莊健海，何　嫻，卓雪芽，鄭文標(biāo)

(廣東省佛山市中醫(yī)院檢驗(yàn)科　528000)

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·論著·

自制大容量扣式負(fù)壓抽提裝置應(yīng)用于RNA抽提的性能評(píng)價(jià)*

莊健海，何嫻，卓雪芽，鄭文標(biāo)

(廣東省佛山市中醫(yī)院檢驗(yàn)科528000)

目的對自制大容量扣式負(fù)壓抽提裝置進(jìn)行擴(kuò)增前性能評(píng)價(jià)。方法采用配套負(fù)壓抽提裝置(對照組裝置)和自制大容量扣式負(fù)壓抽提裝置(實(shí)驗(yàn)組裝置)對67份白細(xì)胞(WBC)大于2.0×109/L的新鮮全血進(jìn)行核酸(RNA)提取并進(jìn)行擴(kuò)增前性能評(píng)價(jià)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)組的工作效率、提取RNA的濃度、純度及完整性。結(jié)果67份RNA標(biāo)本采用對照組裝置69 min完成抽提，處理效率平均為0.97份/分；實(shí)驗(yàn)組裝置41 min完成抽提，效率為1.63份/分。對照組抽提標(biāo)本RNA濃度為(248.8±21.4)μg/mL，實(shí)驗(yàn)組為(260.3±21.8)μg/mL。對照組抽提標(biāo)本OD260/OD280和OD260/OD230分別為(1.995±0.095)和(2.020±0.082)，95%CI分別為1.964～2.025和2.001～2.040，實(shí)驗(yàn)組分別為(2.093±0.092)和(2.071±0.120)，95%CI分別為2.075～2.113和2.044～2.103；2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=24.570,P<0.001)，線性回歸方程Y=0.950X+0.039,R2=0.903。2組裝置提取RNA后完整性均較好，電泳條帶整齊、清晰。結(jié)論自制大容量扣式負(fù)壓抽提裝置具有更高的抽提工作效率，且能保證RNA濃度、純度及完整性，更符合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，具有更優(yōu)的臨床價(jià)值。

負(fù)壓抽提裝置；核酸；RNA提取

核酸提取是下游檢測、基因分型的起點(diǎn)，是分子生物學(xué)最關(guān)鍵的基本方法之一，已經(jīng)廣泛滲透到生物學(xué)、遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)等各個(gè)生命領(lǐng)域。抽提所分離的核酸質(zhì)量直接影響后續(xù)的檢測效率及準(zhǔn)確性，起著承前啟后的關(guān)鍵作用[1-3]。

本科室日均處理RNA提取標(biāo)本量大，使用的配套負(fù)壓抽提裝置存在壓力易泄漏，不穩(wěn)定，處理工作效率低，容量小等缺陷。為此現(xiàn)研制一款大容量扣式負(fù)壓抽提裝置，通過平行使用配套負(fù)壓抽提裝置和自制大容量扣式負(fù)壓抽提裝置進(jìn)行擴(kuò)增前性能評(píng)價(jià)，比較兩者工作效率、提取RNA的純度及完整性，為自制裝置的使用提供理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料選取該院已檢測的白細(xì)胞(WBC)大于2.0×109/L的新鮮全血67份作為標(biāo)本，排除嚴(yán)重脂濁、溶血、黃疸標(biāo)本，采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝。

1.2儀器與試劑

1.1.1RNA抽提的柱式抽提法(1)對照組RNA提取裝置：采用配套的美國AXYGEN公司生產(chǎn)的負(fù)壓抽提裝置(型號(hào) AP VM Ⅱ)AP VM Ⅱ 可容納16支柱子。(2)實(shí)驗(yàn)組RNA提取裝置：采用自制大容量扣式負(fù)壓抽提裝置。本實(shí)驗(yàn)室從3個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)：第一，將負(fù)壓抽提裝置改為四面蝶形的扣環(huán)，啟動(dòng)時(shí)完全取代人力，也可克服裝置使用時(shí)間長后，上下兩部分間隙逐漸加大的弱點(diǎn)。第二，將銜接處改為螺旋接口，支持單個(gè)銜接處更換，不用時(shí)用螺旋蓋帽封閉，避免因個(gè)別泄露導(dǎo)致整個(gè)裝置漏壓。第三，將裝置改為8×12陣列形式，容納96支柱子，較市面普遍使用的負(fù)壓抽提裝置容納柱量增加6倍以上，完美銜接下游的PCR擴(kuò)增儀。

1.1.2RNA純度檢測采用eppendorf bioPhotometer plus核酸蛋白測定儀，RNA完整性檢測使用北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-4C型電泳儀與UVI凝膠電泳成像儀，抽提柱子及抽提試劑由上?？迫A生物工程股份有限公司提供。

1.3方法將標(biāo)本3 500 r/mL離心15 min，吸取標(biāo)本中白細(xì)胞層，裝至試管中，再往試管中加入紅細(xì)胞溶血素-SYS-SLS，由蘭橋醫(yī)療醫(yī)學(xué)科技有限公司提供，比例為1∶5，冰上孵育10 min，期間渦旋振蕩2次，然后4 ℃ 2 100 r/min離心10 min，棄上清液，加入500 μL紅細(xì)胞溶血素,重懸沉淀WBC,重復(fù)上一步驟，最后加入400 μL配套提取試劑里的裂解液，振蕩重懸沉淀，WBC平均分成2份(A、B)，各200 μL，并分裝至試管，并作編號(hào)。所有處理標(biāo)本的吸頭、吸嘴及試管皆用0.1焦碳酸二乙酯(DEPC)室溫浸泡2 h，無菌水淋洗數(shù)次，100 ℃干烤15 min，1.034×105Pa高壓滅菌15 min,備用。

1.4標(biāo)本RNA提取同時(shí)使用對照組裝置和實(shí)驗(yàn)組裝置對67份標(biāo)本進(jìn)行RNA抽提，其中A標(biāo)本使用對照組裝置抽提，B標(biāo)本使用實(shí)驗(yàn)組裝置。

1.5性能評(píng)價(jià)(1)提取工作效率：記錄對照組裝置和實(shí)驗(yàn)組裝置完成67份標(biāo)本RNA抽提所需時(shí)間。(2)濃度及純度檢測：標(biāo)本4倍稀釋后，直接使用eppendorf bioPhotometer plus核酸蛋白測定儀測定標(biāo)本的OD260、OD260/OD280 及OD260/OD230?？煞謩e反映標(biāo)本抽提總RNA濃度、蛋白質(zhì)干擾及有機(jī)溶劑殘留情況。(3)完整性檢測：取10 μL提取標(biāo)本與2 μL上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠，0.5 TBE電泳緩沖液環(huán)境下，110 V 恒壓電泳15 min，然后0.5 μg/mL溴化乙錠(EB)染色5 min，最后凝膠電泳成像系統(tǒng)拍照檢測。

2　結(jié)　　果

2.12種裝置工作效率結(jié)果比較對照組裝置處理67份RNA標(biāo)本抽提用時(shí)69 min，處理效率平均為0.97份/分；實(shí)驗(yàn)組裝置用時(shí)41 min，效率平均為1.63份/分,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.22種裝置RNA濃度及純度檢測結(jié)果比較對照組標(biāo)本檢測OD260為(1.555±0.134)，實(shí)驗(yàn)組為(1.627±0.136)。計(jì)算2組RNA濃度分別為(248.8±21.4)μg/mL和(260.3±21.8)μg/mL。對照組OD260/OD280 及OD260/OD230比值分別為(1.995±0.095)和(2.020±0.082),實(shí)驗(yàn)組分別為(2.093±0.092)和(2.071±0.120)。2種裝置抽提RNA濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2種裝置抽提標(biāo)本RNA蛋白質(zhì)干擾及有機(jī)溶劑殘留，RNA OD260/OD280 95%CI為1.80～2.00，OD260/OD230 95%CI大于2.00。相關(guān)性分析顯示，Y=0.950X+0.039,R2=0.903，2組數(shù)據(jù)相關(guān)性良好。

2.32種裝置RNA完整性結(jié)果比較凝膠電泳成像系統(tǒng)拍照檢測，電泳結(jié)果顯示，2種設(shè)備提取的總RNA有2條整齊、清晰條帶(18S、28S)，說明2種設(shè)備在RNA提取過程中，RNA降解少，完整性較好，2組完整性均符合要求。見圖1、2。

圖1　　自制裝置提取RNA(A13-A17)

圖2　　配套裝置提取RNA(B13-B17)

3　討　　論

方法學(xué)評(píng)價(jià)通過實(shí)驗(yàn)途徑測定分析方法的技術(shù)性能，確認(rèn)其是否滿足臨床使用要求或驗(yàn)證是否達(dá)到廠家聲明的技術(shù)性能指標(biāo)[4-6]。血液中提取RNA是分子生物學(xué)研究中常用的重要實(shí)驗(yàn)技術(shù)[7-8]。RNA分子結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，可受較多因素改變而降解[9-10]。本研究RNA提取采用柱式分離技術(shù)[11]。

本研究結(jié)果表明，RNA提取工作效率上，對照組裝置為69 min，處理效率平均為0.97份/分；實(shí)驗(yàn)裝置為41 min，平均為1.63份/分，實(shí)驗(yàn)組遠(yuǎn)高于對照組。對照組裝置每次只能處理16份標(biāo)本，當(dāng)標(biāo)本大于16份時(shí)，需多次處理，67份標(biāo)本須下柱4次及裝柱5次；實(shí)驗(yàn)組裝置可一次性完成67份標(biāo)本處理。本實(shí)驗(yàn)室日均處理RNA抽提標(biāo)本在125份以上，可節(jié)約時(shí)間近60 min，提示標(biāo)本量越大，優(yōu)勢越明顯。使用實(shí)驗(yàn)組裝置降低等待下游檢測時(shí)間太長所致的RNA降解風(fēng)險(xiǎn)[12-13]。2組抽提標(biāo)本RNA濃度結(jié)果顯示，對照組裝置為(248.8±21.4)μg/mL，實(shí)驗(yàn)組裝置為(260.3±21.8)μg/mL，實(shí)驗(yàn)組裝置抽提標(biāo)本RNA濃度較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=24.570，P<0.001)。相關(guān)性分析表明，Y=0.950X+0.039,R2=0.903，2組數(shù)據(jù)相關(guān)性良好。

OD280nm和OD230nm的吸光度分別代表蛋白質(zhì)和有機(jī)溶劑含量，OD260/OD280和OD260/OD230比值可考察上述物質(zhì)在RNA進(jìn)行下游檢測時(shí)的干擾程度，即反映抽提的RNA純度[14]。對照組裝置的OD260/OD280和OD260/OD230分別為(1.995±0.095)和(2.020±0.082)，95%CI為1.964～2.025和2.001～2.040;實(shí)驗(yàn)組裝置為(2.093±0.092)和(2.071±0.120)，95%CI分別為2.075～2.113和2.044～2.103，說明2組OD260/OD280的95%CI為1.80～2.00，OD260/OD230的95%CI>2.00，證明2種裝置提取RNA純度均較好，但實(shí)驗(yàn)組裝置的OD260/OD280和OD260/OD230比值較對照組大，純度更好，可能與抽提過程中扣式裝置傳遞和維持負(fù)壓更穩(wěn)定有關(guān)。RNA完整性分析顯示，2種設(shè)備提取的RNA在28S及18S處有2條明顯的條帶，且28S亮度大于18S，說明2種設(shè)備在RNA提取過程中，RNA降解少，完整性較好。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)組裝置RNA抽提質(zhì)量稍好于對照組，能保證RNA的濃度、純度及完整性，可在臨床實(shí)驗(yàn)室使用，且工作效率提高較大，解決了負(fù)壓抽提裝置普遍存在需借助人手按壓啟動(dòng)、壓力易泄露、易損壞及柱子容納數(shù)量少等缺點(diǎn)，實(shí)用性增強(qiáng)，具有更優(yōu)的臨床價(jià)值。

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Performance evaluation of the one self-developed device for transmitting negative pressure in RNA extraction*

ZHUANGJianghai,HEXian,ZHUOXueya,ZHENGWenbiao

(DepartmentofClinicalLaboratory,FoshanTraditionalChineseMedicineHospital,Foshan，Guangdong528000,China)

ObjectiveTo evaluate the self-developed device for transmitting negative pressure with large capacity before propagating.MethodsTotally 67 ribonucleic acid(RNA) of WBC>2.0×109/L fresh whole blood were extracted with the intrinsic device(control) and the self-developed device for transmitting negative pressure with large capacity(test) in parallel.The difference of the performance including efficiency,concentration,purity and integrity of RNA extraction were evaluated between the two groups.ResultsIn 67 specimens of RNA extraction,efficiency,concentration,purity and integrity of the control device were 0.97(portion/minute),(248.8±21.4)μg/mL,(1.995±0.095) (OD260/OD280)，(2.020±0.082) (OD260/OD230),1.964-2.025 (95% confidence interval for mean) (OD260/OD280),2.001-2.040(95% confidence interval for mean) (OD260/OD230) and complete.Those of test device were 1.63 portion/minutes,(260.3±21.8)μg/mL,(2.093±0.092) at OD260/OD280,(2.071±0.120) at OD260/OD230,2.075-2.113 for 95% confidence interval for mean at OD260/OD280,2.044-2.103 for 95% confidence interval for mean at OD260/OD230 and complete.Thetvalue was 24.570 (P<0.001) in pairedt-test,and the linear regression equation wasY=0.950X+0.039,R2=0.903 for the two groups data of RNA concentration.ConclusionThe self-developed device for transmitting negative pressure with large capacity is excellent in the work efficiency,concentration,purity,integrality and of the RNA in extracting.It is better than the intrinsic device in the clinical value for situation of lab.

device for transmitting negative pressure;ribonucleic acid;RNA extraction

廣東省科技廳科枝計(jì)劃項(xiàng)目(2013-137-06)。

莊健海，男，主任技師，主要從事臨床免疫及分子生物學(xué)研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.025

A

1673-4130(2016)19-2723-03

2016-03-01

2016-04-23)