李志惠　李德

摘要：為了探討GnRH基因SNP與榕江小香羊繁殖性狀關(guān)聯(lián)性，試驗(yàn)以榕江小香羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采用DNA池法及PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)GnRH基因單核苷酸多態(tài)性。結(jié)果表明，榕江小香羊GnRH基因內(nèi)含子3檢測(cè)到1個(gè)SNP位點(diǎn)T-68G，該位點(diǎn)表現(xiàn)為3種基因型，分別命名為TT、TG和GG?；蛐团c繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析顯示，榕江小香羊GG基因型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于TT和TG基因型個(gè)體（P<0.05）。研究結(jié)果提示GnRH基因可能是影響山羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因或與主效基因連鎖，T-68G位點(diǎn)可望作為提高山羊個(gè)體繁殖性能的分子遺傳標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：榕江小香羊；GnRH基因；PCR-SSCP；繁殖性狀

中圖分類號(hào)：S827；S813 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）08-2058-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.035

Abstract：In order to analyze the link between polymorphisms of GnRH gene and reproduction traits in Rongjiang small xiang goat. Selecting Rongjiang small xiang goats as testing subjects， the single-nucleotide polymorphism（SNP） of GnRH gene was detected by applying DNA pooling method and PCR-SSCP technology. The results showed that， one SNP loci T-68G was detected in intron 3 of GnRH gene in Rongjiang small xiang goats. The SNP loci assumed three genotypes named as TT， TG and GG respectively. The association analysis of genotypes and reproduction traits revealed that individuals of Rongjiang small xiang goat with genotype GG have obvious litter size more than those with genotype TT and TG （P<0.05）. The finding indicated that， GnRH gene was primarily deduced to be a potential major gene or linked to major gene effecting goat litter size， and the T-68G loci might be a candidate molecular marker for improving individual reproduction traits of goat.

Key words：Rongjiang small xiang goat；GnRH gene； PCR-SSCP；reproduction traits

促性腺激素釋放激素（Gonadotropin releasing hormone，GnRH），是一種由腦組織分泌的十肽神經(jīng)激素，它是下丘腦-垂體-性腺軸的關(guān)鍵神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子。這種十肽小分子由下丘腦的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分泌，然后進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)隨血流進(jìn)入垂體，并與位于垂體前葉的促性腺激素細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合，從而刺激垂體細(xì)胞分泌黃體生成激素和卵泡刺激激素，進(jìn)而促進(jìn)性腺的生長(zhǎng)、成熟和調(diào)控哺乳動(dòng)物的繁殖力[1-3]。MacColl等[4]研究發(fā)現(xiàn)，若GnRH基因的蛋白表達(dá)受到抑制或突變，則會(huì)導(dǎo)致不育；Okubo等[5]發(fā)現(xiàn)GnRH及GnRHR的相互作用對(duì)動(dòng)物的繁殖性能具有調(diào)節(jié)作用。

本試驗(yàn)以榕江小香羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采用PCR-SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性，Single-strand conformation polymorphism，SSCP）技術(shù)對(duì)GnRH基因部分外顯子4及內(nèi)含子3進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）檢測(cè)，并通過SNP分析其與榕江小香羊繁殖性狀相關(guān)性，以期為尋找山羊繁殖性狀的遺傳標(biāo)記奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為地方山羊品種的選育和種質(zhì)鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)均采集具有前3胎產(chǎn)羔記錄的榕江小香羊，且飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同。榕江小香羊130只來自貴州省雷山縣。每只山羊頸靜脈采血5 mL，收集于加入抗凝劑的采血管中，置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室于 -40 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒，聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠，2×Es Taq Master Mix，DM2000，6×DNA Loading，Buffer1×TBE緩沖液均購(gòu)自貴州鼎國(guó)生物工程有限公司。

1.3 DNA提取與DNA池構(gòu)建

貴州鼎國(guó)生物工程有限公司Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取效果，NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品濃度，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｕ{(diào)整所有個(gè)體DNA樣品濃度至相同的100 ng/μL，分別取5 μL混合構(gòu)建DNA池。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中綿羊GnRH基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)， GnRH基因登錄號(hào)為BC120472。利用Primier-BLAST在線軟件針對(duì)外顯子4和內(nèi)含子3區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，引物信息見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 PCR反應(yīng)體系及條件

1.5.1 DNA池PCR PCR反應(yīng)體系為10 μL：基因組DNA 1 μL，2×Es Taq Master Mix 5 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各0.75 μL，雙蒸水2.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。選擇特異性好的PCR產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5.2 PCR-SSCP PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性 3 min；34個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸3 min）；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×Es Taq Master Mix 10 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物各1.5 μL，加水至20 μL。SSCP所需PCR產(chǎn)物用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。取5 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。取8 μL的PCR產(chǎn)物和8 μL的變性劑，100 ℃水浴10 min后置于-20 ℃冰箱中20 min。250 V電壓預(yù)電泳30 min，去除PAG膠中雜質(zhì)，點(diǎn)樣完成后先進(jìn)行250 V電壓預(yù)電泳30 min，后110 V電壓進(jìn)行16 h左右電泳，最后經(jīng)固定、銀染、顯色后進(jìn)行分辨條帶帶型。

1.6 PCR產(chǎn)物測(cè)序

用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。選擇條帶單一、產(chǎn)量高的PCR產(chǎn)物送交北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。用DNAStar軟件對(duì)序列結(jié)果進(jìn)行校正，Blast分析確定SNPs。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

建立了一般線性模型進(jìn)行標(biāo)記與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析：Yijk=u+FTi+Gj+Eijk。式中，Yijk為個(gè)體表型，u為群體平均值，F(xiàn)Ti為胎次效應(yīng)，Gj為基因型效應(yīng)，Eijk為隨機(jī)誤差。利用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并采用最小二乘法擬合線性模型對(duì)個(gè)體基因型和產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢測(cè)，以P<0.05為差異顯著水平，P﹤0.01為差異極顯著水平，結(jié)果均以“最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取結(jié)果

對(duì)提取的基因組DNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，所提DNA完整性較好，條帶整齊、單一，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，其OD260 nm/OD280 nm在1.6～1.8之間，表明所提基因組DNA純度較好，無須純化，可直接用于PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。

2.2 PCR產(chǎn)物檢測(cè)

用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)（圖2）。由圖2可見，各引物的擴(kuò)增片段條帶清晰、明亮、無拖尾現(xiàn)象，表明擴(kuò)增片段與目的片段大小一致，說明所設(shè)計(jì)引物特異性較好，可直接用于測(cè)序。

2.3 PCR產(chǎn)物序列分析

2.3.1 DNA池PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果 以上述構(gòu)建好的DNA池為模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，選取條帶好的PCR產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用DNAStar軟件中MegAlign和sequMan程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行組裝、拼接和比對(duì)，結(jié)果見圖3。由圖3可見，在榕江小香羊中GnRH基因內(nèi)含子3發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP，命名為T-68G（本文中SNP位置均以外顯子4第一位堿基為第一位計(jì)算）。

2.3.2 PCR-SSCP分型及測(cè)序 SSCP分析發(fā)現(xiàn)，在榕江小香羊GnRH基因內(nèi)含子3第1 461 bp處均檢測(cè)到2種等位基因T和G，在榕江小香羊試驗(yàn)群體中發(fā)現(xiàn)3種基因型，分別定義為TT、TG和GG。GnRH基因內(nèi)含子3擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性顯色后電泳圖譜見圖4。

選擇榕江小香羊不同基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序（圖5），通過SepMan程序分析測(cè)序結(jié)果并比對(duì)，結(jié)果T-68G位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)3種不同的基因型，TT型為與GenBank上提交的序列（登錄號(hào)：NC_019468.1）一致的野生型基因型個(gè)體，GG型定義為純合突變型，TG型定義為雜合突變型。

2.4 GnRH基因第3內(nèi)含子SNP位點(diǎn)群體遺傳變異分析

對(duì)SNP位點(diǎn)T-68G進(jìn)行遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表2。由表2可見，榕江小香羊以TT基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，其基因型頻率為0.554。等位基因T為優(yōu)勢(shì)等位基因，其頻率為0.735。該基因純合度為0.610，雜合度為0.390。榕江小香羊群體表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25

2.5 GnRH基因內(nèi)含子3多態(tài)性與繁殖性狀關(guān)聯(lián)性分析

對(duì)GnRH基因T-68G位點(diǎn)多態(tài)性與榕江小香羊試驗(yàn)群體繁殖性狀指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表3可知，在榕江小香羊試驗(yàn)群體中，T-68G位點(diǎn)GG基因型的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于TT和TG基因型（P﹤0.05），而TT和TG基因型之間產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著（P >0.05）。

3 討論

國(guó)內(nèi)外對(duì)GnRH在山羊上多態(tài)性的研究較少，主要是集中在人類性早熟和一些禽類上的多態(tài)性的研究。Sedlmeyer等[6]對(duì)GnRH基因進(jìn)行了多態(tài)性的分析，檢測(cè)出T171C、G1215C和A1251C 3處突變，分析發(fā)現(xiàn)這些突變可能與人類的青春期推遲有關(guān)；Wu等[7]對(duì)文昌雞GnRH基因研究發(fā)現(xiàn)，300日齡和400日齡的產(chǎn)蛋數(shù)受GnRH基因型影響顯著（P﹤0.05）；吳旭等[8]采用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)番鴨GnRH基因5端研究發(fā)現(xiàn)，300日齡番鴨的產(chǎn)蛋量以及最長(zhǎng)連產(chǎn)天數(shù)與該位點(diǎn)顯著相關(guān)（P﹤0.05）；顏泉梅等[9]采用PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)布爾山羊和西農(nóng)莎能奶山羊GnRH基因第4外顯子的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)兩種山羊群體中，CC和CT基因型個(gè)體的平均產(chǎn)羔數(shù)均顯著高于TT基因型個(gè)體（P<0.05）；An等[10]在波爾山羊、西農(nóng)莎能奶山羊和關(guān)中奶山羊的群體中研究發(fā)現(xiàn)GnRH基因存在兩個(gè)突變位點(diǎn)，這兩個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)于不同胎次母羊的產(chǎn)羔數(shù)影響不同。由以上研究結(jié)果可推測(cè)GnRH基因可以作為山羊產(chǎn)羔性狀候選基因的分子標(biāo)記。

本試驗(yàn)采用混合DNA池、PCR-SSCP技術(shù)和直接測(cè)序方法對(duì)榕江小香羊GnRH基因進(jìn)行了多態(tài)性檢測(cè)和驗(yàn)證，在GnRH基因內(nèi)含子3檢測(cè)到1個(gè)SNP位點(diǎn)T-68G。針對(duì)該SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，采用SSCP結(jié)合直接測(cè)序技術(shù)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示小香羊試驗(yàn)群體T-68G位點(diǎn)處存在3種基因型TT、TG和GG。與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性分析顯示，T-68G位點(diǎn)與榕江小香羊試驗(yàn)群體繁殖性狀顯著相關(guān)，具體表現(xiàn)為小香羊GG基因型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于TT和TG基因型的個(gè)體。由此可以推斷GG基因型可能是榕江小香羊繁殖性能的有利基因型，該基因的T-68G位點(diǎn)可望作為榕江小香羊繁殖性能選擇的遺傳標(biāo)記而應(yīng)用于榕江小香羊的分子選育。

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用PCR-SSCP技術(shù)結(jié)合PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法對(duì)篩選到的多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行檢驗(yàn)并驗(yàn)證了DNA池快速篩查SNP的可行性，同時(shí)對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)T-68G表現(xiàn)的3種基因型與榕江小香羊繁殖性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)T-68G基因型GG對(duì)榕江小香羊產(chǎn)羔數(shù)存在顯著影響。GnRH基因?yàn)槔梅肿舆z傳標(biāo)記輔助選擇來提高山羊個(gè)體繁殖性能指標(biāo)提供了參考，有望作為改善山羊繁殖性狀的候選基因。

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