梅甜甜，陳海琴，郝光飛，顧震南，陳衛(wèi)，陳永泉

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

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一種新ω-3脂肪酸脫飽和酶的克隆表達(dá)和活性鑒定

梅甜甜，陳海琴*，郝光飛，顧震南，陳衛(wèi)，陳永泉

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

ω-3脂肪酸脫飽和酶催化ω-6多不飽和脂肪酸(PUFAs)轉(zhuǎn)化為ω-3 PUFAs，對(duì)ω-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFAs)的合成至關(guān)重要。為了實(shí)現(xiàn)在常溫下發(fā)酵生產(chǎn)ω-3 LC-PUFAs(主要是二十碳五烯酸，EPA)，根據(jù)現(xiàn)有常溫下偏好催化20C PUFAs的ω-3脂肪酸脫飽和酶序列，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出與之高度相似的序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。為了確定序列的生物活性，進(jìn)一步在釀酒酵母系統(tǒng)中進(jìn)行重組表達(dá)，通過(guò)外源添加不同碳鏈長(zhǎng)度的脂肪酸底物，測(cè)定重組釀酒酵母轉(zhuǎn)化子在28 ℃和12 ℃下對(duì)不同脂肪酸的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示，新篩選序列編碼的蛋白o(hù)AiFADS17既能催化18C PUFAs，又能催化20C PUFAs，尤其偏好催化二十碳四烯酸(AA)轉(zhuǎn)化為EPA。oAiFADS17蛋白在28 ℃下對(duì)各種底物的轉(zhuǎn)化率均高于12 ℃下的轉(zhuǎn)化率，其中對(duì)AA的轉(zhuǎn)化率達(dá)到46.3%。該研究成功測(cè)定了oAiFADS17蛋白對(duì)不同脂肪酸底物的轉(zhuǎn)化率，得到了一種新的常溫偏好催化20C PUFAs的ω-3脂肪酸脫飽和酶，為構(gòu)建高產(chǎn)EPA的基因工程菌株及EPA的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。

ω-3脂肪酸脫飽和酶；轉(zhuǎn)化率；二十碳五烯酸(EPA)

ω-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFAs)主要包括二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA, C20∶5)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA, C22∶ 6)。EPA和DHA可以促進(jìn)哺乳動(dòng)物大腦發(fā)育以及神經(jīng)組織的形成和修復(fù)[1]，并對(duì)哮喘、癌癥、抑郁、肥胖、免疫紊亂以及心血管疾病具有十分顯著的預(yù)防作用[2-3]。但人體自身不能從源頭合成EPA和DHA，需要從富含ω-3 LC-PUFAs的食物(如深海魚(yú))中攝取。然而由于大肆捕撈以及海洋環(huán)境的污染，深海魚(yú)的供應(yīng)已無(wú)法滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求[4-6]。

自然界中ω-3 LC-PUFAs的合成起始于亞油酸(linoleic acid, LA, C18∶2)和γ-亞麻酸(γ-linoleic acid, ALA, C18∶3)，經(jīng)過(guò)一系列脫飽和酶和延長(zhǎng)酶的催化作用，最終轉(zhuǎn)化生成EPA和DHA。ω-3脂肪酸脫飽和酶(EC 1.14.19.25)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，是ω-3 LC-PUFAs合成中的關(guān)鍵酶[7]。研究發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源的ω-3脂肪酸脫飽和酶對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度的脂肪酸具有不同的催化效率。早期研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于植物的ω-3脂肪酸脫飽和酶(FAD7, FAD8等)只能催化18C PUFAs[8]。而來(lái)源于秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)的ω-3脂肪酸脫飽和酶FAT 1則能同時(shí)催化18C和20C PUFAs，但對(duì)20C底物的催化活性較低[9]。2004年P(guān)EREIRA等人發(fā)現(xiàn)來(lái)源于異枝水霉(Saprolegniadiclina)的ω-3脂肪酸脫飽和酶SDD17對(duì)18C PUFAs沒(méi)有催化活性，卻能將二十碳四烯酸(Arachidonic acid, AA, C20∶4)催化為EPA，轉(zhuǎn)化率為25.9%[10]。同樣的，來(lái)源于致病疫霉(Phytophthorainfestans)的ω-3脂肪酸脫飽和酶OPIN 17也不能以18C PUFAs為底物，但是對(duì)AA的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了30.94%[11]。2013年，XUE等人從瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)和櫟樹(shù)猝死病菌(Phytophthoraramorum)中分離出3種ω-3脂肪酸脫飽和酶——PaD 17、PsD 17和PrD 17，這3種酶都具有催化18C和20C PUFAs的能力，對(duì)20C 脂肪酸AA的轉(zhuǎn)化率分別為56%、47%和36%，并且這3種酶適應(yīng)在28 ℃下進(jìn)行催化反應(yīng)[12]。這一類(lèi)在28 ℃下偏好催化20C脂肪酸的ω-3脂肪酸脫飽和酶對(duì)ω-3 LC-PUFAs尤其是EPA的合成至關(guān)重要。本研究結(jié)合基因搜索和基因工程重組表達(dá)，篩選出了一種新的偏好催化20C脂肪酸的ω-3脂肪酸脫飽和酶。新ω-3脂肪酸脫飽和酶的發(fā)現(xiàn)為研究這類(lèi)脫飽和酶的偏好性提供了新的資源，也為ω-3脂肪酸脫飽和酶的應(yīng)用提供了更多選擇，同時(shí)為EPA的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和載體

大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)TOP 10由本實(shí)驗(yàn)室保存。表達(dá)載體pYES2/NT C與尿嘧啶缺陷型釀酒酵母INVSc 1購(gòu)于Invitrogen公司，現(xiàn)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試劑

KOD plus高保真DNA聚合酶購(gòu)自Toyobo公司；限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I和XhoI、T4DNA連接酶、Prime Script RT reagent kit試劑盒均購(gòu)自TaKaRa生物技術(shù)公司(大連)；凝膠回收試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自生物工程(上海)股份有限公司；TaqDNA聚合酶購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司；SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品LA、十八碳三烯酸(GLA)、二十碳三烯酸(DGLA)、AA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.1.3培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，氯化鈉 10，pH 7.0，固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂粉，用于大腸桿菌的培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母抽提物 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20，pH 7.0，固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂粉，用于釀酒酵母的培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。

SC-U(g/L)：酵母氮源(無(wú)氨基酸有硫酸銨) 6.7，葡萄糖 20，腺嘌呤、 精氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、蘇氨酸、色氨酸、尿嘧啶各0.1，天冬氨酸、組氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸、纈氨酸各0.05，用于轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min。誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)更換碳源為10 g/L棉籽糖和20 g/L半乳糖，其余成分與SC-U培養(yǎng)基相同。

1.1.4實(shí)驗(yàn)所用引物

本研究所用引物如表1所示，根據(jù)優(yōu)化得到的oAiFADS17基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的基因片段，同時(shí)引入EcoR I和XhoI酶切位點(diǎn)(表中下劃線(xiàn)所示)。根據(jù)oAiFADS17基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)RT-qPCR引物，使用釀酒酵母18S rRNA通用引物作為內(nèi)參[13]。

表1　本研究所用引物

注：1)表中下劃線(xiàn)表示引入的酶切位點(diǎn)，括號(hào)中的字母表示限制性酶切位點(diǎn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1oAiFADS17基因的獲得

利用BLAST從Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到一段來(lái)自真菌媒介絲囊菌(Aphanomycesinvadans)的基因序列(GenBank accession No. XM_008870610)，與5種已知偏好催化20C PUFAs的ω-3脂肪酸脫飽和酶(SDD17, OPIN 17, PaD17, PsD17, PrD17)具有較高的同源性。將這段基因編碼的蛋白與上述5種ω-3脂肪酸脫飽和酶序列在Clustal W2中進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)利用TMHMM軟件預(yù)測(cè)此段序列編碼蛋白的跨膜域。進(jìn)一步構(gòu)建含此段序列的表達(dá)載體，首先利用Genscript Optimum GeneTMsystem軟件對(duì)其核酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，人工合成優(yōu)化后的基因序列，命名為oAiFADS17(GenBank accession No. KT371999)，再與pUC57-simple載體連接得pUC57-oAiFADS17，保存于大腸桿菌 TOP 10中(金斯瑞，南京，中國(guó))。依據(jù)oAiFADS17基因序列設(shè)計(jì)引物oAiFADS17 F/oAiFADS17 R來(lái)擴(kuò)增目的基因片段。

1.2.2表達(dá)載體構(gòu)建及測(cè)序

用限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I和XhoI雙酶切oAiFADS17基因片段和pYES2/NT C表達(dá)載體，酶切產(chǎn)物經(jīng)切膠回收純化后進(jìn)行連接。取3 μL上述連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP 10。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，用目的基因引物進(jìn)行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，條帶大小正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3釀酒酵母轉(zhuǎn)化及重組轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)蛋白表達(dá)

采用PEG/LiAc法[14]轉(zhuǎn)化釀酒酵母，從平板上挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的陽(yáng)性克隆接種到5 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃ 200 r/min培養(yǎng)48 h。提取質(zhì)粒，用通用引物T7/T7 terminator(結(jié)合于多克隆位點(diǎn)上下游)進(jìn)行PCR驗(yàn)證并測(cè)序。挑取測(cè)序正確的釀酒酵母轉(zhuǎn)化子單菌落接種于SC-U培養(yǎng)基(含空質(zhì)粒的釀酒酵母轉(zhuǎn)化子為陰性對(duì)照，每組3個(gè)平行)，28 ℃培養(yǎng)48 h。測(cè)量OD600值，轉(zhuǎn)接入SC-U誘導(dǎo)培養(yǎng)基，調(diào)整OD600值達(dá)到0.4。同時(shí)根據(jù)需要，向培養(yǎng)基中添加不同碳鏈長(zhǎng)度PUFAs(見(jiàn)2.3.3)，28 ℃/12 ℃培養(yǎng)48 h后收集菌體。

1.2.4釀酒酵母轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定

用Trizol提取釀酒酵母菌體總RNA。以1 μg總RNA為模板，根據(jù)Prime Script RT reagent kit(TaKaRa, Otsu, Shiga, Japan)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，獲得cDNA。使用Bio-Rad CFX ConnectTMsystem 按照 iTaq Universal SYBR Green Supermix說(shuō)明進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：8 μL無(wú)酶水，10 μL iTaq Universal SYBR Green Supermix，0.5 μL q-oAiFADS17 F，0.5 μL q-oAiFADS17 R，1 μL cDNA模板，總體積20 μL。以釀酒酵母的18S rRNA作為內(nèi)參基因，根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。(注明：①ΔCt=待測(cè)樣品目的基因Ct值-待測(cè)樣品內(nèi)參Ct值；②ΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt-對(duì)照組ΔCt。)

1.2.5蛋白表達(dá)水平測(cè)

收集誘導(dǎo)后的菌體2 mL，10 000 r/min離心棄去上清。加入適量體積的裂解液(50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4, 1 mmol/L EDTA, 5% 1,2,3-丙三醇, 1 mmol/L PMSF, pH 7.4)使OD600值達(dá)到100，然后加入等體積的0.5 mm酸洗玻璃珠，置于漩渦振蕩器振蕩30 s后置于冰上30 s，如此重復(fù)4次后于13 000 r/min離心10 min，得到的上層懸液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，以100 μg總蛋白的上樣量進(jìn)行SDS-PAGE以及Western Blot[15]。

1.2.6底物特異性測(cè)定

收集誘導(dǎo)后的釀酒酵母菌體，真空冷凍干燥后置于研缽中充分研磨粉碎。稱(chēng)取20 mg菌體粉末采用脂肪酸甲酯化法[16]進(jìn)行提取，加入C15∶0(用于標(biāo)定鏈長(zhǎng)≤18C的脂肪酸)和C21∶0(用于標(biāo)定鏈長(zhǎng)>18C的脂肪酸)各100 μL作為內(nèi)標(biāo)。得到的脂肪酸甲酯使用GC-MS(Shimadzu Co., Japan)檢測(cè)[17]。色譜柱為Rtx-Wax(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)，汽化室和檢測(cè)器溫度分別為240 ℃和250 ℃，分流方式進(jìn)樣1 μL，分流比10∶1，載氣為氦氣。程序升溫：初始溫度120 ℃保持3 min，以5 ℃/min升到190 ℃，再以4 ℃/min升到220 ℃，保持20 min。

2　結(jié)果與討論

2.1oAiFADS17序列的生物信息學(xué)分析

oAiFADS17基因來(lái)自真菌媒介私囊菌，全長(zhǎng)1095 bp，編碼364個(gè)氨基酸，蛋白理論大小約41 kDa。為了考證oAiFADS17編碼的蛋白o(hù)AiFADS17是否與ω-3脂肪酸脫飽和酶同源，將其與5種已知的ω-3脂肪酸脫飽和酶氨基酸序列進(jìn)行了比對(duì)(圖1)。

利用Clustal W2工具的比對(duì)結(jié)果表明，oAiFADS17與已知ω-3脂肪酸脫飽和酶的同源性高于59%，且具有與其他ω-3脂肪酸脫飽和酶一樣的3個(gè)高度保守的組氨酸保守區(qū)HX3HH，HX2HH，HX2HH。進(jìn)一步通過(guò)脂肪酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模型分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，除位于親水區(qū)的3個(gè)組氨酸保守區(qū)外，oAiFADS17還具有位于疏水區(qū)的4個(gè)跨膜螺旋和2個(gè)膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域，共同構(gòu)成了ω-3脂肪酸脫飽和酶的催化活性中心，理論上符合ω-3脂肪酸脫飽和酶的基本特征。

2.2含oAiFADS17基因重組釀酒酵母菌的構(gòu)建

利用oAiFADS17 F/oAiFADS17 R引物通過(guò)PCR擴(kuò)增得到oAiFADS17基因序列，將其連接至pYES2/NT C載體，命名為pYES2-oAiFADS17。將重組質(zhì)粒以及空質(zhì)粒pYES2/NT C轉(zhuǎn)化入釀酒酵母INVSc 1，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，利用通用引物T7/T7 terminator進(jìn)行PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖3所示，2、3、4號(hào)轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增得到的片段在1 463 bp(1 095 bp+368 bp)左右，而轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒pYES2/NT C的1號(hào)轉(zhuǎn)化子在368 bp左右出現(xiàn)條帶，與理論大小一致。進(jìn)一步通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證表明1號(hào)為轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒pYES2/NT C的轉(zhuǎn)化子，2、3、4號(hào)為轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pYES2-oAiFADS17的轉(zhuǎn)化子。將得到1-4號(hào)轉(zhuǎn)化子分別命名為INVSc 1(pYES2/NT C)，INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)-1，INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)-2，INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)-3。

圖1　真菌媒介私囊菌的ω-3脂肪酸脫飽和酶(oAiFADS17)與偏好催化20C PUFAs的ω-3脂肪酸脫飽和酶氨基酸序列比對(duì)Fig.1　Multiple equence alignment of amino acids for ω-3 desaturases from Aphanomyces invadans (oAiFADS17) and which prefer to convert 20C PUFAs. PrD17:ω-3 desaturases from Phytophthora ramorum(GenBank accession No. FW362214.1); PsD17:ω-3 desaturases from Phytophthora sojae(GenBank accession No. FW362213.1); OPIN17:ω-3 desaturases from Phytophthora infestans(GenBank accession No. XM 002902553.1); PaD17:ω-3 desaturases from Pythium aphanidermatum(GenBank accession No. FW362186.1); SDD17:ω-3 desaturases from Saprolegnia diclina (GenBank accession No. AY373823.1). Black bars show the identical amino acid residues. Deletions are indicated by dashes. Boxes represent three typical histidine motifs

圖2　ω-3脂肪酸脫飽和酶oAiFADS17的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模型Fig.2　Topology model of ω-3 desaturase oAiFADS17 Cylinders A-F indicate transmembrane helices, and the black solid circles indicate three conserved histidine-rich motifs. Prediction of transmembrane helices and topology was performed with TMHMM, HMMTOP and TOP-PRED . The predicted topology model was in qualitative agreement with other membrane-bound enzymes

M-Marker; 1-對(duì)照, INVSc 1 (pYES2/NT C); 2-INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)-1; 3-INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)-2; 4-INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)-3圖3　釀酒酵母轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證Fig.3　PCR verification of yeast transformation

2.3 oAiFADS17脫飽和酶重組釀酒酵母菌的活性驗(yàn)證

2.3.1目的基因oAiFADS17轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定

將篩選獲得的3株轉(zhuǎn)化子于SC培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)2 d后收集菌體，通過(guò)RT-qPCR方法測(cè)定目的基因在轉(zhuǎn)化子中的轉(zhuǎn)錄水平。轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果表明在轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的釀酒酵母轉(zhuǎn)化子INVSc 1(pYES2/NT C)中未檢測(cè)到目的基因轉(zhuǎn)錄，而在轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的3個(gè)釀酒酵母轉(zhuǎn)化子INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)中，目的基因均有顯著表達(dá)(圖4)。

1-Control, INVSc 1 (pYES2/NT C); 2-INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)-1; 3-INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)-2; 4-INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)-3圖4　oAiFADS17基因相對(duì)表達(dá)量Fig.4　The relative expression level of oAiFADS17 ( **:P<0.001. All data are presented as mean ± SD.)

2.3.2目標(biāo)蛋白o(hù)AiFADS17表達(dá)水平測(cè)定

利用Western blot對(duì)重組菌株中目的蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行分析，具體方法參見(jiàn)1.2.5。轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的3個(gè)釀酒酵母轉(zhuǎn)化子均在45 kDa附近(表達(dá)載體上帶有3.4 kDa His標(biāo)簽，故檢測(cè)蛋白理論分子量大小約45 kDa)檢測(cè)到目標(biāo)蛋白的雜交條帶(圖5)，該蛋白的分子量大小與其理論值相符，說(shuō)明在釀酒酵母3個(gè)轉(zhuǎn)化子INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)中目的蛋白正確表達(dá)。

1-對(duì)照, INVSc 1 (pYES2/NT C); 2-INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)-1; 3-INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)-2; 4-INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)-3圖5　釀酒酵母轉(zhuǎn)化子的蛋白表達(dá)水平Fig.5　The protein expression level of yeast transformants

2.3.3釀酒酵母重組轉(zhuǎn)化子催化特性分析

為了檢測(cè)重組釀酒酵母菌株對(duì)AA的轉(zhuǎn)化率，將3個(gè)釀酒酵母轉(zhuǎn)化子在分別添加了0.05 ，0.1，0.2 mmol/L AA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)2 d，收集菌體后檢測(cè)其脂肪酸組成。氣相色譜圖顯示，轉(zhuǎn)入目的基因的釀酒酵母轉(zhuǎn)化子INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)在37.5 min處出現(xiàn)了信號(hào)峰(圖6c)，與EPA標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間一致(圖6a)，而轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的對(duì)照組釀酒酵母INVSc 1 (pYES2/NT C)在相應(yīng)的保留時(shí)間無(wú)信號(hào)(圖6b)。該信號(hào)峰與EPA標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間完全一致。進(jìn)一步將該峰對(duì)應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)譜圖與EPA標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖(圖7)比對(duì)，兩者一致，且均在m/z79、m/z91、m/z119處出現(xiàn)強(qiáng)的離子峰，確認(rèn)此物質(zhì)為EPA。以上GC-MS分析結(jié)果表明，釀酒酵母轉(zhuǎn)化子INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)能將ω-6系的AA轉(zhuǎn)化為ω-3系的EPA，oAiFADS17具有ω-3脂肪酸脫飽和酶活性。當(dāng)外源添加不同濃度的AA時(shí)(表2)，各轉(zhuǎn)化子對(duì)AA的轉(zhuǎn)化率非常接近。在AA濃度為0.05 mmol/L時(shí)，各轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)化率為36%～46%不等，而隨著AA濃度增高，各轉(zhuǎn)化子對(duì)AA的轉(zhuǎn)化率有所降低，原因可能是由于AA量達(dá)飽和導(dǎo)致。為了進(jìn)一步探究oAiFADS17對(duì)不同鏈長(zhǎng)脂肪酸的催化特性，選取釀酒酵母INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)-3以及對(duì)照組INVSc 1 (pYES2/NT C)轉(zhuǎn)化子在添加不同碳鏈長(zhǎng)度脂肪酸底物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加方式包括單一底物(0.2 mmol/L LA、GLA、DGLA、AA)及雙底物(0.1 mmol/L LA+0.1 mmol/L AA)形式，培養(yǎng)溫度分別為28 ℃和12 ℃。在兩種培養(yǎng)溫度下，釀酒酵母INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)-3對(duì)20CPUFAs的轉(zhuǎn)化率明顯高于18CPUFAs，且對(duì)AA轉(zhuǎn)化率最高，而在添加雙底物(LA+AA)條件下，轉(zhuǎn)化子對(duì)20C底物AA的偏好性更強(qiáng)，由此可知oAiFADS17偏好催化20CPUFAs，而對(duì)照組卻不能轉(zhuǎn)化任何一種底物。同時(shí)，釀酒酵母轉(zhuǎn)化子INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)在28 ℃下對(duì)各種脂肪酸的轉(zhuǎn)化率均高于12 ℃下的轉(zhuǎn)化率(表3)，說(shuō)明oAiFADS17在28 ℃下活性較高。綜上所述，oAiFADS17是一種在28 ℃對(duì)AA有較高催化活性的ω-3脂肪酸脫飽和酶。

a-EPA standard; b-Control, INVSc 1 (pYES2/NT C); c-INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)圖6　釀酒酵母轉(zhuǎn)化子INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)脂肪酸色譜圖Fig.6　Gas chromatogram of fatty acid methyl esters from lipid fraction of INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)

3　結(jié)論

本研究從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到一個(gè)新ω-3脂肪酸脫飽和酶基因oAiFADS17，并將此基因成功地在釀酒酵母系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)。通過(guò)外源添加底物，對(duì)該基因的轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)水平及底物特異性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明這種ω-3脂肪酸脫飽和酶(oAiFADS17)在28 ℃下可以催化18C和20C鏈長(zhǎng)的ω-6 PUFAs，尤其偏好催化20C鏈長(zhǎng)底物AA生成具更高附加值的EPA，對(duì)AA的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了46.3%。本研究為ω-3脂肪酸脫飽和酶偏好性的研究提供了新的資源，也為EPA的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

a-Mass spectrum of EPA in INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17); b-Mass spectrum of EPA standard圖7　EPA質(zhì)譜圖Fig.7　Mass spectrum of the EPA

表2　釀酒酵母轉(zhuǎn)化子INVSc 1 (pYES2-oAiFADS17)對(duì)AA的轉(zhuǎn)化率

注：1)Conversion rate is calculated as 100% ×Product/(Product+Substrate).

表3　不同溫度下釀酒酵母轉(zhuǎn)化子對(duì)不同底物轉(zhuǎn)化率

注：1)Conversion rae is calculated as 100%×Product/(Product+Substrate).

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Cloning, expression and characterization of a new ω-3 fatty acid desaturase

MEI Tian-tian, CHEN Hai-qin, HAO Guang-fei, GU Zhen-nan,CHEN Wei, CHEN Yong-quan

(School of Food Science and Technology, State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

ω-3 fatty acid desaturase can convert ω-6 PUFAs to ω-3 PUFAs, which is significant for the synthesis of ω-3 LC-PUFAs. In order to realize the production of EPA (eicosapentaenoic acid; 20∶5) at 28 ℃, a new gene which shares high sequence similarity with reported ω-3 fatty acid desaturases was screened in GenBank. After bioinformatics analysis, the new sequence was expressedinSaccharomycescerevisiaein codon optimized form. Its activity and substrate specificity was investigated through exogenous feeding different fatty acid substrates at different temperature. As a result, the new sequence-encoded protein named as oAiFADS17 could desaturate not only 18C PUFAs but also 20C PUFAs, with a strong preference for AA (arachidonic acid; 20∶4). The new desaturase was able to convert the ω-6 AA to the ω-3 EPA with a substrate conversion rate of 46.3% at 28 ℃. The enzymatic conversion rate for substrates with different carbon length at 28 ℃ was higher than that at 12 ℃. In this research, a new ω-3 desatutase oAiFADS17 with specific catalyzing function for 20C PUFAs, especially AA at 28 ℃, was successfully identified. The new enzyme provide theoretical basis for constructing EPA cell factory and its industrial production.

ω-3 desaturases; conversion rate; eicosapentaenoic acid (EPA)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608006

碩士研究生(陳海琴教授為通訊作者，E-mail：haiqinchen@jiangnan.edu.cn)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(21276108)

2015-1-18，改回日期：2016-2-19