李洪亮　許仙赟　范小娜

摘要：前期研究發(fā)現(xiàn)六月雪[Serissa serissoides （DC.） Druce]對(duì)乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜損傷有良好的保護(hù)作用，因此進(jìn)一步在細(xì)胞水平上探討六月雪水提取物對(duì)乙醇損傷的人胃黏膜上皮細(xì)胞的保護(hù)作用。采用體外細(xì)胞培養(yǎng)人胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1細(xì)胞，將GES-1細(xì)胞用0～10%的乙醇孵育4～6 h，建立胃黏膜損傷模型。將參試GES-1細(xì)胞分為正常組、模型組、荊花胃康膠丸組、六月雪水提取物劑量組，正常組不做任何處理培養(yǎng)24 h，其他組加入一定濃度的乙醇處理一段時(shí)間后，加入含荊花胃康膠丸、六月雪水提取物各濃度劑量的培養(yǎng)基，正常組、模型組不加入藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，利用MTT檢測(cè)各組GES-1細(xì)胞的活性。將MTT篩選后效果最佳的六月雪3個(gè)濃度以及荊花胃康膠丸組1個(gè)濃度分別定為高、中、低劑量組和陽(yáng)性藥物組，運(yùn)用吖啶橙熒光染色法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，采用Western-Blot 法檢測(cè)各試驗(yàn)組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，5%的乙醇孵育GES-1細(xì)胞4 h是造成胃黏膜損傷的最佳細(xì)胞模型，對(duì)GES-1細(xì)胞的抑制率達(dá)到40%。六月雪水提取物組中，60、70、80 μg/mL 3個(gè)濃度效果最佳，與該組其他濃度比較差異顯著（P<0.05）；荊花胃康膠丸組中，在濃度為160 μg/mL 時(shí)細(xì)胞增殖最明顯；均高于其他濃度的荊花胃康膠丸組；吖啶橙染色后顯微鏡下觀察正常GES-1細(xì)胞形態(tài)均一、生長(zhǎng)良好，而模型組大量細(xì)胞明顯出現(xiàn)衰老或凋亡，荊花胃康膠丸組、六月雪水提取物組GES-1細(xì)胞生長(zhǎng)情況明顯好于模型組；模型組bFGF的蛋白表達(dá)水平明顯高于正常組，差異顯著（P<0.05）；與模型組比較，六月雪水提取物組的bFGF蛋白表達(dá)水平明顯增加，差異極顯著（P<0.01）；六月雪水提取物組與荊花胃康膠丸組比較，bFGF的表達(dá)水平差異也達(dá)極顯著水平（P<0.01）。 說明六月雪水提取物可以保護(hù)乙醇損傷的人胃黏膜上皮系GES-1細(xì)胞，可以增加bFGF的蛋白表達(dá)水平，提高潰瘍愈合速度。

關(guān)鍵詞：六月雪；水提取物；乙醇；人胃黏膜上皮細(xì)胞

中圖分類號(hào)：Q949.781.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）08-2035-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.029

Abstract： Previous research found that junesnow[Serissa serissoides （DC.） Druce] has protect effect on gastric mucosal damage of rat caused by alcohol， further research was conducted on cellular level to explore the protect effect of junesnow on human gastric mucosal epithelial cells injured by alcohol. Epithelial cells GES-1 was cultured in vitro， then incubated under alcohol stress（0～10%） for 4～6 h to set gastric mucosal damage model. The experimental cell were divided into normal group， model group， Jinghuawenkang group and Junesnow group. Normal group was cultured for 24 h without any treatment； while the rest groups were treated by alcohol for certain time and then cultured with medium adding different dose of Jinghuawenkan or junesnow for 24 h. MTT experiment was used to exam the cell activity of each group. The results were taken to confirm high， meddle， low dosage of junesnow and positive drug group of Jinghuawenkang. Acridine orange staining method was used to measure apoptosis of each group； and Western-Blot to measure expression of bFGF. Results showed that incubating GES-1 in 5% alcohol for 4 h could establish the best gastric mucosal damage model as the inhibitory rate of cell could reach to 40%. In Junesnow group， 60， 70， 80 μg/mL treatments had the best effect （P<0.05）. In Jinghuawenkang group， the cell reproduced the most obviously in 160 μg/mL treatment， higher than other Jinghuawenkang treatments. After acridine orange staining， the normal GES-1 cells showed uniform morphology and well growth status； while the model group cells were obviously senescent or apoptosis. The cells of Junesnow and Jinghuawenkang groups grew better than model group. The expression level of bFGF in model group is significantly higher than in normal group（P<0.05）. he expression level of bFGF in Junesnow group is very significantly higher than in model group（P<0.01） and Jinghuawenkang group（P<0.01）. The junesnow can protect human gastric mucosal epithelial cells injured by alcohol， can increase the expression of bFGF to improve the ulcer healing rate.

Key words： junesnow [Serissa serissoides （DC.） Druce]；water extract；ethanol；human gastric mucosal epithelial cells

隨著人們生活水平的提高，飲酒成了日常生活中十分普遍的現(xiàn)象，但由乙醇引起的消化道疾病則呈逐年增加趨勢(shì)，大量飲酒可引起急性的消化道患疾，主要有胃炎、胃潰瘍等胃腸道疾病。乙醇對(duì)胃黏膜損傷機(jī)制非常復(fù)雜，主要有化學(xué)灼傷及誘導(dǎo)胃黏膜細(xì)胞凋亡、壞死等[1]。中藥六月雪又名白馬骨，系茜草科（Rubiaceae）植物六月雪[Serissa serissoides（DC.）Druce]的干燥全草[2]。全國(guó)各地均產(chǎn)。在江西省贛南地區(qū)資源豐富。為常用民間草藥。六月雪早在《本草拾遺》中就有記載，其能活血、涼血、疏肝瀉濕、消腫止痛[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要用于急慢性肝炎、黃疸、流行性腮腺炎、腎性水腫、血尿及高血壓等癥[4]。六月雪水提取物對(duì)乙醇所致的大鼠胃黏膜損傷有保護(hù)作用，能明顯減少潰瘍面積的發(fā)生；而且六月雪、黃花倒水蓮聯(lián)合用藥對(duì)無水乙醇、阿司匹林、鹽酸所致的大鼠胃黏膜損傷有明顯的保護(hù)作用，并且有一定的抗炎、促血小板生成、促凝血作用，作用機(jī)制可能和凝血因子以及調(diào)節(jié)激素水平有關(guān)[5-7]。2013年7月至2014年6月，在前期實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠研究的基礎(chǔ)上，課題組采用乙醇損傷的人胃黏膜上皮細(xì)胞為模型，以細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）為檢測(cè)指標(biāo)，觀察六月雪水提取物對(duì)乙醇造成的人胃黏膜上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)效果，進(jìn)一步在細(xì)胞水平上探討了六月雪對(duì)胃黏膜細(xì)胞保護(hù)的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1細(xì)胞由贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院饋贈(zèng)。

1.1.2 試（藥）劑 中藥炮制品六月雪購(gòu)自贛州市醫(yī)藥公司，經(jīng)鑒定為正品；荊花胃康膠丸，由天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20130916；吖啶橙（AO）、高糖培養(yǎng)基DMEM、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍(lán)（MTT）為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清由杭州四季青公司提供；一抗bFGF兔抗人多克隆抗體、二抗羊抗兔辣根過氧化物酶抗體、β-acting蛋白由上海長(zhǎng)島生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供；PVDF膜為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。還有乙醇、NaOH、磷酸鹽緩沖液（PBS）、CO2等。

1.1.3 儀器 主要有Olympus CK40熒光倒置顯微鏡（日本光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社）、CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus公司）、Thermo-354酶標(biāo)儀（美國(guó)熱電公司）、電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）等。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的制備 取干燥六月雪藥材500 g，加去離子水，過液面2 cm，煮沸2次，30 min/次，濃縮至400 mL，加3倍量的95%乙醇，放冰箱靜置過夜，次日減壓過濾，并回收濾液中乙醇，繼續(xù)濃縮濾液得無醇味的提取物。提取物加去離子水至500 mL，使藥液為相當(dāng)于生藥復(fù)方1 g/mL，用0.5% NaOH調(diào)整pH為7.0，置冰箱中備用。

1.2.2 GES-1細(xì)胞損傷模型的建立 分別以含0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%乙醇濃度的培養(yǎng)液作用人胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1細(xì)胞，作用時(shí)間分別為2、3、4、5、6 h，分別觀察造成GES-1細(xì)胞損傷的程度，MTT法檢測(cè)到的GES-1細(xì)胞抑制率達(dá)到40%左右時(shí)的試驗(yàn)參數(shù)即可作為最佳的GES-1細(xì)胞損傷模型，此時(shí)MTT法測(cè)得的吸光度值（OD值）在0～0.7范圍內(nèi)。后面的試驗(yàn)均以建模最佳乙醇濃度及作用時(shí)間制作GES-1細(xì)胞損傷模型。

1.2.3 GES-1細(xì)胞分組及處理 將參試GES-1細(xì)胞分為正常組（對(duì)照）、模型組、荊花胃康膠丸組、六月雪水提取物組4個(gè)組。處理過程如下：將GES-1細(xì)胞復(fù)蘇，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103/mL，按照每孔100 μL 接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h；貼壁后，吸出上清液，PBS洗2次。正常組GES-1細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基，其余加入篩選出的乙醇濃度孵育一定時(shí)間后吸出的上清液，PBS洗2次。最后將六月雪水提取物組、荊花胃康膠丸組GES-1細(xì)胞加入含不同濃度的相應(yīng)藥物培養(yǎng)基100 μL，正常組、模型組不加藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 MTT檢測(cè)GES-1細(xì)胞活性 將六月雪水提取物組和荊花胃康膠丸組分別換上含不同濃度六月雪（10、20、30、40、50、60、70、80、100 μg/mL）和荊花胃康膠丸（10、40、80、120、160、200、240、280 μg/mL）的培養(yǎng)液100 μL，正常組加入無藥物培養(yǎng)基100 μL，每組5個(gè)重復(fù)孔，各組分別培養(yǎng)24 h后，加入5 % MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100 μL，振蕩溶解10 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值（OD值），檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm，應(yīng)用MTT比色法計(jì)算GES-1細(xì)胞活性。

1.2.5 吖啶橙熒光染色檢測(cè)GES-1細(xì)胞凋亡 選擇效果最佳的六月雪3個(gè)梯度劑量作為高、中、低劑量，選擇最佳效果劑量的荊花胃康膠丸組作為陽(yáng)性對(duì)照，正常組（對(duì)照）、模型組處理同上，將各組制備成GES-1細(xì)胞爬片，無菌PBS溶液洗去培養(yǎng)液，用95%乙醇固定液固定15 min，放置稍干燥后，滴加AO染液，避光靜置2～3 min。將附有單層細(xì)胞染色后的小蓋玻片反置于載玻片上，以濾紙吸取蓋玻片周圍的多余液體。使用相應(yīng)的濾光片（綠光激發(fā)），用熒光顯微鏡觀察，凋亡的GES-1細(xì)胞呈現(xiàn)為染色減弱、熒光較亮、均勻一致的圓狀或固縮狀、團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，而非凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)熒光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征。

1.2.6 Westernblot 檢測(cè)bFGF蛋白的表達(dá) 分組同1.2.4，細(xì)胞培養(yǎng)6孔板中每4孔為一個(gè)樣本，收集各組GES-1細(xì)胞上清液后，用PBS沖洗1次，棄去PBS，胰蛋白酶消化并收集GES-1細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液，即是細(xì)胞總蛋白，Bradford法進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。制備的蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后用電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，一抗為bFGF抗體，二抗為羊抗兔辣根過氧化物酶抗體，β-acting蛋白作為對(duì)照。利用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色反應(yīng)。檢測(cè)結(jié)果以X線膠片曝光。用美國(guó)image J成像系統(tǒng)軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值掃描，以bFGF蛋白條帶的灰度值與β-acting內(nèi)參的灰度值之比作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用x±S表示，采用Prism4.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，用配對(duì)t檢驗(yàn)法進(jìn)行組間差別比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 GES-1細(xì)胞損傷模型選擇

不同濃度乙醇作用GES-1細(xì)胞后在不同時(shí)間段的MTT法檢測(cè)結(jié)果見表1。從表1可見，不同濃度乙醇作用后均對(duì)GES-1細(xì)胞造成損傷，其中5%的乙醇孵育4 h對(duì)GES-1細(xì)胞的抑制率達(dá)到40%，符合試驗(yàn)要求，表明5%的乙醇孵育4 h是最佳的GES-1細(xì)胞損傷模型。

2.2 各組細(xì)胞活性檢測(cè)

正常組、荊花胃康膠丸組、六月雪水提取物組的GES-1細(xì)胞加入篩選出的乙醇濃度孵育后，經(jīng)培養(yǎng)，測(cè)得的各組GES-1細(xì)胞OD值結(jié)果見表2。從表2可見，六月雪水提取物組GES-1細(xì)胞的增殖與濃度呈劑量依賴性，在10～60 μg/mL時(shí)增殖活性較明顯，60～80 μg/mL時(shí)增殖速率有所減慢，但仍然呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，到100 μg/mL時(shí)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是高濃度的六月雪水提取物對(duì)GES-1細(xì)胞產(chǎn)生了不良反應(yīng)造成的。在荊花胃康膠丸組中，當(dāng)濃度在160 μg/mL時(shí)，GES-1細(xì)胞增殖最明顯，同時(shí)由于藥物毒性，在劑量高于160 μg/mL時(shí)，GES-1細(xì)胞增殖開始減弱。

2.3 吖啶橙熒光染色

正常組（對(duì)照）、模型組、荊花胃康膠丸組（陽(yáng)性對(duì)照）和六月雪水提取物高劑量組（80 μg/mL）、中劑量組（70 μg/mL）、低劑量組（60 μg/mL）分別用吖啶橙熒光染色后，于Olympus CK40熒光倒置顯微鏡下觀察，并拍照，結(jié)果見圖1。從圖1A可見，正常對(duì)照組在顯微鏡下觀察的GES-1細(xì)胞形態(tài)均一，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，吖啶橙染色后細(xì)胞核呈現(xiàn)熒光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征，在熒光20倍下觀察，整個(gè)視野未出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞。從圖1B可見，模型組的GES-1細(xì)胞在乙醇作用下，大量GES-1細(xì)胞出現(xiàn)明顯的衰老或凋亡，在熒光20倍下觀察，能夠觀察到大量的凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞染色增強(qiáng)、熒光較亮、均勻一致地呈圓狀或固縮狀。從圖1C可見，荊花胃康膠丸組（160 μg/mL）的GES-1細(xì)胞生長(zhǎng)情況明顯好于模型組。從圖1D、圖1E、圖1F可見，六月雪水提取物高、中、低劑量組的GES-1細(xì)胞生長(zhǎng)情況也明顯好于模型組。

2.4 bFGF蛋白的表達(dá)

Westernblot檢測(cè)bFGF蛋白的相對(duì)表達(dá)情況見圖2。從圖2可見，模型組bFGF的蛋白相對(duì)表達(dá)水平高于正常組，2組之間差異顯著（P<0.05）。與模型組和荊花胃康膠丸組比較，六月雪水提取物的高、中、低劑量組中bFGF的蛋白相對(duì)表達(dá)均大幅增加，高、中、低劑量組與模型組、荊花胃康膠丸組之間差異極顯著（P<0.01））。并且六月雪水提取物低劑量組的bFGF蛋白相對(duì)表達(dá)較高、中劑量組bFGF的蛋白相對(duì)表達(dá)水平有所減弱。

3 討論

GES-1細(xì)胞來源于人胃黏膜上皮，該細(xì)胞能在體外穩(wěn)定傳代，目前乙醇損傷的GES-1細(xì)胞模型在大量的基礎(chǔ)研究中被廣泛應(yīng)用，并證明其為良好的實(shí)用型實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型[6]。試驗(yàn)結(jié)果表明，正常細(xì)胞生長(zhǎng)良好，不同濃度乙醇作用GES-1細(xì)胞不同時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)不同程度的損傷，其中5%的乙醇孵育4 h對(duì)GES-1細(xì)胞的抑制率達(dá)到40%，表明建模成功，且與臨床中酒精所致的胃黏膜損傷相近，并且重現(xiàn)試驗(yàn)證明該方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高。

六月雪在江西省贛南18個(gè)縣均有分布、資源十分豐富，六月雪水提取物在贛南民間常用作酒精性胃出血的治療，并且效果十分顯著。前期研究[7]發(fā)現(xiàn)六月雪水提取物單獨(dú)用藥對(duì)乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜損傷有明顯的修復(fù)作用，能降低潰瘍面積指數(shù)；并且六月雪與黃花倒水蓮聯(lián)合用藥對(duì)無水乙醇、阿司匹林、鹽酸致大鼠胃黏膜損傷有明顯的保護(hù)作用，還有一定的抗炎、促血小板生成、促凝血作用，作用機(jī)制可能和凝血因子以及調(diào)節(jié)激素水平有關(guān)[5，7]。有文獻(xiàn)[8，9]報(bào)道了荊花胃康膠丸對(duì)急慢性胃炎、消化性潰瘍有較好的治療效果，選擇其作為陽(yáng)性對(duì)照藥物療效穩(wěn)定性較高。試驗(yàn)利用六月雪水提取物作用于人胃潰瘍模型的GES-1細(xì)胞，結(jié)果表明，六月雪水提取物對(duì)乙醇損傷的GES-1細(xì)胞均有促進(jìn)增殖的作用，但是藥劑量逐漸增大到一定程度后對(duì)細(xì)胞的毒性也逐漸增大。吖啶橙熒光染色結(jié)果表明，GES-1細(xì)胞經(jīng)乙醇作用后，能夠觀察到大量的凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞染色增強(qiáng)、熒光較亮、均勻一致的呈圓狀或固縮狀，其中荊花胃康膠丸組、六月雪水提取物組的GES-1細(xì)胞生長(zhǎng)情況明顯好于模型組。

正常胃黏膜組織中bFGF蛋白表達(dá)呈弱陽(yáng)性；大量研究認(rèn)為，當(dāng)胃潰瘍發(fā)生時(shí)，bFGF蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，胃潰瘍組織中bFGF表達(dá)高于正常的胃黏膜，在愈合期和瘢痕期均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，但在愈合階段其表達(dá)逐漸減弱[10]。試驗(yàn)通過免疫印跡分析bFGF結(jié)果可知，bFGF在正常組中有少量表達(dá)，在模型組和給藥組中表達(dá)非常顯著，與正常組比較差異顯著（P<0.05）。bFGF在胃潰瘍愈合過程中的表達(dá)由弱到強(qiáng)，推測(cè)可能與潰瘍愈合有關(guān)，低劑量六月雪水提取物組的bFGF表達(dá)較高、中劑量組有所減少，但仍呈高表達(dá)狀態(tài)，這可能與細(xì)胞處于瘢痕期，其組織結(jié)構(gòu)仍需要調(diào)整、仍然需要bFGF的作用有關(guān)，綜上所述，六月雪水提取物對(duì)乙醇損傷GES-1細(xì)胞有保護(hù)作用，這為中藥治療乙醇導(dǎo)致的消化性潰瘍開辟了一條新的路徑。

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