行樣品的平均值并作圖，結(jié)果如圖5所示：體腔液中溶菌酶基因的表達(dá)量在前48 h呈下降趨勢，之后其表達(dá)量快速上升，而其酶活性卻持續(xù)下降；肌肉中溶菌酶基因的表達(dá)量呈階梯下降并在48 h達(dá)到最小值0.1，之后逐步回升，而其酶活性呈波動式變化并在12 h達(dá)到最大值468 U/mL；體壁中溶菌酶基因表達(dá)量及其酶活性的變化趨勢基本一致，分別在12 h達(dá)到最大值1.4和245 U/mL，之后呈下降趨勢；疣足中溶菌酶基因表達(dá)量及其酶活性在前48 h未出現(xiàn)顯著變化，分別在48 h達(dá)到其最小值，之后其表達(dá)量開始逐步回升；管足中溶菌酶基因的表達(dá)量在12 h顯著上升（P< 0.05），在48 h其表達(dá)量達(dá)到最小值0.18，之后逐步回升而其酶活性在12 h達(dá)到最大值，之后逐漸下降。

4 討論

自1998年Fire和Mello發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象以來[3]，RNA干擾技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于癌癥研究、抗病毒及基因功能研究等眾多領(lǐng)域。隨著RNA干擾技術(shù)的逐漸成熟，近年來RNA干擾技術(shù)在水產(chǎn)動物研究中的應(yīng)用逐漸增多。本研究旨在刺參中探索建立一種穩(wěn)定的RNA干擾技術(shù)，以幫助研究人員進(jìn)行刺參基因功能研究及抗病毒等方面的研究。

在動物機(jī)體中，RNA干擾質(zhì)?？梢杂秒姶┛讓?dǎo)入和液體動力注射導(dǎo)入靜脈、皮下及肌肉等方法導(dǎo)入體內(nèi)[16]。Genciana Terova等[5]用肌肉注射然后使用電脈沖儀導(dǎo)入的方法成功介導(dǎo)了RNA干擾使靶基因沉默。而Liu等[6]通過在太平洋白蝦和凡納濱對蝦腹部注射的方法成功介導(dǎo)RNA干擾使QM沉默，證明QM對于凡納濱對蝦和太平洋白蝦的主動防御起到了正向調(diào)節(jié)作用。在本研究中，分別從刺參的體腔和口腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒以介導(dǎo)RNA干擾使溶菌酶基因沉默，結(jié)果表明：體腔注射的方法未能成功介導(dǎo)RNA干擾使溶菌酶基因沉默，而通過口腔注射則可以成功介導(dǎo)RNA干擾使溶菌酶基因沉默，體腔液和肌肉等組織中的溶菌酶基因表達(dá)量出現(xiàn)了極為顯著的下降。

以往的研究表明：RNA干擾對靶基因的抑制效率具有一定的劑量依賴效應(yīng)[17]。Naoki等[7]給小鼠尾靜脈注射不同劑量的pu6-stem21 RNA干擾重組質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn)隨著質(zhì)粒DNA劑量的增加，RNA干擾的沉默效率逐漸提高。此外，何國平等[18]將外源報告基因和編碼短發(fā)夾RNA的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293H細(xì)胞，結(jié)果表明：在一定范圍內(nèi)，RNA干擾載體介導(dǎo)的抑制效應(yīng)與干擾載體劑量大小有關(guān)，當(dāng)劑量加大到足以抑制外源基因表達(dá)時，抑制效應(yīng)則維持在一“平臺期”。由此，從刺參口腔注射不同劑量的RNA干擾重組質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)RNA干擾重組質(zhì)粒的注射劑量為0. 5 μg和5 μg時，刺參體腔液、肌肉和管足中溶菌酶基因的表達(dá)量顯著上升，這與Naoki等[7]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，即RNA干擾重組質(zhì)粒的注射劑量過低時，其靶基因的表達(dá)不僅未受到抑制，相反其表達(dá)量出現(xiàn)顯著上升，可能是由于靶基因的mRNA未被充分地降解并在細(xì)胞自身的調(diào)節(jié)下大量轉(zhuǎn)錄靶基因mRNA予以補(bǔ)充，接下來隨著質(zhì)粒DNA劑量的增加，RNA干擾的沉默效率逐漸提高，但是，當(dāng)RNA干擾重組質(zhì)粒劑量為25 μg時，RNA干擾重組質(zhì)粒介導(dǎo)的抑制效應(yīng)未出現(xiàn)顯著提升且刺參出現(xiàn)吐腸現(xiàn)象，初步推測是由于RNA干擾質(zhì)粒劑量過大導(dǎo)致刺參出現(xiàn)了強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)，從而削弱了RNA干擾重組質(zhì)粒的抑制效應(yīng)。

研究表明：在體內(nèi)和體外RNA干擾中，RNA干擾具有時間依賴性。Naoki等[7]對小鼠的體內(nèi)RNA干擾實(shí)驗(yàn)顯示：在注射RNA干擾重組質(zhì)粒6 h后靶基因的表達(dá)量才開始下降；而何國平等[18]進(jìn)行的體外RNA干擾實(shí)驗(yàn)顯示：EGFP mRNA表達(dá)水平在6 h無變化，直到12 h后才出現(xiàn)微弱的降低，表明細(xì)胞內(nèi)siNRAs生成需要一定時間誘導(dǎo)表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中，注射RNA干擾重組質(zhì)粒后12 h，溶菌酶基因表達(dá)量上升，之后其表達(dá)量下降，表明轉(zhuǎn)染12 h后，刺參體內(nèi)開始產(chǎn)生有效的RNA干擾效應(yīng)，而12 h時溶菌酶基因表達(dá)量上升可能是在注射時刺參體內(nèi)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。此外，RNA干擾效應(yīng)在不同組織之間的傳遞是RNA干擾系統(tǒng)性發(fā)生的決定性因素。以前的研究表明，RNA干擾的系統(tǒng)性在不同物種中是不一樣的[19]。某些甲殼動物和線蟲的RNA干擾效應(yīng)能夠系統(tǒng)性發(fā)生[20-21]，而果蠅的 RNA 干擾效應(yīng)則不能系統(tǒng)性發(fā)生[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同注射部位能夠引起不同的RNA干擾效應(yīng)-體腔注射不會引發(fā)RNA干擾效應(yīng)：從體腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒時只在個別組織如管足中引發(fā)RNA干擾效應(yīng)，而從口腔注射則能夠系統(tǒng)性地在刺參各個組織中引發(fā)RNA干擾效應(yīng)；在刺參體內(nèi)RNA干擾的時間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，注射RNA干擾重組質(zhì)粒12 h后，刺參管足中溶菌酶基因的表達(dá)量持續(xù)下降，而其酶活性下降后從24 h開始逐步回升，與體腔液中溶菌酶基因的表達(dá)量變化趨勢基本一致。通過對刺參的解剖實(shí)驗(yàn)表明：管足和疣足等組成刺參的水管系統(tǒng)，管足中的體液來自體腔液和疣足。推測體腔液和疣足中合成的溶菌酶通過體液循環(huán)到達(dá)管足，從而導(dǎo)致管足中溶菌酶活性上升。

綜上所述，當(dāng)RNA干擾重組質(zhì)粒的注射劑量為10 μg且從口腔注射時能夠在刺參體內(nèi)引發(fā)有效的RNA干擾效應(yīng)，該RNA干擾效應(yīng)具有系統(tǒng)性即能夠在不同組織之間的傳遞，且RNA干擾重組質(zhì)粒介導(dǎo)的刺參體內(nèi)RNA干擾最長能持續(xù)4 d左右。

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（收稿日期：2016-05-19；修回日期：2016-05-23）