李晨光　劉　菲　張鳳香

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腦外科，遼寧　錦州　121001)

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鈣敏感受體對巨噬細胞內(nèi)胱硫醚-γ-裂解酶表達的調(diào)控

李晨光劉菲張鳳香

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腦外科，遼寧錦州121001)

目的研究鈣敏感受體(CaR)是否通過增強鈣調(diào)蛋白(CaM)的表達提高胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的活性，進而抑制巨噬細胞向泡沫細胞的轉(zhuǎn)化。方法Western印跡法檢測各組細胞中CSE、PI3K和p-AKT的表達；敏感硫電極法檢測巨噬細胞中H2S含量的變化；油紅O染色檢測陽性細胞的相對含量；HPLC測定細胞內(nèi)膽固醇含量。結(jié)果與空白對照組比較，GdCl3組明顯增強CSE的表達，而PI3K和p-AKT的表達被明顯抑制；CaM抑制劑U73122組和GdCl3+U73122組PI3K和p-AKT的表達明顯增強，而CSE的表達被明顯抑制。敏感硫電極法檢測H2S的相對含量結(jié)果顯示：與空白對照組比較，GdCl3組作用泡沫細胞48 h后H2S的相對含量明顯增加；而U73122組和GdCl3+U73122組H2S的相對含量明顯降低。油紅O染色檢測和HPLC檢測結(jié)果顯示：與空白對照組比較，GdCl3組作用泡沫細胞48 h后，巨噬細胞泡沫化程度明顯降低，而U73122組和GdCl3+U73122組巨噬細胞泡沫化程度均明顯增加。結(jié)論CaR可以通過增強CaM的表達激活細胞內(nèi)CSE的活性，進而抑制巨噬細胞向泡沫細胞轉(zhuǎn)化。

鈣敏感受體；鈣調(diào)蛋白；胱硫醚-γ-裂解酶

研究顯示〔1〕，硫化氫(H2S)/胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)對心血管疾病(如動脈粥樣硬化)的發(fā)展具有拮抗作用，可抑制大鼠血管平滑肌細胞增殖、抑制新生內(nèi)膜形成、抑制泡沫細胞形成等〔2，3〕。但CSE/H2S體系抑制動脈粥樣硬化形成的具體機制尚不十分清楚。鈣調(diào)蛋白(CaM)是細胞內(nèi)Ca2+的重要受體，研究表明〔4〕，細胞內(nèi)鈣增加可以活化CaM活性，然后通過活化的Ca2+/CaM通路對CSE的活性進行調(diào)節(jié)，從而調(diào)控H2S的生成，最終影響動脈粥樣硬化的形成。研究已經(jīng)證實〔5〕，鈣敏感受體(CaR)在巨噬細胞內(nèi)不僅存在表達，而且還能夠通過G蛋白-PLC-IP3通路引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，進而增加細胞內(nèi)Ca2+。Kamano等〔6〕報道，提高Ca2+可增加外周血中單核細胞的化學(xué)趨向性。此外，細胞內(nèi)鈣的增加可以活化CaM的活性，然后通過活化的Ca2+/CaM通路抑制動脈粥樣硬化的形成。

我們前期研究證明，CaR可以通過增強巨噬細胞內(nèi)CSE的表達促進H2S的分泌，進而抑制動脈粥樣硬化的形成。本文主要探討CaR是否能通過CaM促進巨噬細胞內(nèi)CSE的表達，從而促進H2S的分泌，抑制動脈粥樣硬化的形成。

1　材料與方法

1.1細胞及主要試劑CaM抑制劑U73122購自美國Sigma公司；THP-1人單核巨噬細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；CaR激動劑GdCl3購自上海生物工程有限公司；人氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)購于北京協(xié)生生物科技有限責(zé)任公司；ECL發(fā)光試劑盒購自康為世紀公司。BCA蛋白含量檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2實驗方法①細胞培養(yǎng)、處理及分析：THP-1人單核巨噬細胞置于5% CO2、37℃飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，濃度控制在106/ml，每2 d換液一次，細胞呈上皮樣貼壁生長。待細胞增長至80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化1～2 min 后傳代，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。每隔3～5 d傳代一次，取傳代后巨噬細胞，加入終濃度為80 mg/L的ox-LDL，共同孵育48 h，即得泡沫細胞模型。將誘導(dǎo)的泡沫細胞分為4組：空白對照組；GdCl3(10 μg/ml)組；GdCl3+U73122(30 μg/ml)組；U73122(30 μg/ml)組，分別培養(yǎng)48 h，收集細胞。②H2S的檢測：取各組培養(yǎng)48 h的細胞上清液，采用敏感硫電極法進行檢測，敏感硫電極(Pag/S1上海雷磁)。③細胞油紅O染色：各組細胞分別培養(yǎng)48 h后，經(jīng)過PBS反復(fù)沖洗，10%甲醛固定，新過濾的油紅O染色細胞10 min，蘇木精明礬染液染色5 min，封片封固。光學(xué)顯微鏡下觀察細胞油紅O染色陽性率。④HPLC分析：收集細胞，棄上清，NaCl 500 μl重懸細胞，離心機離心，蛋白定量檢測。經(jīng)過己烷混合烘干后沉淀。再經(jīng)異丙醇、乙腈溶解，離心后收集上清液，測定膽固醇酯(CE)、游離膽固醇(FC)和總膽固醇(TC)的含量。⑤Western印跡檢測：收集細胞，提取總蛋白，SDS電泳分離，分別加入1∶500兔抗鼠CaR抗體、1∶1 000鼠抗人p-AKT單克隆抗體、1∶500兔抗人PI3K多克隆抗體和1∶1 000兔抗鼠CSE單克隆抗體，反復(fù)漂洗后加發(fā)光劑，感光、顯影、定影。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS13.0軟件，組間比較采用ANOVA方法分析。

2　結(jié)　果

2.1CaR激動劑聯(lián)合CaM抑制劑對巨噬細胞中CSE表達的影響與空白對照組(0.803±0.021)比較，GdCl3組(1.741±0.056)明顯增強CSE的表達；而U73122組(0.635±0.012)和GdCl3+U73122組(0.607±0.011)CSE 的表達均明顯降低。見圖1。

2.2CaR激動劑聯(lián)合CaM抑制劑對巨噬細胞內(nèi)H2S分泌的影響與空白對照組(13.12±1.04)比較，GdCl3組H2S的相對含量(21.78±1.82)明顯增加；U73122組(6.02±0.73)和GdCl3+U73122組(6.57±0.89)H2S的相對含量明顯降低(P<0.05)。

2.3CaR激動劑聯(lián)合CaM抑制劑對巨噬細胞泡沫化程度的影響GdCl3組、U73122組和GdCl3+U73122組作用泡沫細胞48 h后，細胞油紅O染色陽性率分別為(17.14±3.30)%、(82.54±1.63)%和(84.15±2.17)%，與空白對照組〔(58.33±2.86)%〕比較，GdCl3組細胞油紅O染色陽性率明顯降低(P<0.05)；而U73122組、GdCl3+U73122組細胞油紅O染色陽性率均明顯增加(P<0.05)。

2.4CaR激動劑聯(lián)合CaM抑制劑對巨噬細胞泡沫化過程中脂質(zhì)蓄積的影響與空白對照組比較，GdCl3組細胞內(nèi)CE、FC和TC含量均明顯下降，而U73122組、GdCl3+U73122組細胞內(nèi)CE、FC和TC均明顯增加(P<0.05)。見圖2。

2.5CaR激動劑聯(lián)合CaM抑制劑對巨噬細胞PI3K及p-Akt蛋白表達的影響如圖3所示，與空白對照組比較，GdCl3組能明顯抑制PI3K和p-AKT的表達；而U73122組和GdCl3+U73122組PI3K和p-AKT的表達均被明顯增強(P<0.05)。

圖1　Western印跡檢測單核巨噬細胞中CSE的表達

與空白對照組相比：1)P<0.05；下圖同圖2　HPLC檢測CaR激動劑聯(lián)合CaM抑制劑對巨噬細胞泡沫化過程中脂質(zhì)蓄積的影響

圖3　Western印跡檢測單核巨噬細胞中PI3K和p-AKT蛋白表達情況

3　討　論

CaM是一種廣泛存在于生物體的Ca2+結(jié)合蛋白，對細胞功能具有廣泛的調(diào)節(jié)作用。當胞質(zhì)內(nèi)Ca2+升高時，Ca2+和CaM結(jié)合，形成活性CaM，其構(gòu)象發(fā)生改變，再與靶蛋白或靶酶結(jié)合，引起CaM進一步變構(gòu)及靶蛋白變構(gòu)，從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)〔7〕，當巨噬細胞受到刺激引起胞質(zhì)Ca2+濃度增加時，CaM可與Ca2+結(jié)合，形成有活性的CaM，然后通過活化的Ca2+/CaM通路對CSE 的活性進行調(diào)節(jié)，從而促進H2S的生成，最終抑制巨噬細胞向泡沫細胞的轉(zhuǎn)化。

CaR在人體分布廣泛，主要分布在甲狀旁腺、腎臟、胃腸道、骨組織以及其他細胞等。研究已經(jīng)證實〔8〕，在巨噬細胞內(nèi)高表達的 CaR可以通過增強CaM 的活性抑制巨噬細胞向泡沫細胞轉(zhuǎn)化。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，高表達的CaR可以通過增強CSE的表達促進巨噬細胞內(nèi)H2S的分泌，但該作用的完成是否與CaM的表達變化有關(guān)尚不得而知。

本研究發(fā)現(xiàn)，增強CaR的表達可以明顯增強CSE的表達，但當CaM的表達被抑制時CaR增強 CSE表達的作用被明顯降低，說明CaR可能是通過增強CaM的表達提高CSE的活性。本研究通過敏感硫電極法檢測發(fā)現(xiàn)，高表達的CaR可以明顯促進H2S的分泌，但當阻斷CaM的表達時CaR促進 H2S分泌的這種作用均被明顯抑制。又通過油紅O染色和HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，增加CaR的表達可以明顯抑制巨噬細胞的泡沫化程度，但當CaM的表達被阻斷時CaR抑制巨噬細胞向泡沫化細胞轉(zhuǎn)變的能力被明顯降低 。研究已經(jīng)證實〔9〕，CaM通過增強CSE 的活性促進H2S的生成，進而抑制巨噬細胞向泡沫細胞的轉(zhuǎn)化。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CaR可以通過增強CaM的表達提高CSE的活性。因此，我們認為高表達的CaR可以通過增強CaM的表達提高CSE的表達，進而促進H2S的分泌，最終達到抑制巨噬細胞向泡沫細胞轉(zhuǎn)化的作用。

PI3K/AKT信號通路是維持細胞生存、增殖最重要的信號傳導(dǎo)通路之一〔10，11〕。PI3K 是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，是許多生命活動中關(guān)鍵的信號分子，可以通過激活或抑制其下游一系列底物調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等活動。研究還發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路在巨噬細胞中存在廣泛表達，是巨噬細胞調(diào)節(jié)具有第二信使特征脂類衍生物生成的重要信號通路，是動脈粥樣硬化形成的分子基礎(chǔ)〔12，13〕。近年來研究已經(jīng)證實，CaR的激活將影響PI3K/AKT信號通路的活性，而PI3K/AKT信號通路在巨噬細胞的泡沫化過程中起重要作用〔14〕。 本研究結(jié)果說明，高表達的CaR可能是通過增強CaM的表達抑制 PI3K/AKT信號通路的活性，進而抑制巨噬細胞向泡沫細胞的轉(zhuǎn)化，阻礙動脈粥樣硬化的形成。

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〔2016-03-17修回〕

(編輯徐杰)

The regulating of calcium sensing receptor on the expression of CSE of macrophages

LI Chen-Guang, LIU Fei, ZHANG Feng-Xiang.

The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning, China

ObjectiveTo study the regulation of calcium sensing receptor on the expression of CSE of macrophages.MethodsThe expressions of CSE,PI3K and p-AKT were detected by Western blot.Sensitive sulphur electrode method was used to detect the change of the H2S content in macrophages;the relative content of positive cells was tested by oil red O staining and HPLC was used to measure the intracellular cholesterol content.ResultsThe expression of CSE was significantly enhanced in GdCl3group,while the expressions of PI3K and p-AKT were significantly inhibited in GdCl3group.The expressions of PI3K and p-AKT were significantly enhanced in GdCl3+U73122 and U73122 groups,while the expression of CSE was significantly inhibited in GdCl3+U73122 and U73122 groups.Compared with that of blank control group,the relative content of H2S after acted on foam cells 48h was increased in GdCl3group;while the relative contents of H2S in U73122 and GdCl3+ U73122 groups were significantly reduced.Compared with that of blank control group,the number of positive cells in GdCl3group was significantly decreased,while the number of positive cells were significantly increased in U73122 and GdCl3+ U73122 groups.ConclusionsCaR could depend on enhancing the expression of CSE to increase the secretion of H2S,thereby inhibit the transformation of macrophages into foam cells.

Calcium sensing receptor;Calmodulin；CSE

國家自然科學(xué)基金(81541099)

張鳳香(1978-)，女，博士，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事動脈粥樣硬化研究。

李晨光(1979-)，男，碩士，住院醫(yī)師，主要從事腦血管病研究。

〔文獻標識碼〕A〔文章編號〕1005-9202(2016)16-3871-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.002