陳寶瑯，李睿

氯沙坦對自發(fā)性高血壓大鼠腎臟組織Bax、Bcl-2表達(dá)的影響情況

陳寶瑯1，李睿1

目的探討氯沙坦對自發(fā)性高血壓（SHR）大鼠腎臟組織Bcl-2相關(guān)性蛋白X（Bax）和B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）表達(dá)的影響。方法選取近交系雄性SHR大鼠30只和Wistar-Kyoto雄性大鼠15只，SHR大鼠隨機(jī)分為氯沙坦組（n=15）和SHR陽性對照組（n=15），氯沙坦組按氯沙坦30 mg/kg灌胃，SHR陽性對照組按0.9%氯化鈉溶液10 ml/kg灌胃，Wistar-Kyoto大鼠作為正常對照組，按0.9%氯化鈉溶液10 ml/kg灌胃，每日清晨灌胃，連續(xù)灌胃8周。比較各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓，采用免疫組化染色法檢測兩組Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果氯沙坦組給藥第4周和8周尾動(dòng)脈收縮壓明顯低于給藥前收縮壓水平（P＜0.05）；氯沙坦組給藥第4周和8周尾動(dòng)脈收縮壓低于SHR陽性對照組（P＜0.05）；氯沙坦組和正常對照組Bcl-2平均光密度分別為（0.19 ±0.01）和（0.20±0.02 ），明顯高于SHR陽性對照組（P＜0.05），而Bax平均光密度分別為（0.12± 0.02）和（0.13±0.01），明顯低于SHR陽性對照組（P＜0.05）；氯沙坦組和正常對照組Bax和Bcl-2平均光密度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Bcl-2和Bax mRNA相對表達(dá)量在氯沙坦組和正常對照組間差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），SHR陽性對照組患者的Bcl-2相對表達(dá)值顯著高于氯沙坦組和正常對照組，而Bax mRNA相對表達(dá)值顯著低于氯沙坦組和正常對照組（P＜0.05）。結(jié)論氯沙坦對SHR大鼠有明顯的降壓作用，可抑制Bax基因及蛋白表達(dá)，而促進(jìn)Bcl-2基因及蛋白表達(dá)。

氯沙坦；自發(fā)性高血壓；大鼠；Bax；Bcl-2

高血壓是一種以動(dòng)脈壓升高為特征，可伴有心臟、血管、腦和腎臟等器官功能性或器質(zhì)性改變的全身性疾病，其發(fā)病率較高，在我國約有2億高血壓病患者，可占全球高血壓病總?cè)藬?shù)的1/5［1］。高血壓的發(fā)病原因有很多，高齡、高鹽攝入、肥胖、遺傳和環(huán)境因素都可能直接或間接的導(dǎo)致高血壓的發(fā)生，絕大多數(shù)高血壓患者病因不明，稱為自發(fā)性高血壓（SHR）［2］。長期高血壓會(huì)導(dǎo)致腎小動(dòng)脈硬化，并引起夜尿，多尿、尿中含蛋白、管型及紅細(xì)胞等臨床癥狀［3］。研究表明［4］，高血壓腎病的發(fā)生和發(fā)展過程與腎臟組織細(xì)胞凋亡因子Bax和Bcl-2的表達(dá)有密切的聯(lián)系，Bcl-2可抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而Bax卻可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，二者的比例在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。 氯沙坦可以阻斷血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）與其受體結(jié)合， 進(jìn)而影響B(tài)ax和Bcl-2相關(guān)蛋白的表達(dá)，并抑制細(xì)胞的凋亡，從而保護(hù)腎臟的功能，但其機(jī)制目前尚不清楚。

為了進(jìn)一步探討氯沙坦對自發(fā)性高血壓大鼠腎臟組織Bcl-2相關(guān)性蛋白X（Bax）和B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）表達(dá)的影響，本研究對進(jìn)行氯沙坦灌胃的SHR大鼠的尾動(dòng)脈收縮壓、Bax和Bcl-2表達(dá)情況與進(jìn)行氯化鈉溶液灌胃的SHR大鼠和正常大鼠進(jìn)行比較分析，為臨床上提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取近交系雄性SHR大鼠30只，清潔級11周齡，體重120～140 g，同時(shí)選取Wistar-Kyoto雄性大鼠15只，體重110～140 g。實(shí)驗(yàn)大鼠均由中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)分組SHR大鼠隨機(jī)分為2組，氯沙坦組和SHR陽性對照組，其中氯沙坦組按氯沙坦30 mg/kg灌胃，SHR陽性對照組按0.9%氯化鈉溶液10 ml/kg灌胃。Wistar-Kyoto大鼠作為正常對照組，按0.9%氯化鈉溶液10 ml/kg灌胃。三組大鼠均于每日清晨灌胃，連續(xù)灌胃8周。

1.3檢測方法

1.3.1儀器與試劑熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司FS-7900型）；顯微鏡（日本奧林巴斯公司125型）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海金壇儀器公司HH-25）。兔抗大鼠Bax和Bcl-2單克隆抗體、生物素化羊抗兔IgG以及DAB顯色試劑盒（北京陸橋科技有限公司）；Trizol試劑盒和PCR定量試劑盒（美國TaKaRa公司）。

1.3.2免疫組化染色及陽性鑒定所有組織作常規(guī)4 μm蠟狀切片，以兔抗大鼠Bax或Bcl-2單克隆抗體按1：50稀釋后作為一抗，以生物素化羊抗兔IgG按1：100稀釋后作為二抗，并以PBS代替一抗作陰性對照。染色成功后加DAB顯色，并以光鏡觀察陽性信號。

1.3.3PCR檢測方法采用Trizol試劑盒提取腎臟組織內(nèi)RNA，逆轉(zhuǎn)錄后采用熒光定量PCR儀和PCR定量檢測試劑盒進(jìn)行Bax和Bcl-2的定量分析，具體檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)處理分析采用SPSS19.0軟件。計(jì)量資料采用（±s）表示，組間比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓比較氯沙坦組和SHR陽性對照組給藥前尾動(dòng)脈收縮壓明顯高于正常對照組（P＞0.05）；氯沙坦組給藥第4周和8周尾動(dòng)脈收縮壓分別為（143.08±16.04）mmHg和（146.27±17.10）mmHg（1 mmHg=0.133kPa），明顯低于給藥前水平（P＜0.05）；氯沙坦組給藥第4周和8周尾動(dòng)脈收縮壓低于SHR陽性對照組（P＜0.05）（表1）。

2.2免疫組織化學(xué)染色Bax和Bcl-2表達(dá)陽性反應(yīng)物定位于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒，Bax和Bcl-2主要定位于腎小管上皮細(xì)胞，腎小球也有少量表達(dá)。各組Bax和Bcl-2表達(dá)免疫組化染色圖，見圖1。正常對照組Bcl-2平均光密度分別為（0.20± 0.02 ），明顯高于SHR陽性對照組，而Bax平均光密度分別為（0.13±0.01），明顯低于SHR陽性對照組，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；氯沙坦組Bax平均光密度為（0.12±0.02），較SHR陽性對照組降低，而Bcl-2平均光密度為（0.19± 0.01），較SHR陽性對照組升高，差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

2.3各組大鼠Bcl-2、Bax mRNA相對表達(dá)量SHR陽性對照組的Bcl-2相對表達(dá)值顯著高于正常對照組，而和Bax mRNA2相對表達(dá)值顯著低于正常對照組（P＜0.05）；氯沙坦組Bcl-2較SHR陽性對照組有所降低，Bax mRNA較SHR陽性對照組有所升高（P＜0.05）（表3）。

3　討論

高血壓病是最常見的慢性病之一，發(fā)病率較高，多發(fā)于中老年人群，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量［4］。持續(xù)過高的血壓可造成患者的心臟、血管、腦和腎臟等器官功能性或器質(zhì)性的改變，引起中風(fēng)、心臟病、血管瘤、腎衰竭等疾病，甚至造成死亡［5］。高血壓病因很多，多與環(huán)境和遺傳因素有關(guān)，但大多數(shù)病因不明，稱為自發(fā)性高血壓［6］。高血壓對腎臟的損害主要是造成腎小動(dòng)脈硬化，并引起夜尿，多尿、尿中含蛋白、管型及紅細(xì)胞等臨床癥狀［7］。有研究表明［8］，腎小動(dòng)脈的硬化與腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞的減少有密切的關(guān)系，而細(xì)胞凋亡因子Bax和Bcl-2的表達(dá)在這一過程中發(fā)揮著重要作用，Bax蛋白的高表達(dá)和Bcl-2的低表達(dá)能明顯促進(jìn)腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而促進(jìn)腎病的發(fā)展。

表1　各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓比較（±s　，mmHg）

表1　各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓比較（±s　，mmHg）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與本組給藥前比較，bP＜0.05；與SHR陽性對照組比較，cP＜0.05

組別　只數(shù)　給藥前　給藥第4周　給藥第8周正常對照組　15　120.11±12.30　119.05±13.01　120.91±12.27 SHR陽性對照組　15　161.08±15.81a　159.83±17.12a　160.45±16.13a氯沙坦組　15　160.12±13.27a　143.08±16.04abc　146.27±17.10abcF值　-　16.843　17.346　16.556 P值　-?。?.05　＜0.05?。?.05

圖1　各組Bax和Bcl-2表達(dá)免疫組化染色圖（1：正常對照組Bax表達(dá)；2：SHR陽性對照組Bax表達(dá)；3：氯沙坦組Bax表達(dá)；4：正常對照組Bcl-2表達(dá)；5：SHR陽性對照組Bcl-2表達(dá)；6：氯沙坦組Bcl-2表達(dá)）

表2　各組Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的平均光密度值（±s）

表2　各組Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的平均光密度值（±s）

注：與SHR陽性對照組比較，aP＜0.05

組別　n　Bax　Bcl-2正常對照組　15　0.13±0.01a　0.20±0.02aSHR陽性對照組　15　0.20±0.01　0.12±0.01氯沙坦組　15　0.12±0.02a　0.19±0.01aF值　-　9.227　8.943 P值　-　＜0.05　＜0.05

表3　各組大鼠的Bcl-2、Bax mRNA相對表達(dá)量（±s）

表3　各組大鼠的Bcl-2、Bax mRNA相對表達(dá)量（±s）

注：與SHR陽性對照組比較，aP＜0.05

組別　n　Bcl-2　Bax正常對照組　15　0.47±0.09a　0.31±0.01aSHR陽性對照組　15　0.62±0.11　0.24±0.03氯沙坦組　15　0.46±0.07a　0.32±0.02at值　-　11.462　12.069 P值　-?。?.05?。?.05

細(xì)胞凋亡主要是指細(xì)胞在多種死亡信號刺激后發(fā)生的一系列主動(dòng)性細(xì)胞死亡過程，其在機(jī)體的生長、發(fā)育和維持內(nèi)部平衡過程中起著重要的作用［9］。細(xì)胞凋亡在各種生理和病理過程均較為常見，且具有非常重要的生物學(xué)意義，其與細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)平衡可維持細(xì)胞群體數(shù)量的自身穩(wěn)定，并清除癌變細(xì)胞、自身反應(yīng)免疫細(xì)胞及病毒感染細(xì)胞等進(jìn)行機(jī)體防御，而細(xì)胞凋亡的紊亂或可導(dǎo)致或促進(jìn)多種疾病的發(fā)生［10］。細(xì)胞凋亡過程與相關(guān)基因的調(diào)節(jié)和控制有關(guān)，而Bcl-2家族的Bcl-2和Bax是目前研究最多的凋亡基因［11］。Bcl-2蛋白是一種膜整和蛋白，是最重要的凋亡抑制基因， 但對細(xì)胞周期和分化并不產(chǎn)生影響［12］。Bax可對抗Bcl-2蛋白的抑制凋亡作用，其過度表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2與Bax蛋白的動(dòng)態(tài)平衡進(jìn)一步調(diào)節(jié)了細(xì)胞凋亡的過程［13］。

有研究表明［14］，氯沙坦作為一種血管緊張素Ⅱ受體1阻斷劑能影響高血壓性腎病患者的細(xì)胞凋亡過程，其能有效改善腎內(nèi)血流以緩解腎小球內(nèi)的高壓，減少凋亡的發(fā)生；其還能抑制AngⅡ與其胞膜受體結(jié)合，防止細(xì)胞內(nèi)鈣離子的聚集，進(jìn)一步防止凋亡的發(fā)生。但也有研究表明，氯沙坦降低腎內(nèi)細(xì)胞凋亡的作用方式與其對腎組織內(nèi)Bax和Bcl-2蛋白的調(diào)節(jié)有關(guān)，經(jīng)氯沙坦治療的大鼠內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高，而Bax蛋白表達(dá)明顯降低，這與本研究的研究結(jié)果基本一致。本研究將選取的近交系雄性SHR大鼠隨機(jī)分為氯沙坦組和SHR陽性對照組，并分別實(shí)施氯沙坦和0.9%氯化鈉溶液灌胃，將其尾動(dòng)脈收縮壓、Bax和Bcl-2表達(dá)情況與正常大鼠進(jìn)行比較分析。研究結(jié)果表明，氯沙坦組給藥第4周和8周的尾動(dòng)脈收縮壓低于給藥前水平，且明顯低于SHR陽性對照組，說明氯沙坦能明顯改善腎內(nèi)血流，并有效的緩解腎小球內(nèi)的高壓。通過免疫組織化學(xué)染色觀察 Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，氯沙坦組和正常對照組Bcl-2平均光密度明顯高于SHR陽性對照組，而Bax平均光密度明顯低于SHR陽性對照組；進(jìn)一步對各組大鼠Bcl-2、Bax mRNA相對表達(dá)量進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，氯沙坦組Bcl-2較SHR陽性對照組有所降低，Bax mRNA較SHR陽性對照組有所升高，提示氯沙坦可能會(huì)促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá)并抑制Bax的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)Bax/Bcl-2的比例，減少腎臟組織細(xì)胞的凋亡，從而保護(hù)患者的腎臟功能。但本研究限于研究樣本的不足，對氯沙坦促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)和抑制Bax蛋白表達(dá)的機(jī)制仍需做進(jìn)一步深入的研究。

綜上所述，氯沙坦對SHR大鼠有明顯的降壓作用，可抑制Bax基因及蛋白表達(dá)并促進(jìn)Bcl-2基因及蛋白表達(dá)，從而下調(diào)Bax/Bcl-2比例，進(jìn)一步保護(hù)腎臟功能，但其影響機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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本文編輯：劉璐鑫，田國祥

The effect of losartan on the expression of Bax and Bcl-2 in renal tissue of SHR rats

CHEN Bao-lang*， LIRui.*Department of physiology， Heze Medical College， Heze， Shandong， 274000， China.

CHEN Bao-lang， E-mail: 836905865@qq.com

ObjectiveTo investigate the effect of losartan on expression of Bax and Bcl-2 in renal tissue of spontaneously hypertensive （SHR）rats. Methods30 male SHR rats and 15 male Wistar-Kyoto rats were selected. SHR rats were randomly divided into two groups： losartan group （n=15） and SHR positive control group （n=15），losartan group was administered losartan 30 mg/kg by gavage； SHR positive control group was administered 10mL/ kg of 0.9% sodium chloride solution by gavage； as normal control group， Wistar-Kyoto rats were administered 10 mL/kg of 0.9% sodium chloride solution by gavage. All the rats were intragastrically administered every morning for 8 weeks. We compared systolic blood pressure of each group， expression of Bax and Bcl-2 in two groups were detected by immunohistochemical staining. The level of Bax mRNA and Bcl-2 mRNA were detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction （PCR）. ResultsTail artery systolic pressure of losartan group after administered 4 weeks and 8 weeks was significantly lower than before administration （P<0.05）. Tail artery systolic pressure of losartan group after administered 4 weeks and 8 weeks was significantly lower than SHR positive control group （P<0.05）. The average optical density of Bcl-2 in losartan group and normal control group were （0.19 ±0.01） and （0.20±0.02） respectively， which were significantly higher than SHR positive control group （P<0.05）. The average optical density of Bax in losartan group and normal control group were（0.12±0.02） and （0.13±0.01）respectively， which were significantly lower than SHR positive control group （P<0.05）. There was no significant difference in average optical density of Bax and Bcl-2 between the losartan group and the normal control group（P＞0.05）. As to relative expression of Bcl-2 mRNA and Bax mRNA， there was no significant difference between losartan group and the normal control group（P＞0.05）. The relative expression of Bcl-2 mRNA in SHR positive control group was significantly higher than losartan group and the normal control group； but the relative expression of Bax mRNA in SHR positive control group was significantly lower than Losartan group and the normal control group （P<0.05）. ConclusionLosartan has a significant effect on the reduction of blood pressure in SHR rats， which can inhibit the expression of mRNA and protein of Bax， and promote the expression of mRNA and protein of Bcl-2.

Losartan； Spontaneously hypertensive； Rats； Bax； Bcl-2

?論著?

R544.1

A

1674-4055（2016）08-0965-03

1274000菏澤，山東省菏澤市醫(yī)學(xué)專科學(xué)校生理學(xué)教研室

陳寶瑯，E-mail：836905865@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.08.22