胡影，王志剛，徐偉慧，胡云龍，劉帥，由義敏，趙曉松，蘇云鵬

兩種典型細(xì)菌的生長和氧化應(yīng)激酶對鄰苯二甲酸二丁酯的響應(yīng)

胡影，王志剛*，徐偉慧，胡云龍，劉帥，由義敏，趙曉松，蘇云鵬

齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006

鄰苯二甲酸二丁酯（Di-n-butyl phthalate，DBP）是一種廣泛存在于環(huán)境中的有機(jī)污染物，對環(huán)境構(gòu)成嚴(yán)重威脅，現(xiàn)已被中國環(huán)境監(jiān)測中心列入優(yōu)先控制污染物名單。本研究從黑土中分離出兩種典型細(xì)菌B. subtilis D13和E. coli Q5，以液體培養(yǎng)法接種于添加不同質(zhì)量濃度（0、5、10、20、40、80 mg·L-1）DBP的LB培養(yǎng)基中，測定兩種菌株的生長曲線；以分光光度法測定其氧化應(yīng)激酶系對DBP脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。結(jié)果表明，（1）DBP污染可抑制細(xì)菌生長，在對數(shù)生長期抑制作用顯著，但隨著污染時(shí)間的延長，B. subtilis D13菌株生長量呈恢復(fù)趨勢，抑制作用減緩；DBP污染對E. coli Q5的抑制作用更為顯著，且菌株生長未出現(xiàn)恢復(fù)趨勢。（2）經(jīng)DBP培養(yǎng)，6 h時(shí)兩種菌株的抗氧化應(yīng)激酶對污染出現(xiàn)應(yīng)答反應(yīng)，SOD活性隨著污染物濃度的升高而增加。（3）兩種細(xì)菌的CAT、GST活性與SOD活性的變化趨勢基本一致，酶活呈現(xiàn)DBP低濃度誘導(dǎo)而高濃度抑制的趨勢。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步研究DBP對微生物的生態(tài)毒理效應(yīng)提供理論基礎(chǔ)。

鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）污染；細(xì)菌的氧化應(yīng)激酶活性

引用格式：胡影， 王志剛， 徐偉慧， 胡云龍， 劉帥， 由義敏， 趙曉松， 蘇云鵬. 兩種典型細(xì)菌的生長和氧化應(yīng)激酶對鄰苯二甲酸二丁酯的響應(yīng)［J］. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)， 2016， 25（7）： 1225-1229.

HU Ying， WANG Zhigang， XU Weihui， HU Yunlong， LIU Shuai， YOU Yim in， ZHAO Xiaosong， SU Yunpeng. Response of Bacterial Grow th and the Activities of Oxidative Enzymes to Di-n-butyl Phthalate Contam ination ［J］. Ecology and Environmental Sciences，2016， 25（7）： 1225-1229.

鄰苯二甲酸酯（Phthalate esters，PAEs）類化合物作為塑料制品的成型劑而被廣泛使用（Xia et al.，2011），而鄰苯二甲酸二丁酯（Di-n-butyl phthalate，DBP）是PAEs中應(yīng)用最為廣泛的一種。由于塑料制品的長期大量使用，DBP已成為我國最為普遍的有機(jī)污染物之一，在土壤、水體、空氣以及沉積物中均被檢出（Kong et al.，2012；Sun et al.，2013；He et al.，2015）。土壤中的DBP源自于農(nóng)膜、農(nóng)藥、殺蟲劑和化肥等的使用，其中農(nóng)膜是導(dǎo)致其含量超標(biāo)的主要原因（Wang et al.，2015；Zhang et al.，2015a），且與塑料薄膜的使用量有顯著關(guān)聯(lián)性（Wang et al.，2013）。目前，我國部分東北黑土的DBP平均污染含量為7.60 mg·kg-1（Xu et al.，2008），遠(yuǎn)超美國環(huán)保署制定的安全標(biāo)準(zhǔn)（Niu et al.，2014；朱媛媛等，2012），已對黑土肥力和生產(chǎn)力構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分，可參與土壤的物質(zhì)循環(huán)，并優(yōu)化土壤生態(tài)，是評價(jià)土壤健康及土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的重要指標(biāo)（宋長青等，2013；Diacono et al.，2010）。前人在群體水平上的研究發(fā)現(xiàn)，PAEs類污染可抑制黑土微生物的呼吸速率與微生物代謝熵（王志剛等，2015a），DBP污染能改變黑土功能微生物的豐度與黃瓜根際微生物群落結(jié)構(gòu)（王志剛等，2015b；Zhang et al.，2015b），然而，單一種類微生物對DBP污染的響應(yīng)過程尚不明確。生物體的抗氧化應(yīng)激酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（CAT）和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）等，他們對環(huán)境脅迫尤為敏感，其活性可被氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)而做出積極的應(yīng)答反應(yīng)。因此，研究黑土典型微生物的生長和抗氧化應(yīng)激酶對DBP污染的響應(yīng)，對于闡明DBP的生態(tài)毒理效應(yīng)具有重要意義。

1　材料與方法

1.1菌株與菌體收集

革蘭氏陽性菌株B. subtilis D13和革蘭氏陰性菌株E. coli Q5均從齊齊哈爾市克山縣黑土耕層中分離純化，由齊齊哈爾大學(xué)環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室保存。將分離的菌株接種于LB培養(yǎng)基（pH 7.0）中活化，30 ℃、轉(zhuǎn)速130 r·m in搖床培養(yǎng)。

1.2生長曲線測定

DBP（純度≥99.9%）購于中國標(biāo)準(zhǔn)物樣品信息中心，助溶劑為丙酮，制備成1000 mg·L-1儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩⑻幱趯?shù)生長期的菌株按2%的接種量接入添加不同質(zhì)量濃度（0、5、10、20、40、80 mg·L-1）DBP的LB培養(yǎng)基（pH 7.0）中，30 ℃下振蕩培養(yǎng)；于600 nm波長下測定菌液吸光值，以0 mg·L-1DBP為空白對照，每處理3組平行。

1.3粗酶液制備與酶活性測定

分別于0、6、24 h吸取細(xì)菌培養(yǎng)液，參照王志剛等（2015c）的方法制備粗酶液。以DBP處理0 h為對照，每處理3組平行。

采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，參照說明書測定抗氧化酶活性。3種酶的酶活單位（U·mg-1）定義為：以1 m L反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位（U）；以1 mg蛋白或血紅蛋白中過氧化氫酶（CAT）在 1 s內(nèi)分解吸光度為0.50～0.55的底物中的過氧化氫相對量為一個(gè)酶活力單位；以1 mg蛋白在37 ℃反應(yīng)l m in，扣除非酶促反應(yīng)，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol·L-1為一個(gè)酶活力單位。蛋白含量的測定采用Bradford（1976）法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Sigma Plot 12.5進(jìn)行圖表繪制。

2　結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌生長對DBP的響應(yīng)

由圖1可知，添加不同質(zhì)量濃度DBP，均對B. subtilis D13和E. coli Q5產(chǎn)生了抑制效應(yīng)。初始4 h為細(xì)菌生長遲緩期，DBP的抑制作用較弱，而在進(jìn)入對數(shù)生長期后，細(xì)菌生長受到明顯抑制，且抑制作用隨DBP質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。細(xì)菌到達(dá)生長平穩(wěn)期后，各處理組的細(xì)菌生長量雖低于對照，但隨時(shí)間推移B. subtilis D13生長量呈恢復(fù)增加的趨勢（圖1a）。與B. subtilis D13相比，DBP對E. coli Q5的抑制效應(yīng)更為顯著，且抑制作用隨DBP污染濃度的增加而增強(qiáng)，平穩(wěn)期細(xì)菌生長未出現(xiàn)恢復(fù)增加趨勢（圖1b）。

2.2細(xì)菌SOD酶活力對DBP的響應(yīng)

B. subtilis D13和E. coli Q5的SOD酶活力對DBP的響應(yīng)如圖2。對照組（0 mg·L-1）的SOD酶活力低于DBP處理組，而DBP處理6 h和24 h的SOD活性呈不同程度的增加趨勢。DBP質(zhì)量濃度為5～40 mg·L-1時(shí)，隨著污染濃度的升高，B. subtilis D13的SOD酶活性增加，并在40 mg·L-1處達(dá)到最大值（110.73 U·mg-1）；在培養(yǎng)24 h時(shí)，B. subtilis D13的SOD活性隨著處理濃度的升高（20～80 mg·L-1）而持續(xù)升高，且在80 mg·L-1處仍呈上升趨勢，酶活性為130.86 U·mg-1（圖2a）。DBP處理6 h和24 h時(shí)，E. coli Q5的SOD酶活力隨污染濃度的升高而增加，40 mg·L-1處理的SOD酶活力最大，分別為151.18 U·mg-1和147.46 U·mg-1，隨后SOD活性降低（圖2b）。

圖1　DBP污染對B. sub tilis D13（a）和E. coli Q 5（b）生長的影響Fig. 1　Impact of DBP contam ination on the grow th of B. subtilis D13 （a） and E. coli Q5 （b）

2.3細(xì)菌CAT酶活力對DBP的響應(yīng)

由圖3可知，DBP處理的B. subtilis D13和E. coli Q5的CAT活性均高于對照組。處理6 h時(shí)，在DBP質(zhì)量濃度在5～40 mg·L-1范圍內(nèi)，B. subtilis D13的CAT活性隨處理濃度的升高而增加，之后酶活性隨處理濃度的升高而降低，40 mg·L-1處理CAT活性達(dá)最大值（0.62 U·mg-1）；培養(yǎng)24 h時(shí)，B. subtilis D13的CAT活性變化趨勢與DBP處理6 h時(shí)大致相同，40 mg·L-1處理的CAT活性為0.48 U·mg-1（圖3a）。處理6 h時(shí)，E. coli Q5在DBP質(zhì)量濃度為20 mg·L-1時(shí)，CAT活性達(dá)到最大值（0.90 U·mg-1），之后CAT活性隨處理濃度升高而降低；而DBP處理24 h時(shí)，E. coli Q5的CAT活性無顯著變化（圖3b）。

2.4細(xì)菌GST酶活力對DBP的響應(yīng)

DBP處理6 h時(shí)的GST活性增加幅度與24 h時(shí)的相比差別較大，在DBP質(zhì)量濃度為5～40 mg·L-1時(shí)，B. subtilis D13的GST活性隨污染物濃度的升高而增加，10 mg·L-1處理GST活性達(dá)最大值（0.28 U·mg-1），而處理24 h時(shí)，GST活性最大值出現(xiàn)在40 mg·L-1處理組（0.26 U·mg-1）（圖4a）。E. coli Q5 GST活性變化趨勢與B. subtilis D13大致相同，但DBP處理6 h時(shí)，GST活性在20 mg·L-1處理出現(xiàn)最大值（0.29 U·mg-1），24 h時(shí)GST活性在40 mg·L-1處理出現(xiàn)最大酶活（0.25 U·mg-1），之后GST活性隨污染物濃度的升高而降低（圖4b）。

圖2　B. subtilis D13（a）和E. co li Q5（b）SOD活性的變化Fig. 2　Variation of SOD activities in B. subtilis D13 （a） and E. coli Q5 （b）

圖3　B. subtilis D13（a）和E. coli Q5（b）CAT活性的變化Fig. 3　Variation of CAT activities in B. subtilis D13 （a） and E. coli Q5 （b）

3　討論

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中不可缺少的重要成分，可參與土壤營養(yǎng)元素循環(huán)與多種生物化學(xué)反應(yīng)，在優(yōu)化土壤生態(tài)功能與維持黑土肥力等方面具有至關(guān)重要的作用（王志剛等，2012；Graham et al.，2014），同時(shí)，微生物的物種和功能多樣性是評價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)（Qiu et al.，2012）。最新研究表明，DBP可以干擾黑土微生物的代謝活動(dòng)，改變微生物的群落結(jié)構(gòu)，并且隨DBP濃度的升高，細(xì)菌的多樣性顯著下降（Wang et al.，2016）。DBP污染可使土壤細(xì)菌總量和種群發(fā)生變化，但對單一細(xì)菌種類是否會(huì)產(chǎn)生影響，同時(shí)單一細(xì)菌會(huì)對DBP污染脅迫做出何種應(yīng)答尚不明確。因此，本研究通過監(jiān)測DBP污染下黑土典型革蘭氏陽性細(xì)菌B. subtilis D13和革蘭氏陰性細(xì)菌E. coli Q5的生長及抗氧化應(yīng)激酶活性的變化，探究單一細(xì)菌對DBP的響應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)不同濃度DBP處理后，B. subtilis D13和E. coli Q5的生長受到不同程度的抑制，抑制作用與處理濃度呈正相關(guān)；DBP對E. coli Q5抑制作用較強(qiáng)，而對B. subtilis D13抑制作用較弱。原因可能是B. subtilis D13為革蘭氏陽性菌，細(xì)胞壁比陰性菌的厚，且可產(chǎn)生芽孢，對不利環(huán)境有更強(qiáng)的適應(yīng)性與抗性（Edvantoro et al.，2003）。同時(shí)，污染物也可能在微生物的細(xì)胞質(zhì)膜上累積，并降低質(zhì)膜的流動(dòng)性（Sun et al.，2006）。因此，DBP可能更易在E. coli Q5中積累并抑制其生長。

微生物在代謝過程中會(huì)積累少量的活性氧，正常情況下，活性氧與抗氧化應(yīng)激酶之間處于動(dòng)態(tài)平衡，但當(dāng)活性氧過量累積時(shí)，抗氧化應(yīng)激酶就會(huì)通過代償機(jī)制被激活（Cartw right et al.，2000）。SOD作為O2-專一的清除劑，O2-脅迫應(yīng)急響應(yīng)中首先合成的是SOD，并通過歧化反應(yīng)迅速將O2-轉(zhuǎn)化為H2O2，隨后CAT對H2O2進(jìn)行分解，從而消除脅迫效應(yīng)（燕國梁，2006）。本實(shí)驗(yàn)中，DBP污染可提高細(xì)菌SOD和CAT活性，且CAT與SOD具有相同的變化趨勢，呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)高濃度抑制的趨勢，與秦潔芳等（2011）的研究結(jié)果相同，但與王志剛等（2015c）的研究結(jié)果不盡相同。與CAT對DBP污染的響應(yīng)結(jié)果相比，DMP污染引起CAT活性呈低濃度激活而高濃度抑制的變化趨勢，產(chǎn)生此結(jié)果的原因可能與污染物的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。DMP是PAEs類污染物中結(jié)構(gòu)最簡單、水溶性最高的一類，與DBP相比，更易與細(xì)菌接觸并進(jìn)入胞內(nèi)而迫使細(xì)菌對H2O2脅迫做出應(yīng)答。GST可催化谷胱甘肽（GSH）與親電性中間代謝產(chǎn)物結(jié)合，在減輕氧化脅迫與解毒方面具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)中，GST活性隨污染物濃度的升高而增加，且處理6 h的GST活性高于24 h。穆景利等（2009）研究苯并［a］芘對黑鯛肝臟GST活性影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黑鯛肝臟GST活性可在較短的時(shí)間內(nèi)被誘導(dǎo)，且誘導(dǎo)效應(yīng)在初期高于后期，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說明污染物濃度與處理時(shí)間是誘導(dǎo)GST活性的重要因素。與B. subtilis D13相比，E. coli Q5的GST活性較高，也說明DBP對E. coli Q5的脅迫作用較大，E. coli Q5的GST活性對DBP脅迫的響應(yīng)程度高于B. subtilis D13。

綜上所述，DBP污染對細(xì)菌的生長有抑制作用，細(xì)菌抗氧化應(yīng)激酶（SOD、CAT、GST）活性總體表現(xiàn)出低濃度激活而高濃度抑制的趨勢，3種酶協(xié)同作用消除因脅迫產(chǎn)生的氧化損傷，對DBP污染做出應(yīng)答響應(yīng)，說明DBP污染會(huì)引起細(xì)菌的氧化損傷，但其損傷機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

圖4　B. subtilis D13（a）和E. co li Q 5（b）GST活性的變化Fig. 4　Variation of GST activities in B. subtilis D13 （a） and E. coli Q5 （b）

4　結(jié)論

DBP污染可抑制細(xì)菌的生長，細(xì)菌抗氧化應(yīng)激酶在短期內(nèi)升高，對DBP污染做出應(yīng)答響應(yīng)。由此認(rèn)為，DBP污染可改變單一細(xì)菌的生長狀況，進(jìn)而影響土壤微生物群落的穩(wěn)定性。

致謝：誠摯感謝Kui Chen教授在論文寫作過程中提供寶貴意見！

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Response of Bacterial Growth and the Activities of Oxidative Enzymes to Di-n-butyl Phthalate Contamination

HU Ying， WANG Zhigang*， XU Weihui， HU Yunlong， LIU Shuai， YOU Yimin， ZHAO Xiaosong， SU Yunpeng
Institute of Life Science and Agriculture and Forestry， Qiqihar University， Qiqihar 161006， China

Di-n-butyl phthalate （DBP） is a ubiquitous organic pollutant in black soil. Because it is widely detected in China's agricultural soil， DBP has been listed as an environmental priority pollutant by China State Environmental Protection Administration. The purpose of the study was to estimate the responses of the growth and activities of oxidative enzymes to DBP with various concentration in B. subtilis D13 （a typical gram-positive bacterium） and E. coli Q5 （a typical gram-negative bacterium） by liquid cultivation and spectrophotometry. The results showed that： （1） the growth of two strains were inhibited by DBP， the effect was more significant at the logarithmic phase. Along with the increase of time， the growth of B. subtilis D13 had recovered， however， E. coli Q5 was not， it appeared more sensitive to DBP than the B. subtilis D13 did. （2） The activities of SOD in the two typical bacteria were increased along with the increase of DBP concentration， which meant that activities of SOD could be correlated to the impact of DBP in B. subtilis D13 and E. coli Q5. （3） Similarly， the trend on the activities of CAT and GST was basically consistent with that on SOD in the two bacteria， that is， the low concentration of DBP could promote enzyme activity， however， and the high concentration of DBP could reduce the activity. The result provides an important basis for further study on the toxicological effect of DBP on microorganisms.

Di-n-butyl phthalate （DBP）； oxidative stress enzyme

10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.07.019

X172

A

1674-5906（2016）07-1225-05

黑龍江省青年基金項(xiàng)目（QC2013C032）

胡影（1989年生），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物毒理學(xué)。E-mail： Mysylviavip@163.com *通信作者

2016-07-02