張 何，鄧星辰，張 潔，傅 昕，葉鄭堃

(湖南工程學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，湘潭 411104)

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基于磁納米顆粒和G-四鏈體DNA酶的Hg2+傳感器研究

張 何，鄧星辰，張 潔，傅 昕，葉鄭堃

(湖南工程學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，湘潭 411104)

以磁納米顆粒(MNPs)為固定DNA探針的固相載體，發(fā)展了一種基于分子間裂分G-四鏈體-血紅素DNA酶以及T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的Hg2+“Turn on”檢測生物傳感器.考察了多種因素對檢測體系的影響，在最優(yōu)實驗條件下，該傳感器體現(xiàn)出良好的選擇性、靈敏度以及抗干擾能力，而且具有可靠的實際水體樣品檢測能力.以磁納米顆粒為固相載體，可實現(xiàn)高效、快速及簡單的分離，有效的提高檢測靈敏度和降低背景信號.

磁納米顆粒；分子間裂分G-四鏈體；DNA酶；比色分析；Hg2+

0 引言

近年來由于汞和汞鹽的大量生產(chǎn)、使用和不當(dāng)排放，汞污染已成為全球性重大環(huán)境問題之一.水、土壤及大氣中的汞，通過食物鏈在生物和人體內(nèi)不斷富集，可損害中樞和末梢神經(jīng)，引發(fā)水俁病、運動失調(diào)、胎兒腦損傷等多種疾病，嚴(yán)重危害著人類的生存和健康[1].在汞污染治理和控制的同時，發(fā)展靈敏度高、響應(yīng)快且抗干擾能力強的Hg2+檢測方法具有重要的現(xiàn)實意義.

目前比較成熟的汞檢測技術(shù)多為儀器分析方法，如原子熒光光譜法[2]、電化學(xué)法[3]等.這些方法具有較好的特異性、準(zhǔn)確性及靈敏性，但該類技術(shù)依賴大型儀器、樣品前處理步驟復(fù)雜、不適合廉價快速的現(xiàn)場實時檢測.利用DNA生物傳感器檢測 Hg2+，主要是依據(jù)核酸中的胸腺嘧啶可以特異性識別Hg2+，形成特殊的T-Hg-T結(jié)構(gòu)[4].Ono A等[5]首次報道了一種基于Thymine-Hg2+-Thymine配位的Hg2+檢測新技術(shù)，該技術(shù)以DNA作為Hg2+的識別元件，具有靈敏度高、特異性好、檢測流程不復(fù)雜且檢測快速等特點，該技術(shù)的建立為Hg2+的快速、高效檢測開辟了新思路.這類型方法優(yōu)勢雖然明顯，但仍然存在一定的局限性，由于傳感器沒有構(gòu)建有效的分離體系，在復(fù)雜生物樣品檢測時容易受到干擾.

磁納米顆粒是一種納米級磁性材料，因其具有磁導(dǎo)向性和良好的生物相容性，可以與許多生物功能分子結(jié)合，在生物組分分離領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[12-13].在傳感器的研究進程中，通過體外篩選和SELEX擴增技術(shù)，人們發(fā)現(xiàn)了一種由富含G堿基的寡核苷酸序列與卟啉鐵(hemin)結(jié)合形成的具有過氧化物酶催化活性的DNA酶，其具有G-四鏈體空間結(jié)構(gòu)[14-15].Hemin嵌入式G-四鏈體DNA酶的催化性能遠比游離hemin的強，這種新型的DNA酶制成生物傳感器后，被廣泛地用于生物分子和金屬離子分析[6].

本研究以磁納米顆粒為DNA探針的固相載體，發(fā)展了一種基于分子間裂分G-四鏈體-血紅素DNA酶以及T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的新型Hg2+“Turn on”檢測生物傳感器，因為Hg2+識別和催化顯色步驟分開，通過磁分離有效排除了非特異性干擾，實現(xiàn)了實際水體樣品中Hg2+的快速、靈敏、特異的比色分析.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-1800型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；臺式冷凍恒溫搖床(太倉市實驗設(shè)備廠)；超純水器(德國默克密理博公司)；pH酸度計(杭州陸恒生物科技有限公司)；磁分離架(無錫百運納米科技有限公司).DNA序列A(5’-GGGTAGGGCGGGAACTTTGATTTTGTTTTATCA TGGACGTGCGTGTGAC-C10-Biotin 3’)和DNA序列B(5’-GTCACACGCACGTCCATGATTTTTCATTTT CTTTGAAGGGT-3’)由上海生工生物工程股份有限公司合成并經(jīng)HPLC純化；鏈霉親和素功能化的磁納米顆粒(MNPs，直徑100nm，德國Chemicell公司)；氯化血紅素(hemin)、2,2’-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻挫啉-6-磺酸(ABTS)、30%H2O2、二甲亞砜(DMSO)、HgCl2、Pb(NO3)2、CdCl2、FeCl2及其他金屬離子均購自上海生工生物工程股份有限公司；牛血清白蛋白(BSA)購自上海華藍化學(xué)科技有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 磁納米顆粒功能化

離心管用1%的BSA溶液潤洗后，加入15μL包裹鏈霉親和素的MNPs(直徑為100nm,10mg/mL)，同時加入100μL檸檬酸鹽緩沖液(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉，pH=7.0)，漩渦攪拌，磁分離后棄去上層液，以除去磁珠溶液中的疊氮化鈉，重復(fù)清洗 3次.然后向MNPs中加入15μL檸檬酸鹽緩沖液和15μL DNA序列A (100pmol)，混勻后37℃條件下恒溫搖床振蕩反應(yīng)1h，使得反應(yīng)中磁納米顆粒始終處于懸浮狀態(tài).反應(yīng)結(jié)束后，加入150μL PBS(pH=7.4)清洗3次，以去除多余的DNA序列A.在4℃條件下，功能化的MNPs用100μL 2%的BSA溶液封閉 1h，以減少非特異性吸附，命名為MNPs/DNA-A.將上述溶液磁分離后，加入50μL Tris緩沖液(25mmol/L Tris-HCl,100mmol/L NaCl,2mmol/LmgCl2,5mmol/LkCl)和15μL DNA序列B(10μmol/L)，37℃條件下恒溫搖床振蕩反應(yīng) 30min，形成部分互補的雙鏈DNA，命名為MNPs/DNA-A/DNA-B.溶液磁分離后，用PBS洗滌3次去除多余的DNA序列B，再加入50μL Tris緩沖液4℃下保存待用.

1.2.2 檢測方法

取10μL雜交后的磁納米顆粒(MNPs/DNA-A/DNA-B)，用PBS洗滌1次，加入200μL檢測試樣(含不同濃度Hg2+的Tris緩沖液或者實際樣品)，攪拌均勻后加入1μL 100μmol/L的hemin于37℃條件下避光反應(yīng)1h，形成MNPs/DNA-A-Hg2+-DNA-B G-四鏈體酶，用Tris緩沖液洗滌去除未反應(yīng)的hemin.當(dāng)MNPs/DNA-A-Hg2+-DNA-B G四鏈體酶磁分離后，加入4mmol/L ABTS和4mmol/L H2O2各50μL，37℃反應(yīng)8min后，將磁珠沉降直接對上層清液進行紫外吸收檢測.我們選擇 420nm 處的吸光度作為測量值，定義 ΔA420nm=A420nm-A0，其中A420nm為樣品測量值，A0為Hg2+濃度為0時的背景值.

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測原理

本研究借助T-Hg2+-T堿基對的形成以及G-四鏈體DNA酶的氧化還原催化特性，在磁納米顆粒上構(gòu)建了一種Hg2+的“Turn-on”檢測新方法.該方法使用了兩條寡聚核苷酸探針鏈(圖1，序列A和序列B)，序列A 中3’端帶有生物素標(biāo)記和C10延長鏈，通過生物素和鏈霉親和素的特異性結(jié)合，固定到鏈霉親和素修飾的磁納米顆粒表面.序列A和序列B部分反向互補，兩者雜交形成部分互補的dsDNA.序列A的5’端含有三組GGG重復(fù)序列，序列B的3’端含有一組GGG的重復(fù)序列，它們各自都不滿足G-四鏈體的形成條件(G-四鏈體的形成至少需要4組連續(xù)的G序列).在沒有Hg2+存在時，由于T-T堿基錯配導(dǎo)致序列A的5’端和序列B的3’端距離較遠，無法形成G-四鏈體，因此檢測體系基本上不顯示酶活性.當(dāng)加入Hg2+時，Hg2+插入T-T堿基形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T配位，從而使序列A的5’端和序列B的3’端的兩段富G序列相互接近，進而折疊形成分子間裂分G-四鏈體，hemin插入G-四鏈體，導(dǎo)致明顯增強的類過氧化物酶的催化活性，能催化ABTS-H2O2體系，生成淺綠色的ABTS+，在420nm處有紫外吸收.

磁納米顆粒具有很好的生物相容性.環(huán)境水樣或者生物醫(yī)學(xué)樣品都含有一定的檢測干擾成分，這些復(fù)雜成分在一定程度上會對G-四鏈體的顯色體系產(chǎn)生影響.因此以磁納米顆粒作為分離手段，在復(fù)雜實際樣品中與被測物Hg2+反應(yīng)后可通過磁分離手段與樣品中的復(fù)雜成分分離，這對檢測體系的穩(wěn)定性是有益的.同時，分離過程中，過量的hemin被除去，屏蔽了由于hemin存在時導(dǎo)致的背景升高的影響，檢測時空白背景降低，提高了檢測靈敏度.

圖1 組裝的DNA酶傳感器檢測Hg2+原理圖

2.2 “Turn-on”型Hg2+傳感器的紫外表征

圖2為“Turn-on”型Hg2+傳感器的紫外表征圖.由于mNPs 本身也具有一定的辣根過氧化物酶催化活性[7]，但購買的MNPs表面已經(jīng)包裹鏈霉親和素，另外我們用2% BSA溶液對mNPs/DNA-A表面做封閉處理，使得功能化的磁性納米顆粒只具有極低的過氧化物酶活性(見圖2)，經(jīng)BSA處理后的mNPs 還可以有效降低DNA在磁顆粒表面的非特異吸附.向MNPs/DNA-A中分別加入hemin(圖2c)和DNA-B 與hemin的混合溶液(圖2d)，其各自的催化效率都較低，這是因為體系中沒有目標(biāo)物 Hg2+存在，由于T-T堿基錯配的存在導(dǎo)致DNA-A的5’端和DNA-B的3’端距離較遠，無法形成G-四鏈體.在加入Hg2+后(濃度為200nmol/L)，420nm處的吸光值大幅上升，這是由于ABTS-H2O2催化反應(yīng)急劇增加(圖2a).這說明當(dāng)體系中存在Hg2+時，由于T-Hg2+-T 結(jié)構(gòu)的形成使DNA-A的5’ 端和DNA-B的3’ 端的兩段富G序列相互接近，進而折疊形成分子間裂分G-四鏈體DNA 酶，使得催化 H2O2存在下的 ABTS 氧化反應(yīng)活性增強，這也說明420nm 處吸光度值的升高與 Hg2+有關(guān).ABTS在未氧化成ABTS+前在400～500nm范圍內(nèi)的吸收信號很低(如圖2e所示).

圖2 不同組分體系中Hg2+傳感器的紫外吸收曲線

2.3 實驗條件的優(yōu)化

為獲得最好的實驗結(jié)果，我們對實驗的最佳條件進行了摸索.根據(jù)磁納米顆粒產(chǎn)品的性能，100μL(含1mgmNPs)的MNPs可以結(jié)合150pmol生物素化探針，本實驗取出的15μL 包裹鏈霉親和素的MNPs則可以結(jié)合22.5pmol生物素化探針，優(yōu)化實驗Hg2+濃度均為200nmol/L.考察了修飾體系中DNA序列A的量為25pmol、50pmol、75pmol、100pmol、125pmol、150pmol時對G-四鏈體DNA酶催化性能的影響.結(jié)果如圖3(a)所示，當(dāng)修飾時序列A的量為100pmol時MNPs表面的探針固定量達到最高，催化性能達到飽和.ABTS和H2O2按照1∶1比例發(fā)生氧化還原反應(yīng)，參照文獻[8-9]，實驗中ABTS和H2O2的用量均為2mmol/L.考察了DNA酶傳感器與Hg2+的反應(yīng)時間對檢測性能的影響.如圖3(b)所示，當(dāng)反應(yīng)時間從15min增加到60min時，反應(yīng)體系的ΔA420nm增加，說明隨著時間的延長，G-四鏈體DNA酶的組裝量增加，催化性能增強，反應(yīng)時間達到60min時體系的ΔA420nm達到最大，說明此時Hg2+的捕獲趨于飽和，所以選擇60min作為Hg2+的捕獲時間.另外，在對DNA酶催化反應(yīng)的最適溫度進行了考察，選擇了6個不同的溫度：20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃.如圖3(c)所示，隨著DNA酶催化反應(yīng)溫度的升高，其酶活性增加，體現(xiàn)在反應(yīng)體系ΔA420nm的增加，當(dāng)溫度達到37℃時，該酶活性達到最高，這主要是由于DNA在37℃時其生物活性較高.

圖3 (a)DNA-A的量對ΔA420nm的影響；(b)Hg2+的捕獲時間對ΔA420nm的影響；(c)DNA酶催化溫度對ΔA420nm的影響

2.4 方法的選擇性

為了考察組裝的傳感器對汞及其他金屬離子的選擇性，選擇了Pb2+、Cd2+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Fe2+、Mn2+作為共存離子，共存離子的濃度與汞離子的濃度之比為100∶1.由圖4可知，在最佳實驗條件下，當(dāng)Hg2+與其他金屬離子共存時，其ΔA420nm值與相同濃度的Hg2+單獨存在時相比，相對誤差在-7.4%～1.4%之間，說明水樣中存在的大量共存離子不影響傳感器對Hg2+的高選擇性分析.

圖4 Hg2+傳感器的特異性，柱狀圖表示100nmol/L Hg2+與10μmol/L其他干擾離子共存時的ΔA420nm值

2.5 Hg2+的定量分析

2.5.1 線性范圍及檢出限

在優(yōu)化實驗條件下，考察了基于G-四鏈體DNA酶的Hg2+“Turn-on”型檢測傳感器對不同濃度Hg2+(2～300nmol/L)的響應(yīng)情況.如圖5所示，當(dāng)Hg2+濃度在150nmol/L以下時，隨著Hg2+濃度的增加，ΔA420nm值也隨之增加，但增至150nmol/L以上后，ΔA420nm值幾乎不再變化.當(dāng)Hg2+離子濃度在2～80nmol/L 之間時，呈現(xiàn)良好的線性，回歸方程為ΔA420nm=0.015+0.0013CHg2+(C: nmol?L-1)，線性相關(guān)系數(shù)r2為0.996.以空白的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率得到本方法的檢出限為0.7nmol/L.重復(fù)6 次測定10nmol/L 的汞離子，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.7%.與其他比色分析Hg2+DNA傳感器比較，如：基于金納米顆粒的Hg2+比色傳感器(檢出限60nmol/L[10]、檢出限100nmol/L[9])、基于DNAzyme/ABTS-H2O2體系的Hg2+比色傳感器(250nmol/L[8]、19 nmol/L[11])，本方法可以檢測復(fù)雜試樣體系，而且具有較高檢測靈敏度.

圖5 Hg2+濃度在2～300nmol/L范圍內(nèi)的校正曲線，插圖為線性范圍圖

2.5.2 實際水樣的測定

我們選擇了三種實際水體樣品進行分析，分別來自自來水、湖水、河水，過濾去除懸浮顆粒及雜質(zhì)，用本方法對實際水體樣品中的Hg2+含量進行了檢測，結(jié)果如表1所示.自來水和河水中的Hg2+含量很低，超出了我們的線性范圍.采用加標(biāo)回收法測得樣品的平均回收率為96.5%～102.5%之間，RSD在1.4%～2.7%之間，說明設(shè)計的傳感器可用于天然水體中Hg2+檢測，具有很好的準(zhǔn)確度.

表1 水體樣品分析結(jié)果及加標(biāo)回收實驗(n=5)

3 結(jié)果與討論

綜上所述，本研究以磁納米顆粒和分子間裂分式G-四鏈體-氯化血紅素DNA酶為基礎(chǔ)發(fā)展了一種“Turn-on”型Hg2+比色傳感器.磁納米顆粒的引入極大的增強了傳感器的抗干擾能力，降低了背景信號，可以實現(xiàn)天然水體中痕量Hg2+的快速檢測，加標(biāo)回收率誤差在允許的范圍內(nèi).本方法操作簡單、靈敏度高、特異性好，適合發(fā)展為環(huán)境監(jiān)測現(xiàn)場實時分析技術(shù).

[1] Lin Y,Vogt R,Larssen T.Environmentalmercury in China: a Review[J].Environ.Toxicol.Chem.,2012,31(11) : 2431-2444.

[2] Zheng C B,Li Y,He Y,ma Q,Hou X D.Photo-induced Chemical Vapor Generation with Formic Acid for Ultrasensitive Atomic Fluorescence Spectrometric Determination ofmercury: Potential Application tomercury Speciation in Water[J].J.Anal.At.Spectrom.,2005,20(8): 746-750.

[3] Lu J Q,He X W,Zeng X S,Wan Q J,Zhang Z Z.Voltammetric Determination ofmercury (II) in Aqueousmedia Using Glassy Carbon Electrodesmodified with Novel Calix Arene[J].Talanta,2003,59 (3):553-560.

[4] Yang S Y,Wu C,Tan H,Wu Y,Liao S Z,Wu Z Y,Shen G L,Yu R Q.Label-free Liquid Crystal Biosensor Based on Specific Oligonucleotide Probes for Heavymetal ions[J].Anal.Chem.,2013,85(1): 14-18.

[5] Ono A,Togashi H.Highly Selective Oligonucleotide-based Sensor formercury(II) in Aqueous Solutions[J].Angew.Chem.Int.Ed.,2004,43(33): 4300-4302.

[6] Zhou X H,kong Dm,Shen H X.Ag+and Cysteine Quantitation Based on G-quadruplex-hemin DNAzymes Disruption by Ag+[J].Anal.Chem.,2010,82(3): 789-793.

[7] Gao L Z,Zhuang J,Nie L,Zhang J B,Zhang Y,Gu N,Wang T H,Feng J,Yang D L,Perrett S,Yan X.Intrinsic Peroxidase-like Activity of Ferromagnetic Nanoparticles[J].Nat.Nanotechnol.,2007,2(9): 577-583.[8] Li T,Dong S J,Wang Ek.Label-free Colorimetric Detection of Aqueousmercury Ion (Hg2+) Using Hg2+-modulated G-quadruplex-based DNAzymes[J].Anal.Chem.,2009,81(6): 2144-2149.

[9] 高曉霞，賈玉華，楊金鳳，李繼山，楊榮華．核酸酶催化放大傳感體系的設(shè)計及其在鉛離子比色檢測中的應(yīng)用[J].分析化學(xué),2013,41(5): 670-674.

[10] Wu Jk,Li L Y,Zhu D,He P G,Fang Y Z,Cheng G F.Colorimetric Assay formercury (II) Based onmercury-specific Deoxyribonucleic Acid-functionalized Gold Nanoparticles[J].Anal.Chim.Acta,2011,694(1-2): 115-119.

[11]kong Dm,Wang N,Guo X X,Shen H X.Turn-on detection of Hg2+Ion Using a Peroxidase-like Split G-quadruplex-hemin DNAzyme[J].Analyst,2010,135(3): 545-549.

Sensor for Detection ofmercury Ions Based onmagnetic Nanoparticles and G-quardruplex DNA Zymes

ZHANG He,DENG Xing-chen,ZHANG Jie,FU Xin,YE Zheng-kun

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Hunan Institute of Engineering,Xiangtan 411104,China)

Based on intermolecular split G-quardruplex-hemin DNAzymes and T-Hg2+-T bindingmotif,a biosensor for “Turn on” detection ofmercury ions is developed withmagnetic nanoparticles (MNPs) as carrier to immobilize the DNA probes.The effects of several factors on detection system are investigated.Under optimal conditions,this sensor displays good selectivity,sensitivity and anti-interference capability,and can reliably be used for defection of real water samples.The efficient,fast and simple separation is achieved by usingmagnetic nanoparticles as a solid phase carrier to effectively increase the detection sensitivity and decrease the background signal.

magnetic nanoparticle; intermolecular split G-quardruplex; DNA zymes; colorimetric assay; Hg2+

2016-01-06基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(21005067);湖南省自然科學(xué)基金資助項目(2015JJ2039,14JJ3133);湖南省教育廳優(yōu)秀青年科研資助項目(12B029).作者簡介：張 何(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：微納流控及納米傳感.

TP391.41

A

1671-119X(2016)02-0056-06