韓 雪，粟朝芝，李 亮，陶宇航

（貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550005）

利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析長(zhǎng)順綠殼蛋雞的遺傳多樣性

韓 雪，粟朝芝，李 亮，陶宇航

（貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550005）

利用8對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)長(zhǎng)順綠殼蛋雞遺傳多樣性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，該群體的平均有效等位基因數(shù)為3.585 6個(gè)，平均多態(tài)信息含量為0.659 7，平均期望雜合度為0.713 1，平均基因雜合度為0.710 2，表明長(zhǎng)順綠殼蛋雞群體遺傳變異較大，遺傳多樣性較為豐富。研究結(jié)果為長(zhǎng)順綠殼蛋雞品種資源合理保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

長(zhǎng)順綠殼蛋雞；微衛(wèi)星；遺傳多樣性

我國(guó)地方雞種資源豐富，許多的地方雞種具有國(guó)外雞種所不及的優(yōu)良性狀。如何節(jié)約種質(zhì)資源的管理費(fèi)用、優(yōu)化保種效率是開(kāi)展地方雞種保存工作面臨的一個(gè)重大挑戰(zhàn)［1］。長(zhǎng)順綠殼蛋雞產(chǎn)于貴州省長(zhǎng)順縣鼓揚(yáng)鎮(zhèn)，2009年長(zhǎng)順綠殼蛋雞被錄入國(guó)家畜禽遺傳資源新品種名單，正式成為國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)品種。微衛(wèi)星是以少數(shù)幾個(gè)核苷酸（一般為1～6個(gè)）為單位、多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，具有數(shù)量大、分布廣、多態(tài)信息含量高、檢測(cè)快速方便等優(yōu)點(diǎn)，在品種遺傳多樣性、品種間遺傳距離及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)等研究中顯示出很大的優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于畜禽品種遺傳結(jié)構(gòu)的研究中［2-3］。筆者利用8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)長(zhǎng)順綠殼蛋雞遺傳多樣性進(jìn)行研究，以期為長(zhǎng)順綠殼蛋雞品種資源合理保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 從貴州省長(zhǎng)順縣鼓揚(yáng)鎮(zhèn)4個(gè)村16個(gè)養(yǎng)殖戶的雞群中隨機(jī)選取長(zhǎng)順綠殼蛋雞，共244個(gè)樣本，以血液為研究材料，翅靜脈采血0.4~1.0 mL/只，利用EDTA抗凝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 微衛(wèi)星多態(tài)性DNA的檢測(cè)方法

1.2.1 基因組DNA的提?。翰捎帽本┨旄萍加邢薰旧a(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒提取血樣中的DNA。

1.2.2 引物的選擇與合成：在雞的常染色體上選出多態(tài)性較好、重復(fù)性高且相互之間不連鎖的微衛(wèi)星引物共 8對(duì)［4］（見(jiàn)表 1），由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物的檢測(cè)：PCR反應(yīng)在20 μL體系中進(jìn)行：2×Taq PCR Mastermix（北京天根生化科技有限公司）7 μL，模板 DNA 1 μL，上游引物和下游引物（10 μmol/L）各 1 μL， 最后加 ddH2O 至 20 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，56.0~59.5℃退火 45 s （因引物而異），72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8 min，4℃保存。

1.2.4 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：將PCR產(chǎn)物在10%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，穩(wěn)壓150~180 V，電泳6~8 h，電泳結(jié)束后進(jìn)行固定、硝酸銀染色、顯影等，然后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用Gel-PRO ANALYZER凝膠定量分析軟件分析膠圖，利用Excel軟件計(jì)算等位基因頻率，應(yīng)用Dispan軟件計(jì)算有效等位基因數(shù)（Ne）、多態(tài)信息含量（PIC）、期望雜合度（Exp_Het）、平均基因雜合度（Ave_Het）等。

表1 微衛(wèi)星位點(diǎn)、引物及退火溫度

表2 8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因分布及頻率

表3 群體有效等位基因數(shù)、雜合度和多態(tài)信息含量

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性 由表2可知，在長(zhǎng)順綠殼蛋雞中，8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測(cè)出38個(gè)等位基因，等位基因數(shù)最多的座位是ADL183和ADL176，均為6個(gè)，等位基因數(shù)最少的座位是ADL101，為3個(gè)，其他座位分別有4~5個(gè)等位基因。

2.2 遺傳多態(tài)性分析 由表3可知，群體平均期望純合度為0.286 9，平均期望雜合度為0.713 1，8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的平均期望雜合度均高于平均期望純合度，說(shuō)明長(zhǎng)順綠殼蛋雞品種在大部分基因位點(diǎn)上表現(xiàn)為雜合子個(gè)體。8個(gè)微衛(wèi)星座位的平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.659 7。8個(gè)座位的PIC＞0.5，所有位點(diǎn)均為高度多態(tài)，說(shuō)明該群體遺傳變異較大，遺傳多樣性較為豐富。

3 討論

Barker 等［5］和 Hayashi等［6］在全球家畜品種間遺傳距離測(cè)定草案的建議中提出了微衛(wèi)星標(biāo)記的原則標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)至少有4個(gè)等位基因方能較好地用于遺傳多樣性等遺傳特性的評(píng)估。該試驗(yàn)選擇的8個(gè)微衛(wèi)星座位共檢測(cè)到38個(gè)等位基因，等位基因的頻率大小在0.036 9~0.381 1，8個(gè)微衛(wèi)星座位除ADL101座位少于4以外，其他座位的等位基因數(shù)在4~6，符合該標(biāo)準(zhǔn)，因此能夠有效地分析該品種的遺傳變異。

多態(tài)信息含量（PIC）是衡量基因變異程度高低的評(píng)價(jià)指標(biāo)［7］，當(dāng)PIC>0.5時(shí)表明該基因座為高度多態(tài)性；當(dāng)0.250.5，說(shuō)明長(zhǎng)順綠殼蛋雞群體呈現(xiàn)出較豐富的遺傳多樣性，具有一定的選擇潛力。

基因雜合度也稱為基因多樣度，一般認(rèn)為它是度量群體遺傳變異的一個(gè)最適參數(shù)，平均基因雜合度大小可以近似地反映群體遺傳結(jié)構(gòu)變異程度的高低，基因雜合度越大，說(shuō)明群體的遺傳變異性越大［9］。Jurg［10］將多態(tài)位點(diǎn)定義為雜合度至少為 0.10的位點(diǎn)。該研究中長(zhǎng)順綠殼蛋雞8個(gè)微衛(wèi)星座位的等位基因數(shù)為3~6個(gè)，平均有效等位基因數(shù)為3.585 6，雜合度期望值在0.585 3~0.789 4，平均基因雜合度為0.710 2，都大于0.10，屬于多態(tài)性位點(diǎn)，但與其他研究［11-14］相比雜合度的平均值較高，提示長(zhǎng)順綠殼蛋雞有著較豐富的遺傳多樣性，同時(shí)也揭示長(zhǎng)順綠殼蛋雞遺傳一致性較差。

遺傳多樣性一般指品種內(nèi)個(gè)體在DNA水平上的千差萬(wàn)別［15］。對(duì)群體遺傳多樣性進(jìn)行研究，可以了解品種的遺傳結(jié)構(gòu)和生活背景等情況，并以此分析某品種的進(jìn)化歷史和遺傳潛力，以及時(shí)判斷品種是否瀕危，提出合理的保種措施。位點(diǎn)多態(tài)信息含量、基因雜合度和有效等位基因數(shù)是反映某個(gè)群體遺傳多樣性的合適參數(shù)。該研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)順綠殼蛋雞群體的平均有效等位基因數(shù)為3.585 6個(gè)，平均多態(tài)信息含量為0.659 7，平均期望雜合度為0.713 1，平均基因雜合度為0.710 2，表明長(zhǎng)順綠殼蛋雞群體的遺傳多樣性較豐富。當(dāng)?shù)厝嗣耠m然對(duì)長(zhǎng)順綠殼蛋雞品種進(jìn)行了不同程度的人工選育，但雞種群體內(nèi)所承受的選擇壓力相對(duì)較小，尚需進(jìn)一步純繁選育，以提高群體的生產(chǎn)性能和整齊度。在今后工作中，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該雞種資源的保護(hù)和利用，建立長(zhǎng)順綠殼蛋雞的保種核心群，防止外來(lái)雞種的侵入，擴(kuò)大群體數(shù)量，避免近交，多方面采取有效措施來(lái)保護(hù)這一優(yōu)良的珍貴地方雞種資源。

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Analysis of Genetic Diversity of Changshun Blue-eggshell Chicken based on Microsatellite Marker

HAN Xue，SU Chao-zhi，LI Liang，TAO Yu-hang
（Guizhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Guiyang 550005，China）

Eight pairs of microsatellite primers were used to detect genetic diversity of Changshun blue-eggshell chicken.The results show that the average effective number of alleles,average polymorphism information content,average expected heterozygosity,and average gene heterogeneity in the population were 3.585 6,0.659 7,0.713 1,and 0.710 2 respectively,indicating that the population of Changshun blue-eggshell chicken has great genetic variation and rich genetic diversity.The results can provide scientific references for rational protection,development and utilization of Changshun blue-eggshell chicken.

Changshun blue-eggshell chicken；microsatellite；genetic diversity

S831.2

A文章順序編號(hào)1672-5190（2016）11-0001-03

2016－09－10

項(xiàng)目來(lái)源：貴州省科學(xué)技術(shù)基金：黔科合J字［2011］2174；貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生創(chuàng)新基金：黔農(nóng)科合（創(chuàng)新基金）2010011；貴州省動(dòng)植物育種專項(xiàng)：黔農(nóng)育專字［2011］027。

韓雪（1982—），女，助理研究員，碩士，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種。

陶宇航（1961—），男，副研究員，主要研究方向?yàn)榧仪蒺B(yǎng)殖。

（責(zé)任編輯：趙俊利）