江興華　趙華娥　林曉榮　鄭敬敏　包松英　林拱陽(yáng)　王全溪（.福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司福州35004；2.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院福州350002）

雞新城疫-禽流感二聯(lián)滅活疫苗免疫不同日齡商品肉雞的效果比較

江興華1趙華娥1林曉榮1鄭敬敏1包松英1林拱陽(yáng)1王全溪2*
（1.福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司福州350014；2.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院福州350002）

使用雞新城疫-禽流感（H9N2 HP株）二聯(lián)滅活疫苗分別免疫3、7、14日齡三組商品肉雞各40羽，同時(shí)設(shè)一組空白對(duì)照組。各免疫組及對(duì)照組于3、7、14、21、28、35、42日齡采血檢測(cè)新城疫、禽流感抗體，于21、28、35日齡進(jìn)行禽流感病毒攻毒，對(duì)比不同日齡免疫組的抗體消漲情況及不同日齡禽流感攻毒結(jié)果。發(fā)現(xiàn)對(duì)照組隨雞日齡增加，新城疫與禽流感抗體逐漸下降，在42日齡時(shí)下降至0，而不同免疫組新城疫與禽流感抗體均先下降，21日齡左右開(kāi)始上升，至35日齡新城疫與禽流感抗體升至6log2以上。3日齡免疫組的禽流感免疫保護(hù)效果最好，21、28、35日齡時(shí)禽流感強(qiáng)毒攻毒保護(hù)率均達(dá)100%；7日齡免疫組在21、35日齡時(shí)禽流感強(qiáng)毒攻毒保護(hù)率均達(dá)100%，28日齡時(shí)禽流感強(qiáng)毒攻毒保護(hù)率達(dá)70%；14日齡免疫組在28、35日齡時(shí)禽流感強(qiáng)毒攻毒保護(hù)率均達(dá)100%，21日齡時(shí)禽流感強(qiáng)毒攻毒保護(hù)率只達(dá)30%。試驗(yàn)表明，商品肉雞選擇3日齡免疫雞新城疫-禽流感（H9N2 HP株）二聯(lián)滅活疫苗時(shí)禽流感免疫保護(hù)效果最好，采用3日齡免疫程序可以提高新城疫與禽流感的免疫保護(hù)效果，減少養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。

雞新城疫、禽流感（H9N2 HP株）二聯(lián)滅活疫苗肉雞免疫效果

雞新城疫（ND）是由新城疫病毒引起的一種烈性病毒性傳染病，是當(dāng)今全球范圍內(nèi)重要的家禽傳染病之一。禽流感（Avian Influence，AI）是禽流行性感冒的簡(jiǎn)稱(chēng)，是由正粘病毒科、流感病毒屬A型流感病毒引起的禽類(lèi)的一種烈性傳染病［1］，感染禽類(lèi)呈亞臨診癥狀，輕度上呼吸道疾病、產(chǎn)蛋量降低，直至急性全身致死性疾?。?］。在我國(guó)，低致病性禽流感以H9N2亞型為主型，流行范圍廣，占禽流感陽(yáng)性雞群總數(shù)的93.6%［3］，H9N2亞型禽流感傳播能力強(qiáng)，感染發(fā)病率高，可造成雞群產(chǎn)蛋下降及嚴(yán)重影響肉雞生長(zhǎng)速度，與其他病原共同感染導(dǎo)致高死亡率，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失［4］。對(duì)于以上兩種病的控制，接種雞新城疫-禽流感二聯(lián)滅活疫苗是主要控制方法。據(jù)市場(chǎng)上反應(yīng)，商品肉雞早期禽流感感染率高，使用新城疫-禽流感二聯(lián)滅活疫苗后，產(chǎn)生抗體遲緩，抗體水平低，在45日出欄前禽流感保護(hù)率低，給養(yǎng)殖戶(hù)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。針對(duì)目前現(xiàn)狀，使用福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司制備的新城疫-禽流感二聯(lián)滅活疫苗進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)不同的免疫程序，觀察其免疫效果，從而為市場(chǎng)上使用該產(chǎn)品提供最佳免疫程序，以取得最佳效果。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)用疫苗雞新城疫-禽流感（H9N2 HP株）二聯(lián)滅活疫苗由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司自制，批號(hào)：SY2015007。

1.1.2試驗(yàn)用雞商品肉雞160羽，由圣農(nóng)集團(tuán)孵化廠提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)分組小雞出殼后由本公司養(yǎng)至3日齡，選擇健康有活力的160羽雞。隨機(jī)選40羽編為A組，即3日齡免疫組；隨機(jī)選40羽編為B組，即7日齡免疫組；隨機(jī)選40羽編為C組，即14日齡免疫組；隨機(jī)選40羽編為D組，即空白對(duì)照組。并在每羽雞上打上翅標(biāo)編號(hào)，各組試驗(yàn)雞分開(kāi)飼養(yǎng)。

1.2.2免疫方法將A、B、C組商品肉雞分別于3、7、14日齡免疫本公司自制的雞新城疫-禽流感（H9N2 HP株）二聯(lián)滅活疫苗，每羽頸部皮下注射0.2 mL；對(duì)照組均不免疫，作為空白對(duì)照。

1.2.3抗體監(jiān)測(cè)各免疫組與對(duì)照組均隨機(jī)選擇10羽雞固定采血進(jìn)行監(jiān)測(cè)抗體，均于3、7、14、21、28、35、42日齡采血檢測(cè)新城疫與禽流感抗體。

1.2.4抗體檢測(cè)方法抗體檢測(cè)用紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)的方法。具體步驟：用PBS將待檢血清做2倍系列稀釋?zhuān)尤牒?HAU的血凝素抗原液，并設(shè)PBS和4HAU血凝素抗原液對(duì)照，充分振搖后，置室溫下至少20 min或在2～8℃下40～60 min；再加入1%雞紅細(xì)胞懸液，置室溫20～40 min或置2～8℃40～60 min，當(dāng)紅細(xì)胞對(duì)照孔中的紅細(xì)胞呈顯著鈕扣狀時(shí)判定結(jié)果，以使紅細(xì)胞凝集被完全抑制的血清最高稀釋度作為判定終點(diǎn)。

1.2.5攻毒保護(hù)試驗(yàn)方法免疫組與對(duì)照組于21、28、35日齡隨機(jī)選擇10羽雞進(jìn)行禽流感強(qiáng)毒攻毒，攻毒使用的流感強(qiáng)毒為市場(chǎng)中分離的流行強(qiáng)毒株，將強(qiáng)毒按10倍稀釋后，每羽靜脈注射0.2 mL，攻毒后5 d，采集雞泄殖腔棉拭紙，將棉拭紙液體樣凍融3次，高速離心15 min（10 000 r/min），每個(gè)離心后樣品接種10日齡雞胚5枚，每胚接0.2 mL，培養(yǎng)72 h，收取雞胚液，測(cè)HA效價(jià)，HA≥1：16作為攻毒不保護(hù)的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)病毒感染為陰性的雞胚，應(yīng)再肓傳一次，再測(cè)HA效價(jià)。

2　結(jié)果

2.1新城疫與禽流感抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果從新城疫與禽流感抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表1、圖1-圖2）可以看出，對(duì)照組隨雞日齡增加，新城疫與禽流感抗體逐漸下降，42日齡時(shí)下降至0；而不同免疫組新城疫與禽流感抗體均先下降，21日齡左右開(kāi)始上升，35日齡時(shí)新城疫與禽流感抗體升至6log2以上。21日齡時(shí)3日齡免疫組新城疫抗體最高，28日齡時(shí)三組免疫組新城疫抗體非常接近，35日齡后14日齡免疫組新城疫抗體最高；14、21日齡時(shí)3日齡免疫組禽流感抗體最高，28日齡后，免疫日齡大的組禽流感抗體越高。

2.2禽流感攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果從禽流感攻毒保護(hù)結(jié)果（見(jiàn)表2、圖3）看出，對(duì)照組在21、28、35日齡攻毒時(shí)，攻毒保護(hù)率在20%以下；3日齡免疫組的免疫效果最好，21、28、35日齡的攻毒保護(hù)率均是100%；7日齡免疫組在28日齡攻毒時(shí)，攻毒保護(hù)率只達(dá)70%；14日齡免疫組在21日齡攻毒時(shí)，攻毒保護(hù)率只達(dá)30%。

表1　新城疫與禽流感抗體水平監(jiān)測(cè)結(jié)果

表2　不同組禽流感攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

3　結(jié)論與討論

1）吳庭才等［5］研究表明，商品肉雞在7日齡后禽流感母源抗體隨雛雞日齡的增加而迅速下降，至28日齡時(shí)已趨于消失。攻毒試驗(yàn)中，當(dāng)禽流感HI效價(jià)為6log2左右時(shí)，保護(hù)率為100%；在4log2時(shí)，保護(hù)率僅50%；在2log2左右時(shí)，保護(hù)率只有20%。從本試驗(yàn)中可以看出，雛雞隨日齡增加流感抗體逐漸下降，容易感染禽流感，免疫新城疫-禽流感二聯(lián)滅活苗后，流感抗體先下降，至21日齡時(shí)最低，在3log2以下，只有3日齡免疫組達(dá)到3log2，隨后抗體開(kāi)始上升，28日齡均達(dá)4log2以上；3日齡免疫組在21日齡時(shí)雖然抗體只達(dá)3log2，但對(duì)攻毒仍可達(dá)100%保護(hù)，說(shuō)明使用該產(chǎn)品在抗體不高時(shí)仍可達(dá)到較好的攻毒保護(hù)率。在疫苗的使用過(guò)程中，制定合理的免疫程序也是個(gè)關(guān)健，理論上機(jī)體越早免疫就越早產(chǎn)生抗體，越早產(chǎn)生免疫保護(hù)力，但也應(yīng)考慮機(jī)體免疫器官未發(fā)育完全可能會(huì)造成免疫效果不佳的情況。

2）從禽流感抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果可以看出，3日齡免疫組在14、21日齡時(shí)抗體最高，21日齡后各免疫組的抗體越來(lái)越接近；在35、42日齡時(shí)14日齡免疫組的抗體最高。這一結(jié)果表明，早日齡免疫，在早期抗體水平高，到后期時(shí)遲免疫組抗體上升快，而且高，可能與免疫日齡大時(shí)機(jī)體的免疫器官發(fā)育更完全有關(guān)。

3）從不同組攻毒保護(hù)結(jié)果看，3日齡免疫組不同時(shí)間攻毒的保護(hù)結(jié)果最好，均達(dá)100%，可以說(shuō)無(wú)空檔期。雖各時(shí)間的抗體不一定最高，但攻毒保護(hù)率最高，若要保護(hù)40幾日齡上市的肉雞，需盡早免疫新-流二聯(lián)滅活苗；若要保護(hù)40日齡以上的蛋雞，可選擇兩周免疫，最終可以產(chǎn)生更高的抗體水平，達(dá)到更好的免疫效果。

4）當(dāng)前，低致病性禽流感毒株在不斷發(fā)生變化甚至發(fā)生變異，部分養(yǎng)殖廠反映禽流感滅活苗不能產(chǎn)生完全免疫保護(hù)，但是有研究認(rèn)為，雖然H9N2亞型禽流感病毒發(fā)生了一定變異，但是現(xiàn)有疫苗仍能提供有效保護(hù)［6］。萬(wàn)曉朋等［7-8］研究表明，H9N2毒株間有很好的免疫交叉保護(hù)性，滅活疫苗免疫雞不僅能夠完全抵抗同源毒株的攻擊，對(duì)異源毒株的攻擊也可產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)。本試驗(yàn)疫苗使用的禽流感HP株，用HP毒株制備的新城疫-禽流感二聯(lián)滅活疫苗免疫3日齡商品肉雞，21、28、35日齡時(shí)進(jìn)行禽流感強(qiáng)毒攻毒，仍有很好的攻毒保護(hù)效果；本試驗(yàn)攻毒使用的是市場(chǎng)流行毒株，對(duì)于其他毒株攻毒有保護(hù)效果。王新衛(wèi)等［9-12］進(jìn)行不同毒株攻毒保護(hù)試驗(yàn)，雖然攻毒株與疫苗株在抗原性上有差異，但HP株仍能夠?qū)Χ玖?、抗原差異的其他禽流感流行毒株的攻毒產(chǎn)生有效保護(hù)。

5）在本試驗(yàn)中，免疫雞新城疫-禽流感（H9N2 HP株）二聯(lián)滅活疫苗后，商品肉雞產(chǎn)生抗體均可達(dá)到較高的水平。免疫效果不僅要參考抗體水平，更重要的是要看攻毒保護(hù)結(jié)果，本試驗(yàn)中安排了流感攻毒保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果攻毒保護(hù)率也較高，免疫效果好。本試驗(yàn)是在商品肉雞上進(jìn)行的，在蛋雞上的效果還需通過(guò)進(jìn)一步的試驗(yàn)觀察，制定新的免疫程序，以獲得滿(mǎn)意的免疫效果。

［1］榮駿弓，孫進(jìn)忠，劉守川，等.雞新城疫病毒、禽流感病毒二聯(lián)滅活疫苗免疫試驗(yàn)［J］.中國(guó)家禽，2007，29（16）：49-52.

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Comparision of immune effects of bivalent inactivated vaccines containing newcastle disease virus and avian influenza virus in different days of commercial broiler chickens

Jiang Xinghua1Zhao Huae1Lin Xiaorong1Zheng Jingmin1Bao Songying1Lin Gongyang1Wang Quanxi2*
（1.Fuzhou Dabeinong Biotech Co.Ltd.，F(xiàn)uzhou 350014；2.College of Animal Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002）

3，7，14-day-old forty commercial broiler chickens were respectively inoculated with bivalent vaccines containing inactivated Newcastle disease virus（NDV）and avian influenza virus（AIV）and simultaneously，chickens were mock inoculated as control group.In order to detection antibodies against NDV and AIV，blood samples were collected from 3，7，14，21，28，35 and 42-day-old chickens in both immune groups and control groups，and 21，28 and 35-day-old chickens were infected with AIV，respectively.Antibody levels against NDV and AIV，as well as mortality of each group were detected for comparative analysis.The results showed that antibodies against NDV and AIV in control group represented an gradual decline as days went，till to zero on 42th day，antibody levels of immune groups decreased in the early stage，and began to increase since 21th day，ending up with 6log2 on 35th day.Immune protection effect of 3-old-day immune group was the best and protection rate against AIV reached 100 percent on 21，28 and 35-day-old chickens. Protection rate of 7-old-day immune group was 70%on 28-day-old and that of 14-old-day immune group was 30%on 21-day-old. In conclusion，better immune protection against AIV was obtained from commercial broiler chickens inoculated with bivalent vaccine containing inactivated NDV and AIV on 3-day-old，which could improve immune protection effect against NDV and AIV and reduce economic losses of poultry industry.

Bivalent vaccine containing inactivated NDV and AIV（H9N2 HP strain）Broiler chickens Immune effects

A

1003-4331（2016）05-0018-04

福州市區(qū)域重大項(xiàng)目（2015-Q-29）資助。

江興華（1975-），男，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士生校外導(dǎo)師。主要從事獸用疫苗的生產(chǎn)與研發(fā)，jxhgreen@163.com。

王全溪（1978-），男，副教授，博士研究生，碩士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)樗拗髋c病原互作，wqx608@126.com。