張靜,馬占玲,汪瑩,李寧寧,陳思,勵(lì)建榮

(渤海大學(xué) 化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 錦州,121013)

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鹽酸苯海索-Ce(IV)熒光法檢測(cè)蝦中亞硫酸鹽含量

張靜,馬占玲*,汪瑩,李寧寧,陳思,勵(lì)建榮

(渤海大學(xué) 化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 錦州,121013)

基于鹽酸苯海索-Ce(IV)-亞硫酸鹽在弱酸或中性條件下反應(yīng)生成強(qiáng)烈的熒光物質(zhì)，建立了檢測(cè)食品中亞硫酸鹽含量的新方法。確定了測(cè)定亞硫酸鹽的最佳條件。在最佳條件下，亞硫酸鹽含量在0.02～1mg/mL呈現(xiàn)良好的線性，線性方程為：y=8 031.7x-203.31，相關(guān)系數(shù)為0.996 8，方法的檢出限為0.001μg/mL，遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法——鹽酸副玫瑰苯胺法。方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.08%，回收率在82.4%～92.8%之間。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、污染??；用于測(cè)定蝦中亞硫酸鹽含量，與國(guó)標(biāo)法無(wú)顯著性差異。

鹽酸苯海索；Ce(IV)；亞硫酸鹽；熒光法；蝦

亞硫酸鹽是一種常用的食品添加劑，具有漂白、防腐、抗氧化、防止褐變等作用[1-2]。蝦類(lèi)制品(海捕鮮蝦，凍蝦仁，速凍小蝦，凍對(duì)蝦，烤蝦等)是亞硫酸鹽的一大應(yīng)用領(lǐng)域。此類(lèi)制品中，亞硫酸鹽能有效防止蝦體在冷凍(藏)貯存和加工過(guò)程中的褐變，防腐保鮮，保護(hù)制品的品質(zhì)和色澤，延長(zhǎng)制品的保質(zhì)期[1]。但是，亞硫酸鹽具有一定的毒性，WHO規(guī)定每人每日攝入亞硫酸鹽的量應(yīng)低于0.7mg[3]。攝入過(guò)量亞硫酸鹽將會(huì)導(dǎo)致呼吸困難、蕁麻疹、哮喘、胃腸不適等問(wèn)題，尤其是對(duì)哮喘患者尤為嚴(yán)重[4-5]，過(guò)量的亞硫酸鹽還會(huì)對(duì)人體的神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等帶來(lái)一定的危害[6-8]?；趯?duì)亞硫酸鹽毒性的認(rèn)識(shí)，各國(guó)均對(duì)食品中SO2殘留量做出了嚴(yán)格的限定，國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)明確規(guī)定了冷凍蝦中SO2殘留量，在生品可食性部分≤100mg/kg，熟食可食性部分≤30mg/kg[9]。目前我國(guó)檢測(cè)食品中亞硫酸含量的方法主要有國(guó)標(biāo)法中采用的鹽酸副玫瑰苯胺比色法和蒸餾滴定法[10]，其他方法如色譜法[11]、化學(xué)發(fā)光法[12]、電化學(xué)法[13]、傳感器法[14]等，但均有各自的不足。如鹽酸副玫瑰苯胺比色法使用大量劇毒試劑四氯汞鈉，對(duì)環(huán)境和人體造成損害，同時(shí)食品中含量較高的離子如Cl-對(duì)方法的干擾較大，蒸餾滴定法操作復(fù)雜，不適合大批量樣品的檢測(cè)。

基于鹽酸苯海索能顯著增強(qiáng)Ce(IV)與亞硫酸鹽之間化學(xué)發(fā)光反應(yīng)[15]，本文建立了一種檢測(cè)水產(chǎn)品中亞硫酸鹽含量的新的熒光法，與鹽酸副玫瑰苯胺比色法相比，該方法污染性小，干擾低，檢測(cè)限低，與蒸餾滴定法相比，操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、適合大批量樣品檢測(cè)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；PL303電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；970CRT熒光分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RRHP-100型萬(wàn)能高速粉碎機(jī)，歐凱萊芙實(shí)業(yè)公司；UV-1801紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器有限公司。

硫酸鈰、鹽酸苯海索、NaOH、Na2SO3均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.2樣品處理與檢測(cè)

1.2.1樣品處理

樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎均勻后，準(zhǔn)確稱(chēng)取2.5g樣品粉末，置于50mL容量瓶中，加入2.5mLNaOH溶液，再加入適量蒸餾水，超聲1.5h后定容，取濾液備用。

1.2.2樣品檢測(cè)

向比色管中加入2mLCe(SO4)2(0.01mol/L)，2mL鹽酸苯海索(0.020mg/mL)、1mL樣液，去離子水定容到20mL。搖勻，35℃條件下反應(yīng)15min，在激發(fā)波長(zhǎng)為265nm，發(fā)射波長(zhǎng)為350nm，狹縫為10nm條件下進(jìn)行熒光測(cè)定。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.1.1最大發(fā)射波長(zhǎng)的確定

在最佳條件下，鹽酸苯海索-亞硫酸根-硫酸鈰進(jìn)行反應(yīng)，在200～800nm內(nèi)進(jìn)行發(fā)射光譜掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1，從而確定該反應(yīng)體系的熒光發(fā)射波長(zhǎng)為350nm。

圖1　EM掃描熒光光譜 Fig.1　Chart of EM scanning fluorescence spectra

2.1.2鹽酸苯海索用量的影響

當(dāng)其他條件一定時(shí)，考察了20mg/L鹽酸苯海索的用量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，熒光強(qiáng)度隨著鹽酸苯海索用量的增加先變小后變大，鹽酸苯海索用量為2.0mL時(shí)，熒光強(qiáng)度較大且比較穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)選擇鹽酸苯海索用量為2.0mL。

圖2　鹽酸苯海索用量對(duì)反應(yīng)體系的影響Fig.2　Effect of trihexyphenidyl hydrochloride dosage on chemical reaction system

2.1.3硫酸鈰用量的影響

探討了0.01mol/L硫酸鈰的用量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)其他條件一定時(shí)，隨著硫酸鈰用量的增加，熒光強(qiáng)度不斷變大?？梢?jiàn)在該反應(yīng)體系中，熒光強(qiáng)度與硫酸鈰和亞硫酸鹽均有關(guān)，但在硫酸鈰用量一定的條件下反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度與亞硫酸鹽成正比，考慮到實(shí)驗(yàn)條件，本實(shí)驗(yàn)確定Ce(SO4)2用量為2.0mL。

圖3　Ce(SO4)2用量對(duì)反應(yīng)體系的影響Fig.3　Effect of Ce(SO4)2 dosage on chemical reaction system

2.1.4反應(yīng)溫度的影響

當(dāng)其他條件一定時(shí)，考察了溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖可見(jiàn)，熒光強(qiáng)度隨著溫度的升高先變小后變大，當(dāng)反應(yīng)溫度為35 ℃時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。本文確定反應(yīng)最佳溫度為35 ℃。

圖4　反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)體系的影響Fig.4　Effect of reaction temperature on chemical reaction system

2.1.5反應(yīng)時(shí)間的影響

考察了時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)其他條件一定時(shí)，反應(yīng)時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響不大。綜合考慮，本文選擇反應(yīng)時(shí)間為15min。

圖5　反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響Fig.5　Effect of reaction time on chemical reaction system

2.2反應(yīng)條件的正交實(shí)驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，對(duì)鹽酸苯海索用量、Ce(SO4)2用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行4因素4水平正交實(shí)驗(yàn)L16(45)。表1為正交實(shí)驗(yàn)因素水平表。表2和表3為正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素水平表L16(45)

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及計(jì)算表L16(45)

通過(guò)極差分析可知，各因素對(duì)熒光強(qiáng)度(I)的影響順序?yàn)椋篊e(SO4)2用量B>反應(yīng)溫度C>鹽酸苯海索用量A>反應(yīng)時(shí)間D。熒光法檢測(cè)食品中亞硫酸鹽含量的最佳條件為：A4B4C4D3，即鹽酸苯海索用量為2.0mL，Ce(SO4)2用量為2.0mL，反應(yīng)溫度為35 ℃，反應(yīng)時(shí)間為15min。

方差分析結(jié)果表明，Ce(SO4)2(B)達(dá)到極顯著水平，對(duì)熒光強(qiáng)度影響較大。其他因素對(duì)鹽酸苯海索用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間均未達(dá)到顯著水平，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大。

2.3共存離子的影響

在亞硫酸鹽濃度為0.8g/L，相對(duì)偏差小于±5.0%時(shí)，干擾離子所允許的共存倍數(shù)為Na+(200倍)、Cl-(200倍) 、K+(200倍)、NO22-(100倍)、Zn2+(100倍)、蛋白質(zhì)(100倍)、Vc(5倍)、PO43-(100倍)，由此可見(jiàn)，該體系對(duì)亞硫酸鹽的選擇性較好。

表3　方差分析表

2.4方法評(píng)價(jià)

2.4.1工作曲線

取系列亞硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳條件下反應(yīng)15min后，在激發(fā)波長(zhǎng)為265nm，發(fā)射波長(zhǎng)為350nm下測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制工作曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，亞硫酸鹽含量在0.02～1mg/mL熒光強(qiáng)度與濃度成正比，其線性回歸方程為y=8031.7x-203.31，相關(guān)系數(shù)R為0.996 8，呈很好的線性關(guān)系。

2.4.2方法的檢出限

使用空白溶液連續(xù)測(cè)量15次，利用公式(1)計(jì)算出本方法的最低檢出限：

DL=3σ/k

(1)

式中：σ，標(biāo)準(zhǔn)偏差；k，工作曲線斜率。

經(jīng)15次測(cè)量空白溶液，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.48，工作曲線的斜率為8 031.7，計(jì)算方法檢出限為0.001μg/mL，低于國(guó)標(biāo)法鹽酸副玫瑰苯胺的檢測(cè)限0.1μg/mL(即1mg/kg，按10g樣品定容100mL計(jì))?？梢?jiàn)該方法的檢出限低，靈敏度高，能較好地適應(yīng)蝦中亞硫酸鹽的檢測(cè)。

2.4.3方法的精密度和回收率

取凍蝦用粉碎機(jī)攪碎，準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00g，移入容量瓶中，加入2.5mLNaOH溶液，再加入少量水將樣品浸沒(méi)，超聲90min之后，測(cè)定其中亞硝酸鹽含量，平行測(cè)定5次，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。然后分別加入不同量的亞硫酸鹽，測(cè)定回收率。結(jié)果如表4所示，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.08%，平均回收率在82.4%～92.8%之間。精密度和準(zhǔn)確度均能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

表4　方法精密度和回收率

2.4.4與國(guó)標(biāo)法差異性檢驗(yàn)

分別用本法與國(guó)標(biāo)法檢測(cè)凍蝦中亞硫酸鹽的含量，平行測(cè)定5次，結(jié)果如表5所示。

用F檢驗(yàn)法和t檢驗(yàn)法對(duì)國(guó)標(biāo)法和熒光法測(cè)得的凍蝦中亞硫酸鹽含量的平均值顯著性差異進(jìn)行檢驗(yàn)。通過(guò)計(jì)算F為1.05，小于F0.95,4(6.39)，說(shuō)明二者的方差不存在顯著性差異(P<0.05);t值為1.27，小于t0.95,8(2.31)，說(shuō)明2種方法測(cè)得的平均值，即2種方法無(wú)顯著性差異(P<0.05)。

表5　熒光法與國(guó)標(biāo)法顯著性差異比較

2.5樣品檢測(cè)

在市場(chǎng)買(mǎi)取5份不同的凍蝦進(jìn)行測(cè)量，測(cè)得結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明5種凍蝦中亞硫酸鹽的含量在82.33～121.35mg/kg。其中有一種樣品中亞硫酸鹽含量超過(guò)中華人民共和國(guó)水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T3113—2002規(guī)定的冷凍蝦中SO2殘留量≤100mg/kg的限量，其他4種樣品合格。

表6　樣品測(cè)定

3　結(jié)論

建立了鹽酸苯海索熒光光度法檢測(cè)食品中亞硫酸鹽含量的新方法。與國(guó)標(biāo)法中的鹽酸副玫瑰苯胺比色法相比較，該方法未使用劇毒試劑，環(huán)境污染小，海產(chǎn)品中含量較大的離子如Cl-對(duì)方法的干擾較小，檢測(cè)更快速；檢出限低，適合大批量樣品的檢測(cè)。該方法用于凍蝦中亞硫酸鹽含量的檢測(cè)，效果較好。

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Fluorescencedeterminationofsulfiteinshrimpwithtrihexyphenidylhydrochloride-Ce(IV)systym

ZHANGJing,MAZhan-ling*,WANGYing,LINingning,CHENSi,LIJian-rong*

(CollegeofChemistry,ChemicalEngineeringandFoodSafety,BohaiUniversity,FoodSafetyKeyLabofLiaoningProvince,Jinzhou121013,China)

Strongfluorescentsubstancesweregeneratedbasedontrihexyphenidylhydrochloride-Ce(IV) -sulfiteundertheconditionsofweakacidorneutral.Anewdeterminationmethodofsulfitesinshrimpwasestablished.Thefluorescenceintensityandtheconcentrationofsulfite(SO2)showedgoodlinearityintherangeof0.02～1mg/mL,theregressionequationisy=8 031.7x～203.31.Thecorrelationcoefficientis0.999 6.Themethoddetectionlimitis0.001μg/mL.Itisfarlowerthanthatofthenationalstandard.Therelativedeviationofthesampleis6.08%andtherecoveryrateisbetween96%and107%.Themethodissimple,sensitive,andenvironmentallyfriendlyandtheresultwassatisfying.Theresultcomparingwiththestandardmethodisbasicallythesame.

trihexyphenidylhydrochloride;Ce(IV);sulfite;fluorescencespectrometry;shrimp

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608032

碩士研究生(馬占玲教授，勵(lì)建榮教授為通訊作者，E-mail分別為：13898355801@sina.com和lijr6491@163.com)。

“十二五”國(guó)家支撐計(jì)劃項(xiàng)目課題“水產(chǎn)品加工過(guò)程質(zhì)量安全控制關(guān)鍵技術(shù)集成與示范”(No. 2012BAD29B06)

2015-12-30，改回日期：2016-02-22