張亞東，高玉松，王海偉，羅新民，胡承嘯

河南駐馬店市解放軍159中心醫(yī)院神經外科，河南駐馬店463000

PTEN、VEGF在人腦星形細胞瘤的表達及意義

張亞東，高玉松，王海偉，羅新民，胡承嘯

河南駐馬店市解放軍159中心醫(yī)院神經外科，河南駐馬店463000

目的 探討PTEN及VEGF與腦星形細胞瘤發(fā)生、發(fā)展的關系，尋找抑制腦星形細胞瘤生長和侵襲的有效方法。方法 方便選取2012年11月—2015年11月該院收治的49例星形細胞瘤采用免疫組化SP法檢測了49例腦星形細胞瘤及正常腦組織中PTEN基因蛋白及血管內皮細胞生長因子的表達情況，并探討了PTEN與VEGF的相互關系。結果 腦星形細胞瘤組織中PTEN蛋白表達率顯著低于正常腦組織（P＜0.05），且瘤組織分化程度越低，PTEN陽性率越低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；VEGF蛋白表達在正常腦組織為陰性，且在Ⅰ～Ⅱ級與Ⅲ～Ⅳ級星形細胞瘤（r=-0.342，P＜0.05）、瘤組織與正常組織相比均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；PTEN蛋白的表達和VEGF蛋白表達之間呈負相關關系（P＜0.05）。結論 腦星形細胞瘤組織中PTEN蛋白表達的減少或缺失，均可導致VEGF的表達上升，進而生成腫瘤血管，最終為腦星形細胞瘤的生長和浸潤提供重要的基礎。

星形細胞瘤；PTEN；VEGF；免疫組化

［Abstract］Objective PTEN and VEGF and astrocytoma，development of relations，to find an effective method of brain astrocytoma growth and invasion inhibition.Methods Convenient select November 2012 to November 2015 in the hospital were 49 cases of astrocytoma in 49 cases of astrocytoma and normal brain tissue PTEN protein and vascular endothelial cell growth factor expression was detected by immunohistochemical staining（SP method），and to investigate the relationship between PTEN and VEGF.Results Astrocytoma of PTEN protein expression was significantly lower than in normal brain tissue（P＜0.05），and the lower the degree of differentiation of tumor tissue，the lower the rate of PTEN，a statistically significant difference（P＜0.05）；VEGF protein expression in normal brain tissue was negative，and in gradeⅠ～Ⅱ andⅢ～Ⅳgrade astrocytomas（P＜0.05），tumor tissue and normal tissue（P＜0.01）were significantly different compared；.PTEN protein negative correlation（r=-0.342，P＜0.05）between the expression and protein expression of VEGF.Conclusion Astrocytoma of PTEN protein expression is reduced or absent，can lead to increased expression of VEGF，thereby generating tumor blood vessels，and ultimately provide an important basis for the growth of brain astrocytoma and infiltration.

［Key words］Astrocytoma；PTEN；VEGF；Immunohistochemistry

既往研究已證明，PTEN（第10染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因）的失活與人類許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關［1-2］，并且它還可通過抑制腫瘤血管生成而抑制腫瘤生長、浸潤。VEGF（血管內皮細胞生長因子）作為一種特異性血管生產因子，得到醫(yī)學界的廣泛研究，且據相關研究顯示，人類多種腫瘤的發(fā)生與轉移均與該血管生產因子有關［3］。而目前在腦星形細胞瘤中，PTEN基因與腫瘤血管生成的關系的研究較少。該文方便選取2012年11月—2015年11月該院收治的49例星形細胞瘤本患者采用免疫組化SP法對49例腦星形細胞瘤及正常腦組織中PTEN基因蛋白及VEGF進行了檢測，探討其與腦星形細胞瘤的關系。現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般治療

方便選取49例星形細胞瘤手術標本取自解放軍第159中心醫(yī)院收治的的患者標本，其中男29例，女20例，年齡20～71歲。病理分級依WHO星形細胞瘤病理級別判定標準分級，其中Ⅰ級15例，Ⅱ級14例，Ⅲ級11例，Ⅳ級9例。所有病例均為首次發(fā)病，術前未經化療、放療或生物治療。正常腦組織10例為腦外傷減壓術中切除的腦組織。49例標本均在離體0.5 h內迅速取材，并將其置于凍存管，而后將凍存管存放于冰箱（溫度為-80℃）。剩余組織在中性緩沖甲醛液 （濃度4%）的作用下固定，而后進行石蠟包埋切片，將其用于免疫組織化學染色與臨床診斷。

1.2試劑

鼠抗人VEGF單克隆抗體，SP免疫組化試劑盒，鼠抗人PTEN克隆抗體。

1.3檢測方法

采用鏈酶親和素-生物素過氧化物酶復合物法（SP法）。陰性對照：I抗采用正常羊血清來代表，結果為陰性；陽性對照：用已知陽性的結腸癌作VEGF陽性對照，PTEN陽性表達的則將已知乳腺癌組織作為陽性對照；空白對照：I抗采用PBS來代表，結果為陰性。免疫組織化學染色步驟如下：①對石蠟切片標本進行脫蠟至水；②將標本放在H2O2（濃度為3%）內，保持常規(guī)室溫，30 min。采用PBS洗3次，5 min/次；③備用塑料盒，并將枸櫞酸鹽抗原修復液置于塑料盒，將標本放在塑料盒內，并進行高壓修復，持續(xù)時間為20 min；④待其自然冷卻后，采用PBS洗3次，5 min/次；⑤將封閉血清（濃度為10%）滴在標本上，常規(guī)室溫，持續(xù)30 min；⑥將血清去除，并將1：100稀釋度的VEGF與PTEN的單克隆抗體分別滴加在切片上，將其置于溫度為4℃的濕盒內，過夜，采用PBS洗3次，5 min/次；⑦將生物素化二抗工作液滴上，將其置于溫度為37℃的濕盒內，持續(xù)30 min，采用PBS洗3次，5 min/次；⑧將鏈霉卵白素工作液滴上，將其置于溫度為37℃的濕盒內，持續(xù)10 min，采用PBS洗3次，5 min/次；⑨切片滴加DAB底物工作液，對其顯色進行控制，并用自來水將其顯色反應終止；⑩采用蘇木素實施復染，并用酒精進行脫水處理，二甲苯透明，中性樹膠對其封固。

1.4結果判定

參照文獻［4］，確定凡細胞質或胞核出現(xiàn)明顯的棕色顆粒為PTEN蛋白陽性細胞。每一例切片選5個高倍視野，按陽性細胞數(shù)占同類細胞計數(shù)的百分比，將免疫組化結果分為：強陽性（+++），陽性細胞數(shù)為＞50%，中度陽性（++），陽性細胞數(shù)為25%～50%，；弱陽性（+），陽性細胞數(shù)為5%～25%，陰性（-），陽性細胞數(shù)＜5%。VEGF陽性顯色為棕黃色顆粒，定位于胞漿。

1.5統(tǒng)計方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據分析，其中腦星形細胞瘤及正常腦組織中PTEN蛋白的表達及VEGF蛋白的表達等計數(shù)資料采用χ2檢驗；PTEN蛋白的表達與VEGF蛋白表達的相關性采用Spearman相關分析，P＜0.05表示對比差異有統(tǒng)計學意義。

2　實驗結果

2.1腦星形細胞瘤及正常腦組織中PTEN蛋白的表達

腦星形細胞瘤組織中PTEN蛋白表達率53.1%（26/ 49），顯著低于正常腦組織100.0%（P＜0.05），且強度也明顯弱于正常腦組織。在Ⅰ～Ⅱ級、Ⅲ～Ⅳ級腦星形細胞瘤組織中PTEN蛋白表達的結果顯示，瘤組織分化程度越低，PTEN陽性率越低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1　腦星形細胞瘤及正常腦組織PTEN蛋白的表達與臨床病理特征的關系

2.2腦星形細胞瘤及正常腦組織中VEGF蛋白的表達

在正常腦組織中VEGF蛋白表達陰性。Ⅰ～Ⅱ級、Ⅲ～Ⅳ級星形細胞瘤中VEGF蛋白表達的陽性率分別為51.6%、88.9%，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；瘤組織與正常腦組織相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表2。

表2　腦星形細胞瘤及正常腦組織中VEGF蛋白表達

2.3 PTEN蛋白的表達與VEGF蛋白表達的相關性分析

PTEN蛋白的表達與VEGF的關系。PTEN蛋白表達陰性的病例中，VEGF蛋白的陽性表達率為82.6%（19/23），PTEN蛋白表達陽性的病例中，VEGF蛋白的陽性表達率為50.0%（13/26）。經統(tǒng)計學分析，PTEN蛋白的表達和VEGF蛋白表達之間呈負相關關系（γ=-0.342，P=0.016）。見表3。

表3　PTEN蛋白的表達與VEGF的關系

3　討論

3.1 PTEN與腦星形細胞瘤

PTEN基因作為一種新型腫瘤抑制基因在維持細胞的增殖、分化和凋亡平衡中起重要作用，并可能參與調節(jié)細胞生長，腫瘤浸潤、轉移和血管形成［5］。當PTEN基因在翻譯、轉錄、局域化分布和半衰期發(fā)生異常改變或失去嚴格控制時，則其在體內不能發(fā)揮正常的功能。這些PTEN基因的異常改變可以影響到腦星形細胞瘤的發(fā)生、發(fā)展、凋亡等生物學行為。有研究表明，PTEN基因的失活與人類許多惡性腫瘤的發(fā)生有關［6］，其失活時可表現(xiàn)為PTEN mRNA或蛋白表達降低，甚至不表達以及PTEN基因的缺失或（和）突變。該研究檢測了正常人腦組織和人腦星形細胞瘤組織中PTEN蛋白表達（采用免疫組化法），結果顯示，PTEN蛋白的陽性表達在星形細胞瘤組織中明顯低于正常腦，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且在Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級瘤組織中PTEN蛋白的表達呈逐漸降低趨勢，其中Ⅰ～Ⅱ級與Ⅲ～Ⅳ級差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。上述結果提示，與正常腦組織相比，部分瘤組織PTEN蛋白缺失或表達減弱，PTEN蛋白表達降低也可能參與腦細胞的惡性轉化過程，WHO分級越高，其表達越低，我們可以觀察到該基因的失活在腦星形細胞瘤的惡性階段最為明顯，這結果提示該基因與星形細胞瘤的進展密切相關，可以作為患者病情發(fā)展及預后的判斷指標，并且提示是否可以作為潛在靶點用于基因治療，值得進一步研究。

3.2 VEGF蛋白與腦星形細胞瘤

實體腫瘤若無新生血管，僅能自發(fā)生長至直徑2 mm體積，若其繼續(xù)生長、增殖及侵襲則有賴于新生血管的生成［7］。腦星形細胞瘤屬特殊腫瘤之一，富含血管，主要以局部浸潤為主，很難對其遠隔轉移觀察到，VEGF則在腫瘤的血管生成過程中發(fā)揮了很大的作用，它對細胞有絲分裂原可產生最直接的作用，進而使微血管、初級毛細血管、小靜脈以及后靜脈的通透性得以提升；對血管內皮細胞的增殖反應產生襲擊，進而提成血管的形成率［8-10］。VEGF（即血管通透因子）具有以下兩種功能：①經受體對血管內皮細胞的增殖反應產生最直接的刺激作用，對蛋白水解酶、組織因子及間質膠原酶的產生產生誘導作用，進而提升血管的生成率；②能夠使血管的通透性得以有效增加，進而使纖維蛋白原及血漿蛋白發(fā)生外滲，引發(fā)腫瘤間質出現(xiàn)水腫反應，改變細胞外基質，最終為腫瘤浸潤與生長提供重要基礎［19］。該研究可以觀察到VEGF在高度惡性星形細胞瘤陽性表達率達77.77%，而在低級別星形細胞瘤中VEGF陽性表達率僅為25.00%，結果提示：VEGF表達與星形細胞瘤組織分化程度密切相關。同時通過分析VEGF表達與星形細胞瘤組織分化程度的相關性提示我們應用VEGF抗體封閉其蛋白的表達，可能通過抑制腫瘤血管形成的機理，降低惡性星形細胞瘤的生長速度與侵襲性，提高患者的生存率。

3.3腦星形細胞瘤中PTEN和VEGF蛋白表達的相關性

通過該組研究結果可以看到VEGF蛋白的表達與PTEN蛋白的陽性表達呈負相關關系，也就是說在PTEN蛋白表達陰性的病例中VEGF蛋白的陽性表達率明顯高于PTEN蛋白表達陽性的病例（P＜0.05）；這就提示PTEN蛋白表達的降低或缺失可能上調VEGF的表達，從而促進星形細胞瘤血管的生成，為腫瘤的生長和浸潤提供了條件。

綜上所述，通過本實驗表明PTEN蛋白表達的降低或缺失和VEGF表達的上調是腦星形細胞瘤在發(fā)生發(fā)展過程中的兩個重要因素，聯(lián)合檢測PTEN、VEGF可作為判定腦星形細胞瘤預后判斷的一項客觀指標，而PTEN作為一個抑癌基因則可能通過影響VEGF表達的信號傳導途徑而抑制腦星形細胞瘤血管的形成。

［1］Cheney IW，Neuteboom ST，VAillancourt MT，et al.Adenovirus-mediated gene tranfer of MMACl/PTEN to gliblastuma cells inhibits S phase entry by the recruitment of P27 kipl into cyclin E/CDK2 complexes［J］.Cancer Res，1999，59（10）：2318-2323.

［2］Kunes K，Zhou xP，Araki T，et al.Frequent loss of PTEN expression is linked to elevated phosphory lated Aktlevels but not associated with P27 and cyclinD1 expression，in primary epithelial ovarian carcinomas［J］.Am J Pthol，2001，158（6）：2097-2106.

［3］Harold F，Dvorak，Lawrence F，et al.Vascular permeability factor，micro vascular hyperpeameability and angiogensis［J］. Am J Pathol，2015，146（5），1029-1039.

［4］鄭華川，陳穎，紀立革，等.PTEN編碼產物在胃癌發(fā)生發(fā)展不同階段中的表達及意義［J］.中華腫瘤雜志，2013，25（1）：13-16.

［5］Simpson L，Parsons R.PTEN：life as a tumor suppressor［J］. Exp Cell Res，2012，264（1）：29-34.

［7］黃純海，李學軍，周異曾，等.EGFL7在人腦膠質瘤中的表達及其與微血管密度的關系［J］.中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2013，15（5）：336-345.

［8］Weidner N.Intra tumor micro vessel density asaprognostic factor in cancer［J］.Am J Pathol，2014，147（1）：9-13.

［9］王輔林，韋立新，陳樂真.血管內皮生長因子、微血管密度與乳腺癌淋巴結轉移及預后的關系［J］.中華病理學雜志，2014，29（3）：172-175.

［10］高文宏，陳謙學，劉剛.內皮抑素和血管內皮生長因子在腦膠質瘤中的表達及意義［J］.中國臨床神經外科雜志，2015，11（2）：86-91.

［11］Adams J，Carder PJ，Banks RE.Vascular endothelial growthfactor（VEGF）in breast cancer：comparison of plasma，serum，and tissue VEGF and micro vessel density and effects of tamox-ifen［J］.CancerRes，2015，60（11）：2989-2994.

The Expression and Significance of PTEN、VEGF in Human Brain Astrocytoma

ZHANG Ya-dong，GAO Yu-song，WANG Hai-wei，LUO Xin-min，HU Ceng-xiao
Department of Neurosurgery，the 159th Hospital of PLA，Zhumadian，Henan Province，463000 China

R739

A

1674-0742（2016）09（c）－0011-03

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.27.011

2016-05-05）

張亞東（1973-），男，河南駐馬店人，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：神經康復學。