劉越峰，張　勇，鐘曉東，羅衛(wèi)民

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院眼科中心，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院心胸外科，湖北 十堰 442000

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miR-222通過靶向RB1促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與侵襲

劉越峰1，張勇1，鐘曉東1，羅衛(wèi)民2

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院眼科中心，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院心胸外科，湖北 十堰 442000

背景與目的：視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因1（retinoblastoma 1，RB1）能夠抑制多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，且與細(xì)胞周期、分化、衰老、凋亡及生長(zhǎng)抑制等調(diào)控密切相關(guān)。該研究旨在明確miR-222是否通過靶向RB1表達(dá)而促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與侵襲，進(jìn)一步揭示miR-222促瘤作用的分子機(jī)制。方法：將miR-222（miR-222 模擬物）+RB1-wt（野生型RB1的3'-非翻譯區(qū)的熒光素酶報(bào)告載體）、miR-NC（無關(guān)序列對(duì)照）+RB1-wt、miR-222+RB1-mut（突變型RB1的3'-非翻譯區(qū)的熒光素酶報(bào)告載體）及miR-NC+RB1-mut共轉(zhuǎn)染人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Y79，并采用單光子檢測(cè)熒光素酶活性。采用蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測(cè)RB1表達(dá)水平的改變。將miR-222與miR-NC、RB1（pcDNA3.1-RB1）與vector（pcDNA3.1）、miR-222+RB1及miR-NC+vector轉(zhuǎn)染Y79細(xì)胞，MTS檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Y79細(xì)胞生長(zhǎng)與侵襲能力的影響。結(jié)果：與miR-NC+RB1-wt組比較，共轉(zhuǎn)染miR-222+RB1-wt組的熒光素酶活性強(qiáng)度降低了約56.67% （P＜0.05）。與miR-NC比較，miR-222組RB1蛋白水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染miR-222 組細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著高于miR-NC組（P＜0.05）。與pcDNA3.1組比，pcDNA3.1-RB1組可顯著抑制Y79細(xì)胞的生長(zhǎng)（P＜0.05），而miR-222+pcDNA3.1-RB1組和miR-NC+pcDNA3.1組比較，細(xì)胞生長(zhǎng)速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染miR-222組穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)分別為（193±10），與對(duì)照組（144±11）比較能明顯加快Y79細(xì)胞的穿膜能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而miR-NC+pcDNA3.1組和miR-222+pcDNA3.1-RB1組比較，穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：miR-222通過靶向調(diào)控RB1表達(dá)而促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與侵襲。

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；miR-222；RB1；生長(zhǎng)；侵襲

MicroRNAs（miRNAs）是內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其長(zhǎng)度為19～25 bp，通過與mRNA的3'-UTR區(qū)域完全或者不完全配對(duì)，促進(jìn)mRNA的降解和（或）阻礙其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)其表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，調(diào)控過程涉及到個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化及凋亡多種生命活動(dòng)［1］。miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，miR-222在多種惡性腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，包括腎癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌以及乳腺癌等，且多數(shù)與腫瘤的生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［2-5］。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因1（retinoblastoma 1，RB1）是第一個(gè)人類成功分離克隆的抑癌基因，在哺乳動(dòng)物中RB1基因家族成員有RB1/p105，RBL1/p107和RB2/p130這3個(gè)成員。RB1對(duì)多種腫瘤具有抑制作用，如乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、胰腺癌和骨肉瘤等［6-7］。研究證實(shí)，RB1的抑癌作用與其對(duì)細(xì)胞的周期、分化、衰老、凋亡和生長(zhǎng)的抑制等調(diào)控密切相關(guān)。本研究通過熒光素酶報(bào)告活性檢測(cè)、蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）、MTS、Transwell等分子生物學(xué)技術(shù)證實(shí)了miR-222通過直接靶向調(diào)控RB1蛋白表達(dá)而促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與侵襲，從而探討miR-222的在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的促瘤功能和分子機(jī)制。

1　材料和方法

1.1主要材料

miR-222模擬物（miR-222）及無關(guān)序列對(duì)照（miR-NC）購(gòu)自美國(guó)Ambion公司。miR-222 模擬物序列為5'-UGCCAUUUAA AAAGUUGUAGCAG-3'，miR-NC序列為5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'。鼠單抗人RB1和鼠單抗GAPDH購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自武漢博士德公司。pcDNA3.1-RB1重組載體（A DNA sequence encoding the mature form of human RB1）、RB1、pcDNA3.1空載體對(duì)照（vector）、突變型RB1的3'-非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）的熒光素酶報(bào)告載體（RB1-mut）和野生型RB1的3'-UTR的熒光素酶報(bào)告載體（RB1-wt）由廣州市復(fù)能基因有限公司成功構(gòu)建。雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。RPMI-1640和Opti-MEM培養(yǎng)基以及胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。MTS細(xì)胞生長(zhǎng)增殖/毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海BestBio公司。BCA和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。Transwell小室及基質(zhì)膠等相關(guān)試劑購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Y79細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS，1%青霉素-鏈霉素溶液和2 mmol/L的谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。Y79細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)呈單層貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，傾棄培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，隨后用0.25%胰酶消化，在顯微鏡下觀察見細(xì)胞間隙增大后，隨即傾去胰酶，加入含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，并吹打細(xì)胞使其成單細(xì)胞懸液，常規(guī)傳代。

1.3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA和質(zhì)粒

收集培養(yǎng)瓶中預(yù)先培養(yǎng)至約80%密度的細(xì)胞，用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋，吹打制成5×104個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，每孔按2 mL鋪至6孔板中，每孔100 μL鋪至96孔板中，并放置在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞密度達(dá)60%～80%時(shí)用于轉(zhuǎn)染。接種細(xì)胞于6孔或96孔板中，待完全培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)至30%～50%密度時(shí)，在無菌EP管中配好LipofectamineTM2000及待轉(zhuǎn)染試劑；室溫放置20 min，使脂質(zhì)體與DNA形成復(fù)合體；用無血清培養(yǎng)液洗滌培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞。然后向復(fù)合體中加入無血清培養(yǎng)液（不含抗生素），溫和地混勻，加入到待轉(zhuǎn)染的6孔或96孔板中；置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中，48 h后，收集細(xì)胞并抽提蛋白。

1.4熒光素酶活性檢測(cè)miR-222是否與RB1的3'-UTR區(qū)結(jié)合

將實(shí)驗(yàn)分成4組：miR-222+RB1-wt組、miR-NC+RB1-wt組、miR-222+RB1-mut組和miR-NC+RB1-mut組，分別共轉(zhuǎn)染上述4組于Y79細(xì)胞48 h后，收獲細(xì)胞。按雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega公司）的說明書用單光子檢測(cè)儀（美國(guó)BioRad公司）檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶的活性。計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性，公式為螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Western blot檢測(cè)Y79細(xì)胞中RB1蛋白表達(dá)改變

將miR-222、miR-NC、表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-RB1和空載體pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染到Y(jié)79細(xì)胞48 h后，分別提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定各組蛋白濃度。每孔分別取30 μg樣本，進(jìn)行10% SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，加入1∶200鼠抗人RB1抗體或1∶1 000鼠抗人GAPDH抗體，4 ℃過夜。TBST洗膜30 min，加入1∶10 000辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗，并且室溫溫育1～1.5 h，TBST洗膜30 min后加入ECL發(fā)光劑，X片曝光、顯影、定影。掃描條帶后獲取并保存圖片。Quantity One軟件分析，以目的蛋白質(zhì)條帶的灰度值和內(nèi)參GADPH的 蛋白灰度值比值來表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次（圖1、2）。

1.6MTS法檢測(cè)miR-222和RB1對(duì)Y79細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性的影響

將實(shí)驗(yàn)分成6組：miR-222、miR-NC、pcDNA3.1-RB1、pcDNA3.1、miR-222+ pcDNA3.1-RB1和miR-NC+pcDNA3.1組，分別轉(zhuǎn)染Y79細(xì)胞，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，在未接種細(xì)胞的孔中加入RPMI-1640培養(yǎng)基來作為調(diào)零孔。轉(zhuǎn)染后放置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入20 μL MTS檢測(cè)試劑，37 ℃溫育2 h后，每孔中加入150 μL DMSO，低速振蕩10 min至使結(jié)晶物充分融解。隨后用酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm波長(zhǎng)的吸光度值（D492）。增殖活性計(jì)算公式為：（D處理組-D調(diào)零孔）/（D對(duì)照組比-D調(diào)零孔）×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。先轉(zhuǎn)染好細(xì)胞，然后把轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞消化接種到96孔板，接種后再培養(yǎng)48 h。

1.7Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

在Transwell小室中鋪加基質(zhì)膠稀釋液，放置過夜使其成膜。次日取100 μL細(xì)胞稀釋液接種于小室的上腔，下腔中加入500 μL含10% FBS的培養(yǎng)基，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后，取出并擦棄小室上層的細(xì)胞，并用甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色。PBS緩沖液清洗，倒置并晾干。在光學(xué)顯微鏡下觀察，并隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并取平均值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有結(jié)果均以表示。兩組比較采用t檢驗(yàn)（Student's t test），多組間比較采用采用單因素方差分析（one way ANOVA），采用SNK法檢驗(yàn)（q檢驗(yàn)）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1RB1為miR-222直接調(diào)控的靶基因

通過TargetScan在線軟件預(yù)測(cè)，RB1為miR-222預(yù)測(cè)的靶基因；隨后將miR-222、miR-NC分別與RB1-wt、RB1-mut共轉(zhuǎn)染至Y79細(xì)胞中，采用單光子檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，在miR-222+RB1-wt組中熒光素酶活性強(qiáng)度（0.463）較miR-NC+RB1-wt組（1.07）下降了約56.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，P＜0.05）；在miR-222+RB1-mut組中，熒光素酶的活性強(qiáng)度無著性下降。

2.2miR-222抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因RB1的表達(dá)

為了驗(yàn)證miR-222對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤RB1基因表達(dá)的影響，分別轉(zhuǎn)染miR-222及對(duì)照組miRNC到Y(jié)79細(xì)胞中，Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-222后，RB1蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組miRNC（P＜0.05，圖1）。即miR-222能抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞中RB1蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)RB1是miR-222直接調(diào)控的靶基因。

2.3過表達(dá)RB1減少miR-222對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的促進(jìn)作用

為了明確miR-222是否通過調(diào)控RB1表達(dá)來影響Y79細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力，首先分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RB1重組載體及pcDNA3.1空載體對(duì)照到Y(jié)79細(xì)胞中，Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染結(jié)果，結(jié)果顯示表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-RB1組蛋白R(shí)B1表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組空載體pcDNA3.1組（P＜0.05，圖2A），表明轉(zhuǎn)染成功。隨后分別轉(zhuǎn)染miR-222、miR-NC、表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-RB1、空載體pcDNA3.1、miR-222+表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-RB1、miR-NC+空載體pcDNA3.1到Y(jié)79細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，MTS法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-222組視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度顯著高于miR-NC組（P＜0.05，圖2B）；與空載體pcDNA3.1組比，表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-RB1組可顯著抑制Y79細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖（P＜0.05，圖2B），而miR-222+表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-RB1組和miR-NC+pcDNA3.1空載體組的生長(zhǎng)增殖速度相當(dāng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果提示過表達(dá)RB1可能部分減少miR-222對(duì)Y79細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖的促進(jìn)作用（圖3B）。這表明miR-222可通過靶向基因RB1表達(dá)而促進(jìn)Y79細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。

圖 1　miR-222抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因RB1的表達(dá)Fig. 1 miR-222 inhibited the expression of RB1 in retinoblastoma cellsA： The protein expression of RB1 by Western blot in Y79 cells； B： The relative expression level of RB1 protein in Y79 cells after transfection with miR-222 was lower than those transfected with miR-NC； *： P＜0.05， as compared with miR-NC

圖 2　MTS證實(shí)RB1可抑制Y79細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，miR-222可通過RB1促進(jìn)Y79細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖Fig. 2 Overexpression of RB1 inhibited the proliferation of retinoblastoma cells Y79 and miR-222 promoted the proliferation of retinoblastoma cells through targeting RB1 detected by MTSA： The protein expression of RB1 detected by Western blot in Y79 cells. The expression level of protein in Y79 cells after transfection with RB1（pcDNA3.1-RB1） was higher than those in vector （pcDNA3.1）， the transfection was successful. *： P＜0.05， as compared with vector. B： The cell proliferation with miR-222 mimics or RB1 by MTS in Y79 cells. C： Bar graph of cell survival rates. *： P＜0.05， as compared with vector miR-NC.#： P＜0.05， as compared with pcDNA3.1. There was no signifcant diference between the cell survival rate of Y79 which were transfected with miR-222+pcDNA3.1-RB1 and miR-NC+pcDNA3.1 （P＞0.05）. WT： Y79 without transfection

2.4miR-222通過靶向RB1促進(jìn)Y79細(xì)胞的侵襲能力

為了進(jìn)一步明確miR-222是否通過調(diào)控RB1表達(dá)來影響Y79細(xì)胞的侵襲能力，分別轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-RB1、空載體pcDNA3.1、miR-222、miR-NC、miR-222+pcDNA3.1-RB1與miR-NC+pcDNA3.1于Y79細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，Transwell結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-222組穿出基底膜細(xì)胞數(shù)為（193±10），顯著高于miR-NC組（144±11）（P＜0.05，圖3）；與pcDNA3.1組比，pcDNA3.1-RB1可顯著抑制Y79細(xì)胞的侵襲能力（P＜0.05，圖3），而miR-222+pcDNA3.1-RB1組與miR-NC+ pcDNA3.1組侵襲能力無顯著性差異，結(jié)果提示過表達(dá)RB1可能部分減少miR-222對(duì)Y79細(xì)胞的侵襲的促進(jìn)作用（圖3B）。這表明miR-222可通過靶向基因RB1表達(dá)而促進(jìn)Y79細(xì)胞的侵襲。

圖 3　Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)miR-222對(duì)Y79細(xì)胞侵襲能力的作用Fig. 3 The invasion ability of Y79 cells regulated by miR-222 and RB1 were tested by Transwell invasion assaysA： Images of Y79 cells after transfection with miR-NC， miR-222， vector （pcDNA3.1） and RB1 （pcDNA3.1-RB1）； B： The invasion cells per feld in Y79 cells after transfection with miR-222 were higher than those in miR-NC （*： P＜0.01， as compared with miR-NC）. #： P＜0.01， as compared with pcDNA3.1. The invasion cells per feld after transfection with miR-222+RB1 （pcDNA3.1-RB1） had no signifcant diference with miRNC+vector （pcDNA3.1） （P＞0.05）

3　討 論

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤為原發(fā)于視網(wǎng)膜的惡性腫瘤，在美國(guó)每年有250～350例新發(fā)病例［8］。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤有遺傳型和非遺傳型，后者相對(duì)發(fā)病晚，常見單側(cè)、散發(fā)型［8-9］。臨床常用的治療方法有放射治療、化學(xué)治療、眼球摘除手術(shù)、冷凍治療等［10］。盡管其治療方法不斷改進(jìn)，但治療效果是有限的?；蛑委煹陌l(fā)展，為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療提供了新的思路。

本次研究采用不同分子生物學(xué)技術(shù)包括生物信息學(xué)技術(shù)、熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)、MTS、Transwell和Western blot等證實(shí)RB1為miR-222直接調(diào)控的靶基因。研究報(bào)道顯示，RB1為人類首個(gè)分離克隆的抑癌基因，能在多種正常細(xì)胞中表達(dá)，且并不隨著細(xì)胞周期而產(chǎn)生明顯的變化，這種表達(dá)方式可能與RB1參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖及分化相關(guān)［11-12］。另外，RB1的表達(dá)量在不同組織及發(fā)育階段也存在一定差異［13］。研究表明，RB1基因能夠抑制多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，包括視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤、胰腺癌和乳腺癌等［6-7］。因此，從RB1研究視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制，可能會(huì)為其治療提供新的思路。

在確定RB1為miR-222直接調(diào)控的靶基因后，我們采用分別轉(zhuǎn)染miR-222及對(duì)照組miRNC到Y(jié)79細(xì)胞中，用以驗(yàn)證miR-222對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤RB1基因表達(dá)的影響，Western blot結(jié)果顯示，高表達(dá)miR-222能抑制Y79細(xì)胞RB1蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)RB1是miR-222直接調(diào)控的靶基因。而miRNA-222在腫瘤中可發(fā)揮類似癌基因的作用，通過抑制p27Kip1和p57（CDK抑制因子），或者上調(diào)ZEB2（EMT誘導(dǎo)基因）的表達(dá)從而發(fā)揮其致癌作用［14-15］。據(jù)報(bào)道，miR-222在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，包括胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌和肝癌等。miR-222在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)，可能會(huì)通過調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

通過構(gòu)建載體質(zhì)粒，我們分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RB1及對(duì)照組空載體pcDNA3.1到Y(jié)79細(xì)胞中。Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RB1能促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。且過表達(dá)RB1能夠部分減少miR-222對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖的促進(jìn)作用。且外源性轉(zhuǎn)染miR-222能顯著促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與侵襲，提示miR-222在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中具有潛在的促癌作用。與文獻(xiàn)報(bào)道的高表達(dá)miR-222可參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移一致［16］。

綜上，miR-222可通過直接靶向RB1促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)與侵襲，即miR-222可能為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的潛在的治療靶點(diǎn)，為今后該疾病的防治提供了新的切入點(diǎn)。

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miR-222 promotes retinoblastoma cell proliferation and invasion by targeting RB1

LIU Yuefeng， ZHANG Yong， ZHONG Xiaodong， LUO Weimin （1. Department of Ophthalmology， Taihe Hospital of Shiyan Afliated to Hubei University of Medicine， Shiyan 442000， Hubei Province， China； 2. Department of Cardiothoracic Surgery， Taihe Hospital of Shiyan Affiliated to Hubei University of Medicine， Shiyan 442000， Hubei Province， China）

LUO Weimin E-mail： luoweimin0803@sina.com

Background and purpose： A large number of studies have showed that retinoblastoma gene 1 （RB1）can inhibit the occurrence and development of many tumors， including neuroblastoma， small cell lung cancer， osteosarcoma， pancreatic cancer， breast cancer and so on. RB1 is also closely related to the regulation of cell cycle， diferentiation， senescence， apoptosis， growth inhibition， etc. The goal of this article is to elucidate whether miR-222 promotes cell proliferation and invasion by targeting RB1， further to explore the molecular mechanism that miR-222 functions as an oncogene in retinoblastoma cells. Methods： miR-222 （miR-222 mimics） and RB1-wt， miR-NC and RB1-wt， miR-222 and RB1-mut， miR-NC （a controlled miR-222 mimics） and RB1-mut were co-transfected into Y79 cells， and luciferase activity was detected by single photon. Retinoblastoma cells were transfected with miR-222 mimics and miR-NC， and the expressions of RB1 protein were detected by Western blot. Retinoblastoma cell proliferation assays were performed by MTS assay when miR-222， miR-NC， RB1 （pcDNA3.1-RB1）， vector （pcDNA3.1）， miR-222+RB1 and miR-NC+vec-tor were transfected into Y79 cells. The growth and invasion ability of Y79 cells with ectopic expression of miR-222 were evaluated by MTS and Transwell invasion assays. Results： This study demonstrated that miR-222 could promote the luciferase activity of RB1-wt. The expression levels of luciferase reporter gene activity in Y79 cells after transfection with miR-222+RB1-wt were higher than those in the negative control cells （miR-NC+RB1-wt） （P＜0.05）. The protein expression levels of RB1 in Y79 cells after transfection with miR-222 were lower than those in miR-NC（P＜0.05）. Overexpression of RB1 inhibited the proliferation of retinoblastoma cells. miR-222 promoted the proliferation of retinoblastoma cells through targeting RB1 （P＜0.05）. Moreover， there was no signifcant diference between the cell survival rates of Y79 which were transfected with miR-222+pcDNA3.1-RB1 and miR-NC+pcDNA3.1 （P＞0.05）. After transfection with miR-222 mimics for 48 h， Transwell invasion assay showed that the number of cells through the basement membrane was （193±10）. Compared with the control group （144±11）， it could signifcantly accelerate the invasion of Y79 cells （P＜0.01）. There was no signifcant diference between the number of cells through the basement membrane which were transfected with miR-222+pcDNA3.1-RB1 and miR-NC+pcDNA3.1 （P＞0.05）. Conclusion：miR-222 promotes cell proliferation and invasion by targeting RB1 expression in retinoblastoma cells.

Retinoblastoma； miR-222； RB1； Growth； Invasion

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.09.004

R739.7+2

A

1007-3639（2016）09-0743-07

2015-09-09

2016-01-15）

湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃指導(dǎo)性項(xiàng)目（B2015477）；十堰市科技課題（14Y40）。通信作者：羅衛(wèi)民 E-mail：luoweimin0803@sina.com