劉利曉 ，張 亮 ，向艷娥 ，黃志偉 ，李洪波 ，崔 佳

（1.河南省駐馬店市獸藥飼料（動(dòng)物產(chǎn)品）質(zhì)量檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)中心，河南 駐馬店 463000；2.杭州雙康飼料有限公司，浙江 杭州 310000）

飼料中黃曲霉毒素檢測(cè)方法研究進(jìn)展

劉利曉1，張 亮1，向艷娥1，黃志偉1，李洪波1，崔 佳2

（1.河南省駐馬店市獸藥飼料（動(dòng)物產(chǎn)品）質(zhì)量檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)中心，河南 駐馬店 463000；2.杭州雙康飼料有限公司，浙江 杭州 310000）

飼料在自然條件下污染的黃曲霉毒素主要包括B1、B2、G1、G24種，因?yàn)辄S曲霉毒素B1具有致癌性，飼料和糧食中一般以黃曲霉毒素B1作為黃曲霉毒素含量評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)，我國(guó)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB 13078-2001只對(duì)黃曲霉毒素B1限量進(jìn)行了規(guī)定。目前，對(duì)飼料黃曲霉毒素的檢測(cè)方法有膠體金法、薄層分析法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法，液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法等。主要對(duì)近年來(lái)飼料中黃曲霉毒素檢測(cè)方法研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，討論了各方法的優(yōu)、缺點(diǎn)，以期為限量要求下的方法選擇提供依據(jù)。

黃曲霉毒素；檢測(cè)方法；研究進(jìn)展

黃曲霉毒素是黃曲霉菌和寄生曲霉菌的次生代謝產(chǎn)物，是世界衛(wèi)生組織公認(rèn)的致癌物，是一種天然存在的、毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)，并具有致突變、致畸形和致癌作用。飼料在自然條件下污染的黃曲霉毒素主要包括 B1、B2、G1、G24 種， 因?yàn)辄S曲霉毒素B1的具有致癌性，飼料和糧食中一般以黃曲霉毒素B1作為黃曲霉毒素含量評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)。我國(guó)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB 13078-2001只針對(duì)污染范圍最廣、危害最大的黃曲霉毒素B1限量進(jìn)行了規(guī)定［1］。黃曲霉毒素的檢測(cè)方法要滿足相應(yīng)的限量要求，該文對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述，討論了各方法的優(yōu)、缺點(diǎn)，為限量要求下的方法選擇提供依據(jù)。

1 飼料中黃曲霉毒素限量要求

我國(guó)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的飼料、飼料添加劑中黃曲霉毒素B1的限量見表1。

2 現(xiàn)有黃曲霉毒素檢測(cè)方法比較

目前，我國(guó)飼料中黃曲霉毒素的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法主要包括膠體金法、薄層分析法（TLC）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）。

表1 飼料、飼料添加劑中黃曲霉毒素B1的限量標(biāo)準(zhǔn) μg/kg

2.1 膠體金法 該方法的原理是試樣中黃曲霉毒素B1在層析過(guò)程中與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制了抗體和硝酸纖維素膜檢測(cè)線上黃曲霉毒素B1-BSA偶聯(lián)物的免疫反應(yīng)，使檢測(cè)線變淺，通過(guò)檢測(cè)線顏色變化進(jìn)行測(cè)定［2］。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中該方法黃曲霉毒素B1的檢出限可以達(dá)到1 μg/kg，明顯低于國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)。王督等［3］采用膠體金免疫層析法快速定量分析糧油農(nóng)產(chǎn)品中（花生、玉米、大米、小麥）黃曲霉毒素B1，4種樣品檢測(cè)的線性范圍為1.0～20.0 μg/kg，方法定量限為 1.0 μg/kg，樣品加標(biāo)回收率為75%～106%，RSD＜20%。與免疫親和柱凈化-HPLC法相比，相對(duì)誤差＜15%，樣品檢測(cè)時(shí)間只需15 min。徐振斌等［4］建立了膠體金免疫層析法快速定量檢測(cè)玉米中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2總量的分析方法，最低檢測(cè)限和最低定量限分別為1.0 μg/kg和 3.0 μg/kg，方法簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于玉米中上述4種黃曲霉毒素總量的快速定量檢測(cè)。

膠體金免疫層析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)為簡(jiǎn)單、快速、成本低廉，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大規(guī)模樣品篩查。但其靈敏度低和不能定量的缺點(diǎn)，也使膠體金免疫層析技術(shù)在一些領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用受到限制。目前研究膠體金免疫層析方法與其他儀器結(jié)合，建立黃曲霉毒素B1快速檢測(cè)綜合體系將會(huì)是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。

2.2 薄層分析法 TLC法是傳統(tǒng)的檢測(cè)黃曲霉毒素B1最常用方法，也是我國(guó)測(cè)定飼料中黃曲霉毒素B1的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法之一［5］。該方法是經(jīng)典的化學(xué)分析方法，優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，分析成本低，較適合對(duì)黃曲霉毒素B1的定性檢測(cè)；其缺點(diǎn)是對(duì)檢測(cè)的規(guī)范和熟練程度要求高，準(zhǔn)確度較低，且重復(fù)性較差。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附法 利用ELISA檢測(cè)黃曲霉毒素的原理是毒素抗原抗體直接的競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，也是我國(guó)測(cè)定飼料中黃曲霉毒素B1的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法之一［6］。 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中該方法的檢出限為 0.2 μg/kg。 相比于薄層分析法，ELISA法靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，分析速度快，并且可以同時(shí)處理大批量樣品，但由于同類分子的相似性，ELISA法容易對(duì)結(jié)構(gòu)相似的其他黃曲霉毒素或化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生一定的交叉反應(yīng)，有可能帶來(lái)假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果，檢驗(yàn)精確度有待提高。李海礁等［7］通過(guò)對(duì)同一黃曲霉毒素陽(yáng)性玉米粉樣品分別采用HPLC和ELISA法進(jìn)行不同實(shí)驗(yàn)室間對(duì)比，得出在保證檢測(cè)結(jié)果一致的情況下，ELISA法同時(shí)具有檢測(cè)成本低、設(shè)備場(chǎng)所要求低、操作簡(jiǎn)便、快速并且可以同時(shí)進(jìn)行大量樣本測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)。李敏等［8］為提高黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫分析靈敏度，建立了基于異源策略的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析（IC-ELISA）方法，將該方法應(yīng)用于實(shí)際花生中黃曲霉毒素的檢測(cè)，同時(shí)，將結(jié)果與HPLC法結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，兩者有很高的符合度，并且，在保證特異性檢測(cè)黃曲霉毒素B1的條件下，比同源ELISA方法檢測(cè)靈敏度提高了81.25%，為進(jìn)一步建立農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1快速特異性檢測(cè)方法奠定了重要基礎(chǔ)。目前，通過(guò)優(yōu)化一系列試劑盒參數(shù)，研制高靈敏度黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫試劑盒的研究也在開展［9］。在實(shí)驗(yàn)檢測(cè)活動(dòng)中，ELISA法已經(jīng)被很多企業(yè)和檢測(cè)機(jī)構(gòu)所采用，作為陽(yáng)性樣品的初篩工具。

2.4 高效液相色譜法 HPLC法也是目前飼料中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的檢驗(yàn)國(guó)標(biāo)方法［10］。 該方法原理為試樣經(jīng)過(guò)甲醇—水提取后，提取液經(jīng)過(guò)濾、稀釋后，濾液經(jīng)過(guò)含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析柱層析凈化，經(jīng)高效液相色譜儀分離、熒光檢測(cè)器柱后光衍生測(cè)定黃曲霉毒素含量。該國(guó)標(biāo)方法采用柱后衍生方法，相比常用的三氟乙酸衍生法、碘衍生法、光化學(xué)衍生器不需要其他化學(xué)試劑，只是連接到色譜柱和檢測(cè)器之間，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，靈敏度高。黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的檢出限分別為 0.2、0.2、0.3、0.3 μg/kg。馮秋月等［11］建立了HPLC-免疫親和柱凈化，柱后光化學(xué)衍生檢測(cè)玉米中 4 種黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的分析方法，分析時(shí)間在6～11 min內(nèi)完成，檢測(cè)定量限分別為 0.10、0.03、0.10、0.03 μg/kg 。 完全符合并高于歐盟檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)定量，通過(guò)光化學(xué)檢測(cè)器在線衍生將黃曲霉毒素B1、G1的分析定量限提高到2.7倍和3.6倍。 玉米基質(zhì)中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2在添加水平為 10、3、10、3 μg/L 時(shí)其回收率分別為 90.3%、85.65%、93.5%、92.8%，其線性范圍分別為 0～20μg/L、0～6 μg/L、0～20 μg/L、0～6 μg/L，RSD 分別為 2.3%、1.5%、2.7%、3.2%。筆者所在檢驗(yàn)室按照國(guó)標(biāo)方法前處理樣品 （包括配合飼料、濃縮飼料和玉米、麩皮、豆粕、棉籽粕、玉米酒精糟等飼料原料），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：黃曲霉毒素濃度在0～50 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R達(dá)到0.999 99以上。與液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法相比，不同樣品基質(zhì)之間干擾不大，黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2回收率均能達(dá)到90%左右。

HPLC法的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定準(zhǔn)確、靈敏度高、凈化效果好、回收率高，可同時(shí)測(cè)定多種黃曲霉毒素成分，完成定性、定量測(cè)定。但缺點(diǎn)是免疫親和柱的價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本高，前處理復(fù)雜，檢驗(yàn)速度較慢，且需要在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)專業(yè)人員進(jìn)行檢測(cè)，不能滿足黃曲霉毒素現(xiàn)場(chǎng)篩查和質(zhì)量控制的需求。

2.5 液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法 我國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2071-2011規(guī)定了飼料中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素含量的液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。該方法原理為試樣中的黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素經(jīng)乙腈溶液提取，正己烷脫脂及霉菌毒素多功能凈化柱凈化后，氮?dú)獯蹈桑姿嵋译嫒芤鹤⒔?，采用色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜碎片及其離子豐度比定性，外標(biāo)法定量［12］。相比于HPLC法，該方法無(wú)需進(jìn)行柱前或柱后衍生處理，操作相對(duì)簡(jiǎn)捷，分析時(shí)間較短，且可以同時(shí)檢測(cè)黃曲霉素毒素和其他各類真菌毒素，降低檢測(cè)成本。

LC-MS/MS法具有比HPLC更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但在我國(guó)測(cè)定飼料黃曲霉毒素的方法標(biāo)準(zhǔn)中，靈敏度卻低于HPLC法。我國(guó)農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中 LC-MS/MS 法黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的檢出限均為1 μg/kg，高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)HPLC法的檢出限。而且LC-MS/MS法的基質(zhì)抑制效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果定量準(zhǔn)確性影響較大［13］。

筆者所在檢驗(yàn)室按照NY/T 2071-2011標(biāo)準(zhǔn)方法前處理樣品（包括配合飼料、濃縮飼料和玉米、麩皮、豆粕、棉籽粕、玉米酒精糟等飼料原料），質(zhì)控點(diǎn)選用2倍定量限，標(biāo)準(zhǔn)工作液外標(biāo)法單點(diǎn)校正，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同飼料樣品之間基質(zhì)干擾不同，不同飼料回收率差異較大。進(jìn)一步優(yōu)化前處理方法，降低基質(zhì)效應(yīng)、提高檢測(cè)靈敏度是LC-MS/MS法測(cè)定飼料中黃曲霉毒素所面對(duì)的首要問(wèn)題。王秀嬪等［14］建立了超聲提取—液相色譜—電噴霧三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜測(cè)定玉米、大米、大豆等糧油固體樣品中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的方法， 結(jié)果表明以黃曲霉毒素M1作為內(nèi)標(biāo)，可以有效地降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，相比于外標(biāo)法能極大地提高方法的準(zhǔn)確度。該方法為今后黃曲霉毒素的液相色譜—質(zhì)譜檢測(cè)提供了新的思路。

3 結(jié)論

隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，飼料黃曲霉毒素的檢測(cè)方法越來(lái)越多，檢測(cè)效率越來(lái)越高。由于各種單一方法的局限及不同方法的互補(bǔ)性，衍生出復(fù)合型的檢測(cè)方法，不僅綜合了不同方法的優(yōu)點(diǎn)，提高了檢測(cè)精度，而且通過(guò)互補(bǔ)使其靈敏度更高，特異性更強(qiáng)，前處理更加簡(jiǎn)單。在未來(lái)，一方面要推動(dòng)黃曲霉毒素向集成、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、智能化的快速檢測(cè)技術(shù)發(fā)展；另一方面，要大力發(fā)展技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)限低、定量結(jié)果準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高的先進(jìn)儀器技術(shù)，二者的相互結(jié)合使用，將是以后的發(fā)展趨勢(shì)。

［1］中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB 13078-2001，飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2001.

［2］中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.NY/T 2550-2014，飼料中黃曲霉毒素B1的測(cè)定膠體金法［S］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2014.

［3］王督，張文，李培武，等.膠體金免疫層析法快速定量分析糧油農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1［J］.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2014，36（4）：529-532.

［4］徐振斌，胡東青，里南，等.膠體金免疫層析法快速定量檢測(cè)玉米中黃曲霉毒素［J］.糧食科技與經(jīng)濟(jì)，2013，38（3）：24-26.

［5］中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 8381-2008，飼料中黃曲霉毒素B1的測(cè)定 半定量薄層色譜法［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

［6］中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 17480-2008，飼料中黃曲霉毒素B1的測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附法［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

［7］李海礁，喻東威，劉志楠，等.谷物中黃曲霉毒素B1檢測(cè)方法的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2013，34（21）：83-85.

［8］李敏，馬飛，李培武，等.基于異源策略的黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫（ELISA）分析方法的建立［J］.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2014，36（6）：802-807.

［9］孫清，李谷豐，鄧乾民，等.高靈敏度黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫試劑盒的研制及應(yīng)用 ［J］.環(huán)境化學(xué)，2015，34（10）：1845-1853.

［10］國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 30955-2014， 飼料中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的測(cè)定 免疫親和柱凈化—高效液相色譜法［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

［11］馮秋月，劉瀅，劉媛媛，等.光化學(xué)衍生檢測(cè)玉米中4種黃曲霉毒素［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2015，33（5）：69-73.

［12］中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.NY/T 2071-2011，飼料中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的測(cè)定液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

［13］王少敏，許勇，毛丹，等.HPLC-MS/MS法測(cè)定中藥桃仁中黃曲霉毒素 G2、G1、B2、B1［J］.藥物分析雜志，2011，31（5）：907-911.

［14］王秀嬪，李培武，楊揚(yáng)，等.液相色譜—三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜測(cè)定糧油中的黃曲霉毒素 ［J］.色譜，2011（6）：517-522.

S816.17

A文章順序編號(hào)：1672-5190（2016）03-0033-03

2016－03－01

劉利曉（1982—），女，畜牧師，碩士，主要從事獸藥、飼料與畜產(chǎn)品檢測(cè)工作。

（責(zé)任編輯：錢英紅）