吳楓王行明

（1.中國人民解放軍疾病預(yù)防控制所 北京 100071；2.中南大學(xué)生殖與干細胞研究所 湖南長沙 410078）

小鼠睪丸不同階段生精上皮細胞的發(fā)育形態(tài)學(xué)研究

吳楓1*王行明2

（1.中國人民解放軍疾病預(yù)防控制所 北京 100071；2.中南大學(xué)生殖與干細胞研究所 湖南長沙 410078）

目的：研究小鼠生精上皮各類細胞發(fā)育過程中形體學(xué)特征以及異常發(fā)育的生精細胞形態(tài) 方法： PAS染色正常成年小鼠睪丸，通過光學(xué)顯微鏡觀察每種上皮細胞的形態(tài)學(xué)特征。結(jié)果：小鼠生精上皮分為Stage I-XII不同階段，在精子細胞分化、分裂的同時呈現(xiàn)出動態(tài)變化，生精上皮中的精子細胞包括精原細胞、減數(shù)分裂間期細胞（L、Z、P、D）、次級精母細胞、圓形精子細胞、長形精子細胞。每種細胞都具有明顯形態(tài)學(xué)特征。結(jié)論：根據(jù)生精上皮細胞的形態(tài)特征可以判斷小鼠不同類型精子發(fā)育是否正常，對于利用小鼠動物模型來研究生殖系統(tǒng)功能的研究有重要意義。

生精上皮 PAS染色 形態(tài)特征

精子細胞是由睪丸內(nèi)原始生精細胞連續(xù)的有絲分裂和兩次減數(shù)分裂而成,接著精子細胞發(fā)生形態(tài)學(xué)的變化最終形成成熟的精子。精子發(fā)生過程中生精上皮細胞的形態(tài)不斷發(fā)生變化,通過顯微鏡觀察睪丸組織某個特定發(fā)育階段的生精上皮可以發(fā)現(xiàn)含有不同類型的生精細胞。其中原始精原細胞分布在靠近基底膜（basal compartment）的遠腔端,而減數(shù)分裂細胞、減數(shù)分裂后期細胞分布隨著發(fā)育的進度越來越靠近生精上皮的近腔端（adluminal compartment）［1］。本文以小鼠生精上皮作為研究對象,通過不同的形態(tài)學(xué)特征可以將其分為12個階段,每個階段的生精細胞都具有典型的形態(tài)性特征。通過bouin氏固定液固定睪丸組織能夠清楚的觀察核內(nèi)染色體的形態(tài)特征,而通過PAS（過碘酸雪夫氏染色）可以標(biāo)記發(fā)育過程中的頂體,能夠區(qū)分每個階段的生精上皮中的圓形精子細胞。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用的成年C57BL/6實驗小鼠購自賽業(yè)生物科技有限公司。體重35g-50g,全部為正常雄性野生型小鼠。

1.2 方法

主要儀器和試劑光學(xué)顯微鏡（Olympus BX51,日本） PAS試劑盒（Promega）。組織形態(tài)學(xué)觀察睪丸用Bouin＇s液固定,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋,制成5 μm厚切片,進行常規(guī)PA S染色（Periodic Acid-Schiff）,并用蘇木素復(fù)染,以分析完整的曲細精管形態(tài),中性樹膠封片,光鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 I （圖A）

Stage I中的Step1是由次級精母細胞（secondary spermatocyte）分裂而來,相比次級精母細胞體積小30%-40%,早期的精子細胞核分布不規(guī)律、核染色深,不具備可區(qū)分的形態(tài)學(xué)特征。Step1結(jié)束后出現(xiàn)早期頂體顆粒（proacrosomal granules）。Step13的頭部形態(tài)以及核凝集程度在Stage I呈現(xiàn)多樣性。在同一個Stage I 能看到未凝集的精子細胞,然而Step13頭部在形態(tài)上已經(jīng)接近于釋放出的精子,只是缺少隨后的修飾。這一時期的粗線期精母細胞的核內(nèi)大部分由“粗條形”和“細繩狀”的染色體組成,染色體之間幾乎沒有空隙,細胞與細胞核大體呈圓形。

2.2 II-III （圖B）

Step3內(nèi)高爾基器和精子細胞核之間出現(xiàn)的含有頂體顆粒的“小圓圈”區(qū)域是這個時相的標(biāo)志（圖B,箭頭）。通常頂體顆粒染色較淺。Step14頭部變寬縮短,越來越接近成熟的精子頭部形態(tài),頭部頂端“彎鉤”特征明顯（圖B 白箭頭）。在II時相末期,A型精原細胞分裂形成中間型精原細胞,核近似卵圓形且染色均一。

2.3 IV-V （圖C-D）

Stage IV這一階段典型特征是頂體顆粒開始貼著核膜慢慢展平（箭頭）。頂體邊緣與核中心形成40°之內(nèi)的范圍都是Stage IV。Step15在形態(tài)上更加接近精子頭部,但是Step14、Step15和Step16在PAS染色很難區(qū)分,電鏡可以通過觀察線粒體鞘的形成判斷精子發(fā)生的階段。Stage V末期發(fā)生中間型精原細胞向B型精原細胞的分裂,二者在形態(tài)上相似。但是B型精原細胞比中間型精原細胞染色質(zhì)多,與基底膜連接位置較平。這個時相的粗線期精母細胞加快變大并且出現(xiàn)性泡。Step5精子細胞沿核膜的頂體能在PAS染色下清晰可見,且與核中心形成的角度不超過95。

2.4 VI （圖E）

在Stage VI晚期,大部分B型精原細胞分化成為細線前期初級精母細胞,B型精原細胞沿著核包膜呈現(xiàn)出染色質(zhì)“斑塊”,而PI在胞體和胞核都較小,這也是二者的主要區(qū)別。Step6精子細胞的頂體繼續(xù)沿核周伸展,大約覆蓋核周三分之一（95-120）。StageVI時期的粗線期初級精母細胞與前面階段不同,可以剛好清楚的發(fā)現(xiàn)性顆粒（sex vesicle）（白箭頭）,其形態(tài)呈現(xiàn)圓形或卵圓形,核內(nèi)“板塊”染色有輕有重,染色體間的空隙增大。PAS染色發(fā)現(xiàn)Step15與前面兩個階段的Step15無明顯差異。

2.5 VII （圖F）

PI要比B型精母細胞小,核更圓。PI的核膜周分布著“圓圈狀”的染色體,染色體厚度不均一。在VII后階段PI向細線期精母細胞（L）轉(zhuǎn)化,從基底膜向近腔端位移。Step7頂體延伸的角度超過120-150,核位于細胞中心處。而Step16更加靠近官腔。StageVII 的P在體積上明顯變大且染色體形態(tài)不規(guī)則,性顆粒和高爾基復(fù)合器變得明顯且增大。

2.6 VIII （圖G）

圖A-K 分別代表小鼠不同的生精上皮階段Stage I-XII，As， A型精原干細胞；B，B型精原干細胞；PI，減數(shù)分裂細線前期細胞；L，細線期初級精母細胞；Z，偶線期初級精母細胞；P，粗線期初級精母細胞；D，雙線期初級精母細胞；M-I，減數(shù)分裂期細胞I；M-II，減數(shù)分裂期細胞II；2？，次級精母細胞；Step1-16，1-16階段的單倍體精子細胞，Ser，支持細胞；Bar，20 μm。

StageVII晚期,就發(fā)生了PI向L細胞轉(zhuǎn)化。PI核內(nèi)成團的染色體逐漸消失,有“斑點”狀的核物質(zhì)出現(xiàn),最后“斑點”消失后細線狀的染色體出現(xiàn)在胞核內(nèi)。這個階段的粗線期精母細胞體積上繼續(xù)增大,核內(nèi)染色體染色比VII稍重。Step8精子細胞頂體與胞核表面接觸,頂體延伸達到170°到180°胞核和頂體對向生精上皮的基底膜。高爾基復(fù)合體移動到細胞尾端,此時的Step8細胞開始慢慢延長,胞核慢慢成錐形移向末端。很多Step16精子細胞在Stage VIII早期釋放到生精管墻內(nèi)。

2.7 IX-X （圖H、I）

Stage IX中Step9胞核頂端慢慢變平,細胞整體延長。此階段L中出現(xiàn)幾個“小斑點”,而P中核內(nèi)物質(zhì)染色較輕。Stage X的標(biāo)志性特征是Step10頭部腹側(cè)“彎鉤”,PAS染色發(fā)現(xiàn)Step10頭部“腹角”（ventral angle）更加明顯。這時期的P相比胞核和性顆粒比染色輕,體積持續(xù)增大。此外L正向Z發(fā)生轉(zhuǎn)變,染色體變厚變粗,胞體和胞核呈現(xiàn)圓形。

2.9 XI-XII （圖J-K）

Step11頭部背角在StageX-XI過程中形成,且Step11染色加深,形態(tài)上比Step10長。D體積大與前面階段的初級精母細胞,高爾基符合體明顯,胞核不規(guī)則染色。Stage X中2°要比I實相的Step1在體積上大三分之一。在這個實相中,減數(shù)分裂實相細胞（M）所占比例大, M-II比M-I體積上大60%到70%。此外,Z到P的轉(zhuǎn)變,由于二者體積性太相似,無法從形態(tài)上區(qū)分。Step12的核輪廓長且細,頂體染色后呈現(xiàn)出“鈍角”。

3 討論

本文同過系統(tǒng)描述小鼠生精上皮細胞的形態(tài)特征以及它們在發(fā)育過程中的變化,更加清晰的展示出生精上皮細胞的分化過程,有助于清楚辨別不同生精上皮細胞的發(fā)育階段。傳統(tǒng)的方法是在普通HE染色或蘇木精復(fù)染標(biāo)本上對精子發(fā)生周期進行簡單劃分的方法。趙杰［2］等人采用PAS染色法與普通HE染色法相對照,對比觀察小鼠睪丸各級生精上皮在精子發(fā)生不同時期的形態(tài)學(xué)變化特點。低倍鏡下,通過頂體的染色可以清楚的分辨出不同階段的生精上皮（StageI-XII）,高倍鏡下,頂體特征更加明顯如“點狀”StageII-III,“平狀”Stage IV,“彎曲狀”StageVI,在研究中這些分子標(biāo)志物的使用有利于分析突變小鼠精子發(fā)生功能是否異常。此外,除了可以用形態(tài)學(xué)的方式辨別生精上皮細胞的類型,很多生精細胞表達特異性的結(jié)構(gòu)蛋白。例如Pou5f1/Oct4等都可以作為生精上皮精原細胞的標(biāo)記分子［3］。SCP3是生殖細胞減數(shù)分裂中聯(lián)會復(fù)合體形成必需的組成,可以用來標(biāo)記減數(shù)分裂［4］。部分SP-10特異性表達在精子細胞的頂體,通過免疫顯色反應(yīng)發(fā)現(xiàn)Sp-10清晰的表達在頂體［5］。本研究細描述了每一類生精上皮細胞的形態(tài)學(xué)特征,為今后小鼠生殖系統(tǒng)基因的相關(guān)功能研究提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

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［2］趙潔，侯武剛，張遠強.小鼠生精周期判定方法的改進［J］.中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志，2006（2）：130-134.

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［4］侯越，吳應(yīng)積，羅奮華，等.絨山羊Scp3基因的克隆及睪丸中第一輪減數(shù)分裂的發(fā)生［J］.動物學(xué)研究，2009，30（3）：341-344.

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Q2

A

1674-2060（2016）03-0003-02

吳楓