何英霞，李霽昕，米蘭，陳玉蓉，胡妍蕓，王博，王雨，蔣玉梅

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州, 730070)

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響應(yīng)面分析pH值、溫度、SO2對干紅葡萄酒中吡喃花色苷Vitisins的影響

何英霞，李霽昕，米蘭，陳玉蓉，胡妍蕓，王博，王雨，蔣玉梅*

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州, 730070)

為提高甘肅河西地區(qū)葡萄酒色澤品質(zhì)，試驗(yàn)以蛇龍珠葡萄為原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法分析pH值、發(fā)酵溫度和SO2添加量對干紅葡萄酒中吡喃花色苷Vitisins的影響，建立數(shù)學(xué)回歸模型，分析因素間的交互作用。結(jié)果顯示，影響VitisinA和VitisinB含量的顯著單因素為SO2添加量和發(fā)酵溫度，而SO2添加量和pH值的交互作用影響最顯著。蛇龍珠干紅葡萄酒的最佳釀造工藝參數(shù)為：SO2添加量58.89mg/L，發(fā)酵溫度26.57℃，葡萄醪pH值3.92，此條件下試驗(yàn)樣品VitisinA和VitisinB含量分別達(dá)(14.43±1.04)mg/L和(2.22±0.23)mg/L，與模型理論值吻合度高達(dá)90%以上。

蛇龍珠；葡萄酒；VitiisnA；VitisinB；響應(yīng)面

紅葡萄酒的色澤是決定葡萄酒感官品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，花色苷是紅葡萄酒中最主要的呈色物質(zhì)，在浸漬和發(fā)酵過程中由葡萄皮中萃取獲得。花色苷在陳釀過程中會(huì)發(fā)生降解、自結(jié)合、輔色素化等反應(yīng)，并受葡萄酒pH值和游離SO2等因素的影響，進(jìn)而影響葡萄酒的色澤品質(zhì)[1-3]。吡喃花色苷是葡萄酒發(fā)酵和陳釀過程中花色苷與葡萄糖發(fā)酵代謝的中間產(chǎn)物(乙醛、丙酮酸、乙酰乙酸)及漿果中其它多酚類成分發(fā)生環(huán)化、加成或聚合等反應(yīng)形成的一類新型呈色物質(zhì)，具有良好的穩(wěn)定性、色澤特征及較強(qiáng)的抗氧化、抗降解、抗SO2漂白等特性，是目前葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)科研人員集中關(guān)注和研究的熱點(diǎn)[4-5]。

Vitisins是吡喃花色苷家族中較為重要的一類化合物，主要形成于紅葡萄酒發(fā)酵過程中，VitisinA由酵母代謝產(chǎn)物丙酮酸和錦葵花色苷形成的加合物，VitisinB則由乙醛和錦葵花色苷反應(yīng)形成，酵母菌株、發(fā)酵溫度、pH值、SO2添加量等因素對Vitisins的產(chǎn)生和釋放有很大的影響[6-7]。盡管在河西走廊產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒中檢測到的Vitisins類型吡喃花色苷含量很小，但由于其良好的色澤特征、較高的穩(wěn)定性及較強(qiáng)的抗氧化活性，它們在紅葡萄酒陳釀后對產(chǎn)品色澤品質(zhì)的作用不容忽視。目前，國外對花色苷衍生物的研究主要集中在新型衍生產(chǎn)物的定性、結(jié)構(gòu)分析和代謝途徑等方面[8-9]，國內(nèi)關(guān)于花色苷衍生物方面的研究鮮見報(bào)道。

本研究以甘肅民勤地區(qū)的蛇龍珠葡萄為原料釀制蛇龍珠干紅葡萄酒，運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面分析法，分析釀酒工藝參數(shù)pH值、發(fā)酵溫度和SO2添加量對蛇龍珠干紅葡萄酒中Vitisins影響的交互作用，以期為甘肅河西地區(qū)葡萄酒陳釀過程中顏色衰老的抑制及色澤品質(zhì)的提高提供科學(xué)數(shù)據(jù)參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

葡萄品種為蛇龍珠，采樣地點(diǎn)為甘肅民勤葡萄栽培基地，2010年定植單臂籬架葡萄藤，采樣時(shí)間為2015年10月，成熟指標(biāo)為含糖量228.8g/L，總酸5.79g/L，pH3.7。

酵母D254、 浸漬酶EX-V，法國Lallemand公司；錦葵色素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，美國Chromadex公司；色譜純甲醇、乙腈，德國Merck公司；分析純磷酸、偏重亞硫酸鈉，上海建信化工有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

UltiMate3000系列高效液相色譜儀(HPLC)，美國ThermoScientific公司；PHS-3CpH計(jì)，上海雷磁儀器有限公司；HPLC流動(dòng)相過濾裝置，上海陸納生物科技有限公司；0.22μm微孔濾膜、0.45μm針頭過濾器，北京卓信偉業(yè)科技有限公司。

1.3方法

1.3.1葡萄酒釀造工藝

蛇龍珠葡萄→分選、除梗、破碎→入罐(2.5L棕色廣口瓶，每罐均裝入2kg葡萄)→15 ℃浸漬3d(按試驗(yàn)設(shè)計(jì)梯度添加SO2及浸漬酶EX-V20mg/L)→酒精發(fā)酵(D254酵母250mg/L，并按試驗(yàn)設(shè)計(jì)在發(fā)酵前分組調(diào)控pH和發(fā)酵溫度)→含糖量<4g/L終止發(fā)酵→皮渣分離→取樣

樣品高速冷凍離心(10 000×g，4 ℃)10min，取上清液樣品過0.45μm濾膜，HPLC分析。

1.3.2單因素試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)確定基本參數(shù)范圍，各試驗(yàn)因素處理均設(shè)5個(gè)梯度，每組處理做3個(gè)重復(fù)。

1.3.2.1SO2添加量

葡萄醪初始pH3.7，發(fā)酵溫度為25 ℃，SO2添加梯度：30、40、50、60、70mg/L。

1.3.2.2發(fā)酵溫度

葡萄醪初始pH3.7，SO2添加量為SO2單因素試驗(yàn)確定值，發(fā)酵溫度梯度：18、21、24、27、30 ℃。

1.3.2.3pH值

SO2添加量和發(fā)酵溫度為SO2和發(fā)酵溫度單因素試驗(yàn)確定最佳值，1mol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)葡萄醪pH值梯度：3.0、3.3、3.6、3.9、4.2。

1.3.3響應(yīng)面試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以吡喃花色苷VitisinA和VitisinB的含量為評價(jià)指標(biāo)，響應(yīng)面試驗(yàn)分析SO2添加量、發(fā)酵溫度和葡萄醪pH值 3個(gè)因素對Vitisins的影響。因素與水平如表1所示。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平

1.4Vitisins的定性定量

定性：紫外可見光譜掃描，根據(jù)Vitisins最大吸收波長定性[11,12]；

定量：二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷為外標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行外標(biāo)定量。

1.4.1標(biāo)準(zhǔn)溶液

5mg二甲花翠素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品溶于(甲醇)∶(水)=1∶1(磷酸調(diào)pH=2.25)，定容至10mL，制得500mg/L標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4 ℃保存。試驗(yàn)時(shí)按濃度梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)液，HPLC分析制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2HPLC色譜條件

參照文獻(xiàn)[13-14]修改，色譜柱：ZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相A：(乙腈)∶(水)=60∶40，流動(dòng)相B：(乙腈)∶(水)=5∶95，磷酸調(diào)pH=2.0；進(jìn)樣體積：20μL；流速：1mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長520nm；梯度洗脫程序：0～10min，5%～10%A；10～25min，10%～25%A；25～40min，25%～30%A；40～41min，30%～5%A；41～45min，5%A。

1.5數(shù)據(jù)分析與處理

Excel2007分析單因素試驗(yàn)結(jié)果，Design-Expert8.0分析處理響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1SO2添加量對Vitisins的影響

隨著SO2添加量增加(圖1)，酒樣VitisinA和VitisinB的含量呈單峰型變化，SO2添加量為60mg/L時(shí)達(dá)到最大值，隨后下降，與MORATE關(guān)于pH值、溫度、SO2對紅葡萄酒中Vitisins影響的研究結(jié)果SO2添加量越低越有利于Vitisins的生成[15]結(jié)果相反，這可能與試驗(yàn)選擇SO2添加量范圍有關(guān)，MORATE試驗(yàn)[15]SO2添加梯度為0、15、30mg/L，本試驗(yàn)SO2添加量范圍為30～70mg/L，SO2添加量由30mg/L增加到50mg/L，Vitisins含量增加，但當(dāng)SO2添加量大于60mg/L時(shí)，Vitisins含量降低?？赡苁钱?dāng)SO2添加量高于60mg/L時(shí)，葡萄酒中過多的游離SO2會(huì)與花色苷在C4位置結(jié)合形成亞硫酸鹽加合物[16]，導(dǎo)致Vitisins的前體反應(yīng)物二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷損失，繼而影響Vitisins的生成。此外，葡萄酒中游離的SO2作為一種親和試劑會(huì)吸附Vitisins的另一前體反應(yīng)物乙醛或丙酮酸[15]，也會(huì)抑制乙醛和丙酮酸分子與葡萄酒中花色苷反應(yīng)形成Vitisins。所以后續(xù)試驗(yàn)SO2的添加量選擇60mg/L進(jìn)行。

圖1　SO2添加量對Vitisin A和Vitisin B的影響Fig 1　Effect of SO2 content on Vitisin A and Vitisin B

2.1.2發(fā)酵溫度對Vitisins的影響

試驗(yàn)中隨著發(fā)酵溫度的升高，酒樣VitisinA和VitisinB的含量隨之增加，在發(fā)酵溫度為27℃時(shí)達(dá)到最大值，隨后下降(圖2)。發(fā)酵溫度升高，酵母釋放的乙醛和丙酮酸也越多[15]，Vitisins含量也隨之增加。但溫度也是影響花色苷穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，較高的發(fā)酵溫度會(huì)使Vitisins前體反應(yīng)物二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷降解，促進(jìn)葡萄酒發(fā)酵代謝產(chǎn)物(酚酸、類黃酮、黃烷-3-醇兒茶素、表兒茶素等)的釋放，它們作為輔色素也會(huì)吸附部分二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷形成聚合物[17-18]，繼而導(dǎo)致Vitisins含量降低。 所以后續(xù)試驗(yàn)發(fā)酵溫度選擇27 ℃ 效果最佳。

圖2　發(fā)酵溫度對Vitisin A和Vitisin B的影響Fig。2　Effect of fermentative temperature on Vitisin A and Vitisin B

2.1.3pH值對Vitisins的影響

葡萄醪pH值升高，酒樣VitisinA和VitisinB的含量增加，pH值為3.9時(shí)達(dá)到最大值，隨后下降(圖3)，pH不同，Vitisins的前體反應(yīng)物二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的穩(wěn)定性不同，進(jìn)而影響了VitisinA和VitisinB的形成。所以后續(xù)試驗(yàn)葡萄醪pH值選擇3.9。

圖3　葡萄醪pH值對Vitisin A和Vitisin B的影響Fig 3　Effect of pH on Vitisin A and Vitisin B

2.2響應(yīng)面分析

2.2.1回歸方程的建立與方差分析

單因素試驗(yàn)結(jié)果分析基礎(chǔ)上，設(shè)置SO2添加量、發(fā)酵溫度和pH值3個(gè)變量的因素水平，以VitisinA和VitisinB含量為響應(yīng)值，對干紅葡萄酒釀造工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化和分析。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果(表2)，經(jīng)Design-Expert8.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析(表3)，二次回歸擬合后，得到VitisinA和VitisinB的二次多項(xiàng)回歸方程：

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Y1=14.59+0.040A-0.11B+0.23C+0.092AB+0.57AC+0.075BC-0.34A2-0.62B2-1.11C2；

Y2=2.14-0.024A-0.049B+0.003C-0.032AB+0.050AC+0.00275BC-0.13A2-0.13B2-0.045C2。

VitisinAY1和VitisinBY2的響應(yīng)面模型的P值分別為0.000 5和0.000 2(均小于0.01)(表3)，表明2個(gè)模型顯著性極好；其失擬項(xiàng)的P值分別為0.972 4和0.543 4(均大于0.05)，表明2個(gè)模型在試驗(yàn)參數(shù)范圍內(nèi)，擬合程度較高，該模型可以預(yù)測與分析釀造工藝參數(shù)對吡喃花色苷Vitisins的影響規(guī)律。

表3　回歸方程方差分析

注：P<0.01(極顯著，**)，P<0.05(顯著，*)。

同時(shí)Y1響應(yīng)面模型中的C和A2對模型影響顯著，AC、B2和C2對模型影響極顯著； Y2響應(yīng)面模型中的B、AC和C2對模型影響顯著，A2和B2對模型影響極顯著。由F檢驗(yàn)得到各因素對Y1影響的大小順序?yàn)椋篠O2添加量>發(fā)酵溫度>pH值；各因素對Y2影響的大小順序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度>SO2添加量>pH值。SO2作為抗氧化劑和抑菌劑被廣泛的用于葡萄酒釀造中，游離的SO2作為一種很強(qiáng)的親和試劑能夠粘合共價(jià)的親電體(丙酮酸和乙醛)形成加合物，進(jìn)而抑制乙醛和丙酮酸分子與葡萄酒中花色苷反應(yīng)形成Vitisins，因此，SO2對Vitisins的形成非常重要。溫度可能會(huì)影響乙醛、丙酮酸的釋放與產(chǎn)生，繼而影響Vitisins的形成。此外，隨著發(fā)酵溫度的增高，VitisinB的前體物質(zhì)乙醛很容易揮發(fā)，所以發(fā)酵溫度較SO2添加量更容易影響VitisinB的含量。

2.2.2響應(yīng)面分析

Box-Behnken試驗(yàn)得到的多元二次回歸模型的響應(yīng)面圖及其等高線圖用于評價(jià)SO2添加量A、發(fā)酵溫度B和葡萄醪pH值C對干紅葡萄酒中VitisinA和VitisinB含量的兩兩交互作用，確定各個(gè)因素的最佳水平范圍。VitisinAY1響應(yīng)面結(jié)果顯示：pH值和SO2添加量響應(yīng)曲面線最陡峭，等高線圖呈橢圓形，其交互作用對VitisinA含量影響最為明顯(圖4b)；發(fā)酵溫度和pH值響應(yīng)曲面線較平緩，等高線圖為圓形，SO2添加量和發(fā)酵溫度響應(yīng)曲面線最平滑，等高線圖也呈圓形，其交互作用對VitisinA含量影響不顯著(圖4a，圖4c)，與方差分析的結(jié)果一致。VitisinBY2響應(yīng)面結(jié)果顯示：SO2添加量和pH值響應(yīng)曲面線最陡峭，發(fā)酵溫度和pH值響應(yīng)曲面線陡峭度次之，等高線圖均呈橢圓形(圖5b，圖5a)，其交互作用對VitisinB含量的影響較顯著；SO2添加量和發(fā)酵溫度響應(yīng)曲面線較平滑，等高線圖呈圓形，其對VitisinB含量的影響不明顯，同樣符合方差分析結(jié)果。

圖4　各因素交互作用對Vitisin A含量影響的響應(yīng)面圖Fig.4　Response surface plots showing the interactive effects of three vinification parameters on vitisin A content

圖5　各因素交互作用對Vitisin B含量影響的響應(yīng)面圖Fig.5　Response surface plots showing the interactive effects of three vinification parameters on vitisin B content

2.2.3結(jié)果驗(yàn)證

Design-Expert軟件建立的模型優(yōu)化參數(shù)，得到最佳工藝參數(shù)為SO2添加量59.89mg/L，發(fā)酵溫度26.57 ℃，葡萄醪pH值3.92，此條件下，預(yù)測樣品VitisinA含量為14.61mg/L，VitisinB含量為2.35mg/L。為了便于操作，確定蛇龍珠干紅葡萄酒驗(yàn)證試驗(yàn)工藝參數(shù)為SO2添加量60mg/L，發(fā)酵溫度26.5 ℃，葡萄醪pH值3.9，在此條件下進(jìn)行3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，VitisinA和VitisinB含量分別為(14.43±1.04)mg/L和(2.22±0.23)mg/L，與理論預(yù)測值吻合度達(dá)90%以上，因此響應(yīng)面得到的最佳釀造工藝參數(shù)可靠且有應(yīng)用價(jià)值。

3　結(jié)論

以Vitisins含量為評價(jià)指標(biāo)，單因素試驗(yàn)結(jié)果確定蛇龍珠干紅葡萄的最佳SO2添加量、發(fā)酵溫度和pH值分別為 60mg/L、27 ℃和3.9 ；響應(yīng)面法建立數(shù)學(xué)模型優(yōu)化SO2添加量、發(fā)酵溫度和pH值確定最佳參數(shù)為：SO2添加量59.89mg/L，發(fā)酵溫度26.57 ℃，pH值3.92，VitisinA和VitisinB含量模型理論值為14.61mg/L和2.35mg/L。SO2添加量60mg/L、發(fā)酵溫度26.5 ℃、pH值3.9下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，VitisinA和VitisinB含量分別為(14.43±1.04)mg/L和(2.22±0.23)mg/L，與模型理論值吻合度達(dá)90%以上。

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EffectsofpH,temperatureandSO2onpyranoanthocyanins(Vitisins)inredwinebyresponsesurfacemethodology

HEYing-xia,LIJi-xin,MILan,CHENYu-rong,HUYan-yun,WANGBo,WANGYu,JIANGYu-mei*

(GansuKeyLabofViticultureandEnology,ResearchandDevelopmentCenterofWineIndustryInGansuProvince,CollegeofFoodScienceandEngineering,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China)

InordertoimprovethecolorqualityofredwineproducedinHexiCorridor,theeffectsofpH,fermentativetemperatureandSO2contentonpyranoanthocyanins(Vitisins)inCabernetGernischtredwinewereanalyzedbyresponsesurfacemethodologywithsingle-factorexperiments，andrecursivemodelwasbuilt，thentheinteractionsbetweenfactorswasdiscussed.TheresultsindicatedthatfermentativetemperatureandSO2contentweresignificantfactorsforeffectsonVitisinAandVitisinB.TheoptimumvinificationparametersforCabernetGernischtredwinewereasfollows:SO2content58.89mg/L，fermentativetemperature26.57 ℃,pH3.92.TheexperimentalvaluesofVitisinAandVitisinBwere(14.43±1.04)mg/Land(2.22±0.23)mg/Lrespectively,thefitnesswiththeoreticalvalueofmodelwasmorethan90% .

cabernetgernischt;wine;VitiisnA;VitisinB;responsesurfacemethodology

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608021

碩士研究生(蔣玉梅副教授為通訊作者，E-mail：jym316@126.com)。

甘肅省委組織部科研基金項(xiàng)目(045 036100)；甘肅省財(cái)政廳科研基金項(xiàng)目(045 041004)；盛彤笙科技創(chuàng)新基金(GSAU-8T8-1335，GSAU-STS-1335)

2016-03-02,改回日期：2016-03-31