程旺開，楊　柳

(1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

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南瓜酒酵母菌的篩選及其發(fā)酵特性研究

程旺開1，楊柳2

(1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

為篩選得到適合南瓜酒發(fā)酵的酵母菌株，對南瓜皮中天然存在的酵母菌進行平板分離，通過TTC顯色法篩選出產(chǎn)酒精能力強的酵母菌株，并考察其在南瓜汁中的發(fā)酵特性，確定其生長受外界條件的影響情況。實驗結(jié)果表明，在分離篩選得到的12株酵母菌株中，1號菌和12號菌產(chǎn)酸較低且具有較強的發(fā)酵產(chǎn)酒精能力，其最適生長條件為溫度28 ℃、Ph 6、糖濃度15%，分別能耐受酒精濃度20%和SO2濃度200 mg/L，但1號菌產(chǎn)酸能力較12號菌低，且產(chǎn)乙醇能力及凝聚性能均優(yōu)于12號菌。因此，1號菌可作為南瓜酒發(fā)酵專用菌種。

南瓜酒；釀酒酵母；篩選

1　引言

南瓜為葫蘆科南瓜屬的一年生蔓性草本植物，又名倭瓜、麥瓜、飯瓜等[1]，其富含淀粉、脂肪、還原糖、多種氨基酸、維生素及礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，具有防癌、治病、驅(qū)蟲、保護視力、消炎止痛等功效，對防治糖尿病、動脈硬化、胃腸潰瘍、排除重金屬和腎結(jié)石以及防治便秘等具有良好作用[2-4]，在國際上已被認(rèn)為特效保健食品。近年來將南瓜加工成酒的研究不少，主要集中于發(fā)酵工藝、香氣變化、抗氧化活性等方面[5-7]，尚未見有南瓜釀酒酵母篩選的報道。

釀酒酵母在果酒的生產(chǎn)中起著重要的作用，直接影響果酒的感官和理化品質(zhì)[8-10]。目前南瓜酒的釀造過程中，大多選用葡萄酒酵母或活性干酵母，在一定程度上造成南瓜果酒風(fēng)味偏于平淡，無法突出南瓜特有的口感和香氣[11]。因此，本實驗以期從南瓜皮中分離篩選適宜的南瓜酒酵母菌，并對其生長特性進行初步的研究，為南瓜的深加工開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

2　材料與方法

2.1材料及試劑

南瓜采摘于蕪湖市郊區(qū)菜園；蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉、酵母膏、TTC(紅四氮唑)、七水合硫酸鎂、磷酸二氫鉀、蔗糖、氫氧化鈉、亞硫酸、乙醇均出自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

2.2培養(yǎng)基

A分離培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基，g/100 mL)：馬鈴薯20(制成浸汁)，葡萄糖2 ，瓊脂1.5—2。

B鑒別培養(yǎng)基(TTC培養(yǎng)基，g/100 mL)：下層，葡萄糖1，蛋白胨0.2，酵母膏0.15，磷酸二氫鉀0.1，七水合硫酸鎂0.004，瓊脂2。上層，葡萄糖1，TTC 0.05，瓊脂2，自然pH，0.1MPa、121 ℃滅菌20 min。

C種子培養(yǎng)基(南瓜汁培養(yǎng)基)：南瓜汁，蔗糖調(diào)整糖度至5%。

D發(fā)酵培養(yǎng)基(南瓜汁培養(yǎng)基)：南瓜汁，蔗糖調(diào)整到所需糖度，HCL或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH。

2.3儀器與設(shè)備

721B型分光光度計：上海第三分析儀器廠；HH-4型電熱恒溫水浴鍋：江蘇常州市囯華儀器廠；SKP-01B恒溫培養(yǎng)箱：湖北省黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公；JA1003N電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；0-50酒精濃度計：國營武強縣儀表廠；WYT-J 0-32%手持糖度計：四川成都光學(xué)廠。

2.4實驗方法

2.4.1菌株的分離

將5 g南瓜皮加入50 mL無菌水中，混合梯度稀釋后涂布于PDA固體培養(yǎng)基，在28 ℃培養(yǎng)24 h。采用劃線法將疑似酵母菌落轉(zhuǎn)接至新的PDA平板上，培養(yǎng)后得純種菌落。

將TTC下層培養(yǎng)基倒平板后，在其上用點接法接種純種菌落，在28 ℃培養(yǎng)24 h。倒入TTC上層培養(yǎng)基，避光反應(yīng)2 h后觀察菌落顏色變化。將PDA平板上與出現(xiàn)相應(yīng)顏色反應(yīng)的菌落位置對應(yīng)的菌落接種到新的PDA平板上，培養(yǎng)得到純種酵母菌株。

將所得酵母菌株接種于擴培培養(yǎng)基中，于28 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h，制得菌懸液加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28 ℃下靜置培養(yǎng)，酒度高、發(fā)酵液酸度低的菌株，即為較優(yōu)菌株。同時以活性干酵母為發(fā)酵菌株作對照。

2.4.2菌種發(fā)酵特性

南瓜取籽、去皮后切片，按1∶1加熱煮沸20 min，冷卻后打漿并加入0.1%果膠酶和0.20%糖化酶，，在40 ℃下酶解4 h，過濾，分別用蔗糖及酸堿調(diào)整南瓜汁糖度及pH，殺菌后接種，于一定的溫度下培養(yǎng)24 h后，測量發(fā)酵液菌濃(OD420值)、酒精度及酸度，確定所篩選酵母菌的生長特性、凝聚力及產(chǎn)酸能力。

2.4.3指標(biāo)測定

菌體濃度：以420 nm處的吸光度OD420表示。

酸度、酒精度測定：參照GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定。

凝聚性能測定：在300 mL南瓜汁培養(yǎng)基中加入0.5 mL鮮酵母培養(yǎng)液并于28 ℃下培養(yǎng)，每隔24 h稱重一次，直至兩天的重量偏差小于0.2 g為止。充分振蕩發(fā)酵液后測總懸浮酵母數(shù)(T)，另取充分振蕩的發(fā)酵液于28 ℃下靜置6 h，測上清液中懸浮酵母數(shù)(D)，按公式(1)計算酵母凝聚力。

酵母凝聚力(%)=(T—D)/T×100.

(1)

3　結(jié)果與討論

3.1釀酒酵母的分離

通過分離，在PDA平板上得到乳白色、濕潤、較光滑的菌落，將這些菌落點接至TTC平板上反應(yīng)后，部分菌落變?yōu)榧t色，則證明有酒精產(chǎn)生，是酵母菌落，共得到12株酵母菌菌株。所得菌株經(jīng)擴大培養(yǎng)接種南瓜汁中發(fā)酵后，所得酒液中酒精度及酸度見表1。

表1不同菌株發(fā)酵酒液中酒精及酸含量

編號酒精度/%酸度/(g/L)編號酒精度/%酸度/(g/L)活性干酵母5.50.935751.084160.68085.50.95624.60.91495.50.89335.51.2751051.041450.8501161.33955.51.1051260.744650.999

從表1中可以看出，1號菌、11號菌和12號菌發(fā)酵液酒精度最高，具有較強的發(fā)酵產(chǎn)酒精能力。在該三株菌中，由于菌種11號菌發(fā)酵后酸度大，故選擇1號菌、12號菌進行后續(xù)研究。

3.2不同條件對酵母菌株生長的影響

3.2.1溫度對酵母菌生長的影響

在糖度15%、pH7的南瓜汁中接入10%的菌懸液，分別置于22 ℃，24 ℃，26 ℃，28 ℃，30 ℃溫度下進行發(fā)酵培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液中菌體濃度如圖1所示。

圖1　溫度對1號和12號釀酒酵母生長的影響

從圖1可以看出，兩株菌生長受溫度變化的影響情況基本相同，當(dāng)溫度低于28 ℃時，菌濃隨溫度的升高逐漸增大；當(dāng)溫度高于28 ℃時，菌體濃度降低，這表明28 ℃的溫度最適該酵母菌的生長。

3.2.2糖度對酵母菌生長的影響

將南瓜汁的糖度分別調(diào)至5%，10%，15%，20%，25%，pH調(diào)至7，接入10%的菌懸液于28 ℃溫度下培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液中菌體濃度如圖2所示。

圖2　糖度對1號和12號釀酒酵母生長的影響

由圖2中可以看出，兩株菌菌濃隨糖度變化的趨勢一致，即兩株菌生長受糖度變化的影響情況基本相同。在糖度低于15%時，菌濃隨糖度升高逐漸增大，在糖度為15%時達(dá)到最大值，當(dāng)糖度大于15%時，由于過高濃度的糖使溶液滲透壓增大，反而抑制酵母菌的生長，菌濃隨糖度增大而降低。糖度為15%時，菌濃最大，最適宜酵母菌的生長。

3.2.3pH對酵母菌生長的影響

將南瓜汁的糖度調(diào)至15%，pH分別調(diào)至2，4，6，8，10，接入10%的菌懸液于28 ℃溫度下培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液中菌體濃度如圖3所示。

圖3　pH值對1號和12號釀酒酵母生長的影響

由圖3中可以看出，兩株菌菌濃隨酸度變化的趨勢基本一致，在pH低于6時，菌濃隨pH紙升高逐漸增大，在pH值為6時達(dá)到最大值，當(dāng)pH大于6時，由于過高的pH抑制酵母菌的生長，菌濃隨pH值增大而降低。因此最適宜酵母菌的生長的pH為6。

3.2.4酒精濃度對酵母菌生長的影響

在糖度15%、pH7的南瓜汁中加入酒精，調(diào)整酒精度至5%，10%，15%，20%，25%，接入10%的菌懸液于28 ℃溫度下培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液中菌體濃度如圖4所示。

圖4　酒精度對1號和12號釀酒酵母生長的影響

酵母菌對酒精的耐受能力是影響果酒發(fā)酵的重要因素，如果酵母菌耐酒精能力差，發(fā)酵難以持續(xù)。由圖4中可以看出，兩株菌生長受酒精濃度變化的影響情況基本相同，隨著酒精濃度的增大，菌濃值不斷減小，當(dāng)酒精濃度大于20%時，菌濃迅速減小，即酒精對酵母菌生長的抑制作用迅速增強。果酒酒精度一般低于10%，因此該兩株釀酒酵母可用于果酒發(fā)酵中。

3.2.5二氧化硫濃度對酵母菌生長的影響

在糖度15%、pH7的南瓜汁中添加亞硫酸，分別調(diào)整其二氧化硫濃度至50 mg/L，100 mg/L，200 mg/L，300 mg/L，400 mg/L，接入10%的菌懸液于28 ℃溫度下培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液中菌體濃度如圖5所示。

圖5　二氧化硫濃度對1號和12號釀酒酵母生長的影響

果酒生產(chǎn)中常使用二氧化硫為抑菌劑，在抑制有害微生物的同時，可最大程度地保留原料原有成分，因此，酵母菌需對二氧化硫有一定的耐受能力。由圖5可以看出，兩株菌生長受二氧化硫濃度變化的影響情況基本相同。隨著二氧化硫濃度的增大，菌濃值不斷減小，當(dāng)二氧化硫濃度大于200 mg/L時，菌濃迅速減小，即二氧化硫?qū)湍妇L的抑制作用迅速增強，說明酵母菌可耐受的最高二氧化硫濃度為200 mg/L。二氧化硫濃度大于100 mg/L時可起到抑制雜菌生長的作用，因此，該兩株菌對二氧化硫的耐受能力可滿足發(fā)酵要求。

3.3酵母菌凝聚性能

酵母的凝聚性是重要釀造特性。能影響到酵母回收再利用、酵母發(fā)酵速率和發(fā)酵度、果酒過濾速度以及過濾方法的選擇以及成品果酒的穩(wěn)定性及風(fēng)味等。1號菌和12號菌的凝聚性能測定結(jié)果如圖6所示。

圖6　凝聚性能測定結(jié)果

由圖6中數(shù)據(jù)可知，兩菌凝聚力均大于90%，凝聚性能良好，其中一號菌的凝聚力高于12號菌，更有利于南瓜酒的發(fā)酵。

3.4酵母菌產(chǎn)酸能力

將南瓜汁糖度調(diào)至15%，pH調(diào)至7，接入10%的菌懸液于28 ℃溫度下發(fā)酵8 d后測其酒精度及酸度，結(jié)果如圖6所示。

圖7　1號和12號酵母菌產(chǎn)酸產(chǎn)乙醇的比較

從圖7可以看出，在相同的發(fā)酵條件下，1號菌較之12號菌的發(fā)酵液中酒精度更高、酸含量更低，且1號酵母菌的凝聚性能更好。因此，1號酵母菌可作為南瓜釀酒酵母菌。

4　結(jié)論

從南瓜皮中分離得到兩株發(fā)酵性能較為優(yōu)良的1號和12號釀酒酵母菌株，其在南瓜汁具有相似的生長特性，合適的生長條件為溫度28 ℃、pH6、糖濃15%，可耐受的20%酒精濃度和200 mg/L的SO2濃度；1號菌的凝聚性能及產(chǎn)乙醇的能力均好于12號酵母菌，且1號菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)酸能力較低，釀造出的南瓜酒口感更佳，因此，1號菌株是一株優(yōu)良的南瓜酒釀造酵母。下一步將以1號酵母作為南瓜釀酒酵母，并對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，為南瓜酒的釀造提供理論參考。

[1]盧麗芳,朱海生,溫慶放,等.南瓜種質(zhì)資源遺傳多樣SRAP分析[J].熱帶作物學(xué)報.2015,36(12):2142-2148.

[2]劉宏偉,朱乾華,謝華林.南瓜子中微量元素的組成研究[J].食品科技,2012,37(11):67-69.

[3]Mi Y,Eun J,Young-Nam,et al.Comparison of the chemical compositions and nutritive values of various pumpkin (Cucurbitaceae) species and parts[J].Nutrition Research and Practice,2012,6(1):21-27.

[4]張高帆,蘇東洋,張擁軍,等.南瓜多糖對不同糖尿病模型小鼠的降糖作用[J].中國食品學(xué)報,2014,14(2):24-26.

[5]黃儒強,郭倩玉,陳杰,等.南瓜酒發(fā)酵工藝條件的研究[J].食品科學(xué),2007,28(8):227-230.

[6]張靖媛,王成榮,楊紹蘭,等.響應(yīng)而分析法優(yōu)化南瓜酒發(fā)酵工藝條件[J].食品科學(xué),2012(5):213-217.

[7]張靖媛,吳昊,王鳳舞,等.南瓜酒抗氧化活性及其Vc、多酚和多糖含量的關(guān)系[J].食品科學(xué),2013,34(1):78-85.

[8]郝瑤,王陶,李文,等.富硒稱猴桃果酒酵母的篩選及鑒定[J].食品科學(xué),2014,35(1):175-179.

[9]LAMBRECHTS M G, PRETORIUS I S. Yeast and its importance to wine aroma: a review[J]. South African Journal of Enology and Viticulture, 2000, 21(1): 97-129.

[10]趙祥杰,楊榮玲,肖更,生,等.桑棋果酒專用酵母的篩選及鑒定[J].中國食品學(xué)報,2008,8(1):60-66.

[11]安冬梅,孟長軍,孫愛紅.南瓜酒加工工藝研究[J].北方園藝,2012(15):166-168.

Screening of ayeast strain for pumpkin wine and study on its properties

CHENGWang-kai1,YANGLiu2

(1.Wuhu Institute of Technology,Wuhu 241000,China；2. School of Biotechnology and Food Engineering,Hefei University of Technology，Hefei 230009，China)

In order to obtain yeast suitable for the fermentation of pumpkin wine, the yeast strains with strong ability of alcohol production were screened out from the Pumpkin Peel by the TTC method. The fermentation characteristics of the yeast in the pumpkin juice were investigated, and the influence of external conditions on the growth of the yeast was determined. The experimental results show that 12 strains of yeast strains were isolated and screened, the 1 bacteria and 12 bacteria produce acid is low and has a strong ability to produce alcohol.The optimum conditions for the growth of strain 1 and strain 12 were temperature 28℃, pH6 and sugar concentration 15%.The strain displayed good resistance to high concentration alcohol (as high as 20%)and SO2(200 mg/L). But the yield of 1 bacteria was superior to 12 bacteria in ethanol and aggregation, and the ability of produce acid was lower than 12.Therefore,the 1 bacteria could be used for pumpkin wine fermentation.

pumpkin wine;yeast;screening

2016-06-01.

程旺開(1972-)，男，副教授，E-mail:448408718@qq.com.

楊柳(1975-)，女，博士，副教授，E-mail:yangliu199@163.com.

安徽省高等學(xué)校省級自然科學(xué)研究重點項目(KJ2015A432)；安徽省高校領(lǐng)軍人才引進與培育計劃項目(gxfxZD2016361)；安徽省高等學(xué)校省級質(zhì)量工程項目(2015zy086).

2095-7386(2016)03-0020-05

10.3969/j.issn.2095-7386.2016.03.003

TS 262.7；TS 261.4；TS 261.1

A