李耀輝　馮達(dá)天　胡驍軼　王　杭　王國民

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科　上海　200032)

?

VEGF/PDGF相關(guān)因子在晚期腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)與舒尼替尼遠(yuǎn)期療效的相關(guān)性

李耀輝馮達(dá)天胡驍軼△王杭王國民

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科上海200032)

目的觀察晚期腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血小板衍化生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)相關(guān)因子的表達(dá),并分析其表達(dá)量與舒尼替尼遠(yuǎn)期療效的相關(guān)性。方法選取2010年1月—12月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院收治的轉(zhuǎn)移性晚期腎癌患者20例。所有患者均予患腎根治性切除術(shù),病理證實均為ccRCC。所有患者術(shù)后均予舒尼替尼標(biāo)準(zhǔn)給藥方案治療,50 mg每天1次口服,服藥4周、停藥2周為1個療程,每6周隨訪1次,隨訪至2015年12月底。免疫組化方法檢測入組患者病理標(biāo)本腫瘤組織中VEGF-A、VEGF-C、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGF和PDGFR-α、β的表達(dá)水平,計算腫瘤微血管密度(microvessel density,MVD),并與靶向治療遠(yuǎn)期療效進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果截至研究終點日期,所有患者均未出現(xiàn)因不能控制的嚴(yán)重不良反應(yīng)而停藥的情況,存活4人,死亡16人,死亡患者均因腫瘤進(jìn)展導(dǎo)致。Spearman分析顯示VEGFR-2高表達(dá)與較長的無進(jìn)展生存時間(progression free survival,PFS)及總生存時間(overall survival,OS)存在顯著相關(guān),單因素Cox生存回歸分析中VEGFR-2強(qiáng)陽性與腫瘤進(jìn)展風(fēng)險降低(OR=0.162,95%CI:0.031～0.839,P=0.030)及死亡風(fēng)險降低(OR=0.204,95%CI:0.041～1.015,P=0.052)具有較為顯著的相關(guān)性。結(jié)論接受舒尼替尼治療的晚期ccRCC患者中,VEGFR-2高表達(dá)與較長的PFS及OS存在顯著相關(guān),VEGFR-2強(qiáng)陽性與腫瘤進(jìn)展風(fēng)險降低及死亡風(fēng)險降低顯著相關(guān),提示VEGFR-2有可能成為晚期腎癌靶向治療的遠(yuǎn)期療效預(yù)測因子。

腎癌;轉(zhuǎn)移;舒尼替尼;血管內(nèi)皮生長因子;血小板衍化生長因子

腎細(xì)胞癌已經(jīng)成為泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤之一,嚴(yán)重危害著人類生命健康。近10年來,靶向治療藥物的出現(xiàn)使得晚期轉(zhuǎn)移性腎癌的治療出現(xiàn)了令人鼓舞的改變[1]。它們以血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血小板衍化生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)為主要靶標(biāo),代表藥物有舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)等,其對晚期轉(zhuǎn)移性腎癌的療效明顯優(yōu)于干擾素[2-3]。而臨床上更多的現(xiàn)實情況是,患者使用靶向治療藥物后在短期內(nèi)腫瘤得到一定控制,但由于腫瘤繼發(fā)性耐藥以及腎毒性的出現(xiàn),其遠(yuǎn)期生存仍然不甚理想[4]。因此,尋找晚期腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)對分子靶向藥物治療遠(yuǎn)期療效的預(yù)測因子,有重要的臨床意義。VEGF及PDGF可激活相應(yīng)受體從而激活下游信號分子產(chǎn)生一系列生物效應(yīng),誘導(dǎo)腫瘤新生血管生成,直接或間接地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。舒尼替尼即以VEGF及PDGF為靶標(biāo),故VEGF及PDGF可能是潛在的靶向藥物治療遠(yuǎn)期療效的預(yù)測因子。

本研究回顧性分析2010年1月—12月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院收治的晚期腎癌患者20例,檢測其病理標(biāo)本中腫瘤組織內(nèi)VEGF和PDGF相關(guān)因子的表達(dá)水平,并與長期隨訪結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析,旨在為晚期ccRCC的分子靶向藥物治療尋找合適的遠(yuǎn)期療效預(yù)測因子。

資 料 和 方 法

研究對象和給藥方案在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院腎癌數(shù)據(jù)庫中選取2010年1月—12月收治的晚期腎癌患者(Ⅳ期)20例(2010AJCC分期標(biāo)準(zhǔn))。納入標(biāo)準(zhǔn):在本院手術(shù)并可獲取病理標(biāo)本;病理證實為ccRCC;至少有1處不可切除且可測量的轉(zhuǎn)移病灶;在本院進(jìn)行舒尼替尼靶向治療并接受長期隨訪;均未接受其他抗腫瘤全身性系統(tǒng)治療。入組結(jié)果:男性14例,女性6例,中位年齡55歲;所有患者均接受患腎根治性切除手術(shù),術(shù)后病理均證實為ccRCC;MSKCC(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)評分均為低中危;所有患者術(shù)后予舒尼替尼治療,每6周(1個用藥周期)隨訪1次至2015年12月底隨訪期滿。其中每個周期進(jìn)行1次安全性評價,每2個周期進(jìn)行1次有效性評價。舒尼替尼給藥方案為標(biāo)準(zhǔn)的4/2方案[5],50 mg每日1次口服,服藥4周后停藥2周為1個周期。如出現(xiàn)不良反應(yīng)酌情減量(最高可減至25 mg)或停藥,服藥起始時間一般為術(shù)后2～4周,按以上方案給藥至腫瘤進(jìn)展或出現(xiàn)難以控制的嚴(yán)重不良反應(yīng)。隨訪觀察的時間為2011年1月至2015年12月,隨訪終點為患者死亡或失訪。

療效和評價標(biāo)準(zhǔn) 有效性評價采用實體腫瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)(response evaluation criteria in solid tumors 1.1,RECIST 1.1)評估療效[6]。安全性評價則主要觀察患者的不良反應(yīng),不良反應(yīng)分級按照國際不良反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)(National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events,version 4.0,NCI-CTC 4.0)進(jìn)行分級[7]。隨訪終點的主要觀察指標(biāo)為無進(jìn)展生存期(progression free survival,PFS)及總生存期(overall survival,OS)。

免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)手術(shù)切除的腫瘤組織標(biāo)本按常規(guī)方法進(jìn)行免疫組化染色。相關(guān)指標(biāo)包括VEGF、VEGFC、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGF、PDGFR-α、PDGFR-β及腫瘤微血管密度(microvessel density,MVD)。染色完成后,用奧林巴斯DP72相機(jī)在相同曝光條件下拍照,在高倍視野下,每份標(biāo)本隨機(jī)取5個視野拍攝并保存照片,像素為4 140×3 096。所獲得的圖片用Image Pro Plus 6.0(美國Media Cybernetics公司)軟件進(jìn)行分析,設(shè)置濾過尺寸50像素,根據(jù)圖片設(shè)置適當(dāng)?shù)腍SI參數(shù),宏操作自動分析圖片,獲得累積光密度值(IOD),為方便計算,定義相對強(qiáng)度=50×IOD/4140/3096。MVD計算:每張照片人工計數(shù)血管數(shù)目。

結(jié)　　　果

腎細(xì)胞癌組織的免疫組化檢測結(jié)果紅色為細(xì)胞質(zhì),藍(lán)色為細(xì)胞核,VEGF及VEGFR顯示為棕色顆粒著色,在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中均有定位(圖1)。PDGF及PDGFR呈棕色顯色,亦見于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì),CD34陽性定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),呈棕色(圖2)。VEGF相關(guān)指標(biāo)中，以VEGFR-2的強(qiáng)度最高(2.81±1.36);PDGF相關(guān)指標(biāo)中，則PDGFR-2的強(qiáng)度最高(3.33±1.56),平均微血管密度為23.86±11.39(表1)。

腎細(xì)胞癌標(biāo)本各免疫組化指標(biāo)表達(dá)與PFS和OS相關(guān)性分析截止隨訪期滿之日,本組患者無一例失訪,且均未出現(xiàn)因不能控制的不良反應(yīng)而停藥的情況,但已經(jīng)有16名患者死亡,故本研究中可以對其PFS及OS進(jìn)行評價。中位隨訪時間為31(7～66)個月。

在PFS、OS與各免疫組化指標(biāo)的相關(guān)分析中,VEGFR-2顯示與PFS(r=0.631,P=0.003)及OS(r=0.477,P=0.033)顯著相關(guān)(圖3),而血管MVD與PFS(r=0.405,P=0.095)、OS(r=0.421,P=0.082)之間雖具有一定的相關(guān)趨勢,但未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著性。

根據(jù)文獻(xiàn)提供的研究方法,把各免疫組化相對強(qiáng)度,以陰性(25%)、弱陽性(50%)、強(qiáng)陽性(25%)的比例進(jìn)行劃分[8],據(jù)此進(jìn)行Kaplan-Meier生存回歸及Cox生存回歸分析。在Kaplan-Meier生存回歸中,PFS(P=0.042)及OS(P=0.021)在VEGFR-2各組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (圖4)。OS在MVD各組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.049),但PFS在MVD各組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.061,圖5)。

表1　ccRCC組織免疫組化結(jié)果(相對強(qiáng)度)

在Cox生存回歸分析中,根據(jù)之前的免疫組化強(qiáng)度分組,以各指標(biāo)的陰性樣本為參考值,先對各免疫組化指標(biāo)進(jìn)行單變量Cox回歸分析,其中P<0.1者進(jìn)入多變量回歸分析,結(jié)果以O(shè)R值及其95%CI表示。在單變量Cox回歸分析中,VEGFR-2強(qiáng)陽性表現(xiàn)出與腫瘤進(jìn)展風(fēng)險降低具有顯著的相關(guān)性(OR=0.162,95%CI:0.031～0.839,P=0.030),VEGFR-2弱陽性與腫瘤進(jìn)展風(fēng)險降低雖未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義,但具有明顯的相關(guān)趨勢(OR=0.330,95%CI:0.102～1.067,P=0.064)。而MVD弱陽性與腫瘤進(jìn)展風(fēng)險降低也具有相關(guān)趨勢,但未達(dá)到顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(OR=0.379,95%CI:0.124～1.159,P=0.089)。多變量Cox回歸分析則顯示相較于VEGFR-2強(qiáng)陽性(OR=0.150, 95%CI:0.017～1.327,P=0.088)及MVD(OR=0.378,95%CI:0.125～1.145,P=0.085),VEGFR-2弱陽性與腫瘤進(jìn)展風(fēng)險降低相關(guān)性更加顯著(OR=0.298, 95%CI:0.088～1.010,P=0.052)。在針對OS的單因素Cox回歸分析中,VEGFR-2強(qiáng)陽性(OR=0.204,95%CI:0.041～1.015,P=0.052),VEGFR-2弱陽性(OR=0.348, 95%CI:0.102～1.185,P=0.091)及MVD(OR=0.360,95%CI:0.118～1.096,P=0.072)表現(xiàn)出與死亡風(fēng)險降低具有相關(guān)趨勢,但未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著性(圖6)。多變量Cox回歸分析則顯示VEGFR-2強(qiáng)陽性(OR=0.215,95%CI:0.026～1.806,P=0.157)、VEGFR-2弱陽性(OR=0.355, 95%CI:0.101～1.252,P=0.107)、MVD(OR=0.385, 95%CI:0.127～1.170,P=0.092)雖與死亡風(fēng)險降低具有相關(guān)趨勢,但均未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著性。

隨著科技的進(jìn)步,小分子靶向藥物治療包括腎癌在內(nèi)的許多惡性腫瘤已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床并取得了良好的效果[9]。雖然國內(nèi)外均有研究表明,舒尼替尼對于晚期腎癌的控制具有顯著效果[2-3,10],但在臨床實踐過程中,也會發(fā)生原發(fā)性和繼發(fā)性耐藥[11]。對于晚期腎癌,PDGF及VEGF均與VHL基因密切相關(guān),這兩種生長因子通過與其受體的結(jié)合,啟動下游信號通路導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管生長,并促進(jìn)腫瘤的增長及浸潤[12]。根據(jù)既往的研究及藥理學(xué)原理,腫瘤細(xì)胞內(nèi)VEGF及PDGF及其受體等相關(guān)分子的表達(dá)可能與靶向治療的療效有一定相關(guān)性[13]。

在舒尼替尼的擴(kuò)大臨床試驗中,其意向分析人群的中位OS達(dá)到了28.1個月[ 14]。因此,對舒尼替尼遠(yuǎn)期療效的觀察,尤其是對長期生存的觀察,需要足夠長的隨訪時間。本研究中的隨訪觀察時間長達(dá)5年,完全符合觀察遠(yuǎn)期療效的要求。

在免疫組化結(jié)果與隨訪結(jié)果的相關(guān)性分析中,我們發(fā)現(xiàn),在晚期腎透明細(xì)胞癌患者中,腫瘤內(nèi)VEGFR-2與PFS和OS存在顯著相關(guān),而血管MVD與PFS和OS也存在一定的相關(guān)性,但未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義?？偟膩碚f,VEGFR及PDGFR表達(dá)水平越高,腫瘤血管更加豐富,腫瘤生長也更快、侵襲性更強(qiáng),舒尼替尼等小分子靶向藥物治療的效果也將越好,即PFS及OS越長,這也驗證了我們之前的假設(shè)。隨后,我們根據(jù)測量結(jié)果,按照一定方法把患者根據(jù)各指標(biāo)表達(dá)強(qiáng)弱,分為陰性、弱陽性及強(qiáng)陽性三組,比較其PFS與OS的差異,發(fā)現(xiàn)VEGFR-2在PFS比較上具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。

在單變量Cox回歸分析中,VEGFR-2強(qiáng)陽性顯示與腫瘤進(jìn)展風(fēng)險降低及死亡風(fēng)險降低的顯著相關(guān),即VEGFR-2表達(dá)強(qiáng)度越高,腫瘤進(jìn)展及死亡的風(fēng)險越低。但是在之后的多變量Cox回歸分析中,其相關(guān)的顯著性出現(xiàn)了較明顯的下降,原因可能是在多變量回歸分析中,由于血管MVD這一變量的引入,導(dǎo)致其與VEGFR-2產(chǎn)生相互影響進(jìn)而降低統(tǒng)計學(xué)的顯著性。

在本研究中,我們通過長期的臨床隨訪,初步探討了血管相關(guān)因子在腫瘤標(biāo)本中的表達(dá)與靶向治療遠(yuǎn)期療效之間的關(guān)系。結(jié)果提示:VEGFR-2及血管MVD等VHL基因相關(guān)指標(biāo)的高表達(dá)與較長的PFS及OS存在較為顯著的相關(guān)性,特別是VEGFR-2在生存回歸中顯示出了與PFS與OS的顯著相關(guān)性。PDGF相關(guān)因子表達(dá)與舒尼替尼遠(yuǎn)期療效無顯著相關(guān)性,這和先前的某些研究結(jié)果類似,提示腫瘤靶向治療的相關(guān)因素非常復(fù)雜。因此,臨床選擇小分子靶向藥物治療患者時,可以根據(jù)其腫瘤組織中相關(guān)基因表達(dá)的情況進(jìn)行篩選,當(dāng)然這僅是決策依據(jù)之一。這方面已經(jīng)有越來越多的分子標(biāo)記被提出并驗證[15-19]。

VEGFR-2等VHL基因相關(guān)指標(biāo)的高表達(dá)與較長的PFS及OS存在相關(guān)性,其中尤以VEGFR2的意義更大。在小分子靶向藥物治療腎細(xì)胞癌的臨床實踐中,這有可能成為其遠(yuǎn)期療效的預(yù)測因子,但需要更大樣本的前瞻性研究驗證。

[1]KAPOOR A,GHARAJEH A,SHEIKH A,etal.Adjuvant and neoadjuvant small-molecule targeted therapy in high-risk renal cell carcinoma[J].CurrOncol,2009,16(Suppl 1):S60-S66.

[2]MOTZER RJ,HUTSON TE,TOMCZAK P,etal.Sunitinib versus interferon alfa in metastatic renal-cell carcinoma[J].NEnglJMed,2007,356(2):115-124.

[3]MOTZER RJ,HUTSON TE,TOMCZAK P,etal.Overall survival and updated results for sunitinib compared with interferon alfa in patients with metastatic renal cell carcinoma[J].JClinOncol,2009,27(22):3584-3590.

[4]CZARNECKA AM,KAWECKI M,LIAN F,etal.Feasibility,efficacy and safety of tyrosine kinase inhibitor treatment in hemodialyzed patients with renal cell cancer:10 years of experience[J].FutureOncol,2015,11(16):2267-2282.

[5]FAIVRE S,DELBALDO C,VERA K,etal.Safety,pharmacokinetic,and antitumor activity of SU11248,a novel oral multitarget tyrosine kinase inhibitor,in patients with cancer[J].JClinOncol,2006,24(1):25-35.

[6]EISENHAUER EA,THERASSE P,BOGAERTS J,etal.New response evaluation criteria in solid tumours:revised RECIST guideline (version 1.1)[J].EurJCancer,2009,45(2):228-247.

[7]CHEN AP,SETSER A,ANADKAT MJ,etal.Grading dermatologic adverse events of cancer treatments:the Common Terminology Criteria for Adverse Events Version 4.0[J].JAmAcadDermatol,2012,67(5):1025-1039.

[8]SHI H,HAYES M,KIRANA C,etal.TUFM is a potential new prognostic indicator for colorectal carcinoma[J].Pathology,2012,44(6):506-512.

[9]KIM S,DING W,ZHANG L,etal.Clinical response to sunitinib as a multitargeted tyrosine-kinase inhibitor (TKI) in solid cancers:a review of clinical trials[J].OncoTargetsTher,2014(7):719-728.

[10]胡驍軼,王國民,郭劍明,等.舒尼替尼治療轉(zhuǎn)移性腎癌的初步評價[J].中華泌尿外科雜志,2010,31(5):300-303.

[11]GIULIANO S,CORMERAIS Y,DUFIES M,etal.Resistance to sunitinib in renal clear cell carcinoma results from sequestration in lysosomes and inhibition of the autophagic flux[J].Autophagy,2015,11(10):1891-1904.

[12]BALDEWIJNS MM,VAN VLODROP IJ,VERMEULEN PB,etal.VHL and HIF signalling in renal cell carcinogenesis[J].JPathol,2010,221(2):125-138.

[13]DORNBUSCH J,ZACHARIS A,MEINHARDT M,etal.Analyses of potential predictive markers and survival data for a response to sunitinib in patients with metastatic renal cell carcinoma[J].PLoSOne,2013,8(9):e76386.

[14]TERAKAWA T,MIYAKE H,KUSUDA Y,etal.Expression level of vascular endothelial growth factor receptor-2 in radical nephrectomy specimens as a prognostic predictor in patients with metastatic renal cell carcinoma treated with sunitinib[J].UrolOncol,2013,31(4):493-498.

[15]RINI BI,COHEN DP,LU DR,etal.Hypertension as a biomarker of efficacy in patients with metastatic renal cell carcinoma treated with sunitinib[J].JNatlCancerInst,2011,103(9):763-773.

[16]LAIRD A,O′MAHONY FC,NANDA J,etal.Differential expression of prognostic proteomic markers in primary tumour,venous tumour thrombus and metastatic renal cell cancer tissue and correlation with patient outcome[J].PLoSOne,2013,8(4):e60483.

[17]MOTZER RJ,HUTSON TE,HUDES GR,etal.Investigation of novel circulating proteins,germ line single-nucleotide polymorphisms,and molecular tumor markers as potential efficacy biomarkers of first-line sunitinib therapy for advanced renal cell carcinoma[J].CancerChemotherPharmacol,2014,74(4):739-750.

[18]NEARCHOU A,VALACHIS A,LIND P,etal.Acquired Hypothyroidism as a predictive marker of outcome in patients with metastatic renal cell carcinoma treated with tyrosine kinase inhibitors:A literature-based meta-analysis[J].ClinGenitourinCancer,2015,13(4):280-286.

[19]ZHENG WX,YAN F,XUE Q,etal.Heme oxygenase-1 is a predictive biomarker for therapeutic targeting of advanced clear cell renal cell carcinoma treated with sorafenib or sunitinib[J].OncoTargetsTher,2015,8:2081-2088.

E-mail:hu.xiaoyi@zs-hospital.sh.cn

The relationship between VEGF/PDGF expression and prospective efficacy of sunitinib in metastatic renal cell carcinoma

LI Yao-hui, FENG Da-tian, HU Xiao-yi△, WANG Hang, WANG Guo-min

(DepartmentofUrology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

ObjectiveTo explore the expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and platelet-derived growth factor(PDGF),and their relationship with prospective efficacy of tyrosine kinase inhibitor sunitinib in metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC).MethodsTwenty patients with histologically proven metastatic ccRCC were selected between Jan., 2010 and Dec., 2010.All patients underwent radical nephrectomy and then were followed up to Dec.,2015.All patients received a standard regimen of sunitinib (a dose of 50 mg given orally once daily for 4 weeks on and 2 weeks off,6 weeks per cycle).Tissue microarrays from primary tumor specimens of all patients were

kidney neoplasm;metastasis;sunitinib;vascular endothelial growth factor;platelet-derived growth factor

R737.11

Adoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.04.006

2016-01-10;編輯:王蔚)

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青年科研啟動基金(ZH2010-385)

immunohistochemically stained for selected markers,including PDGF,PDGFR-α,β,VEGF-A,VEGF-C and VEGFR-2,3.And the results of immunohistochemistry (IHC) and microvessel density(MVD) were compared with patients′ survival.ResultsTo the date of statistical analysis,16 patients died of tumour progression.High expression of VEGFR-2 was significantly correlated with the longer progression free survival (PFS) and overall survival (OS) in Spearman correlation analysis.Cox regression analysis revealed that a strong positive of VEGFR-2 was significantly associated with both lower risk of tumor progressing(OR=0.162,95%CI:0.031-0.839,P=0.030) and lower mortality risk(OR=0.204,95%CI:0.041-1.015,P=0.052).ConclusionsFor ccRCC patients who treated with sunitinib,high expression of VEGFR-2 was significantly correlated with the longer PFS and OS,while a strong positive of VEGFR-2 was significantly associated with both lower risk of tumor progressing and lower mortality risk.VEGFR-2 could be a predictive factor for making a clinical decision in RCC targeted therapy.

*This work was supported by Youth Scientific Research Project of Zhongshan Hospital,Fudan University(ZH2010-385).