陳賢華 胡宏波 馮金 孫秀娟 劉大鷹

[摘要] 目的 探討Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點G>C單核苷酸多態(tài)性與肺癌發(fā)生的關系。 方法 選取2006年1月～2010年12月于柳州市柳鐵中心醫(yī)院行手術切除或纖維支氣管鏡檢查的肺癌患者36例，取其組織標本，基因分型檢測采用MightyAmp DNA聚合酶法，分別檢測癌組織（肺癌組）和癌旁正常組織（對照組）的Reprimo基因839位點G>C分布，運用χ2檢驗和Armitage's趨勢檢驗等分析其與肺癌發(fā)生的相關性。 結果 兩組標本經(jīng)哈迪-溫伯格平衡檢測，對照組在Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點G>C基因型觀測（理論）頻數(shù)為0、33、3（7.56、17.88、10.56），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000），肺癌組的基因型觀測（理論）頻數(shù)為6、29、1（11.67、17.65、6.67），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點G>C多態(tài)性與肺癌易感性的Armitage's趨勢檢驗差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.44，P=0.011）。 結論 Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點G>C單核苷酸多態(tài)性與肺癌發(fā)生具有一定相關性。

[關鍵詞] 肺癌；Reprimo；多態(tài)性；哈迪-溫伯格平衡

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（c）-0035-03

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the Reprimo gene 3'-untranslated region 839 G>C polymorphism and lung cancer. Methods From January 2006 to December 2010， 36 patients with lung cancer in Liuzhou Municipal Liutie Central Hospital underwent surgery and fiberoptic bronchoscopy were selected. Tissue specimens were collected and genotyping was detected by MightyAmp DNA Polymerase. The Reprimo gene 3'-untranslated region 839 G>C polymorphism was detected in the cancer tissue （cancer group） and para-carcinoma tissue （control group）. The results were analyzed with χ2 test and Armitage's trend test. Results According to Hardy-Weinberg equilibrium detection， 839 G>C genotype observation （theory） frequency was 0， 33， 3 （7.56， 17.88， 10.56） in the control group， with statistically significant difference （P=0.000）； and 6， 29， 1 （11.67， 17.65， 6.67） in the cancer group， with statistically significant difference （P=0.000）. Armitage's trend test revealed statistically significant correlation between 839 G>C single nucleotide polymorphisms and susceptibility to lung cancer （χ2=6.44， P=0.011）. Conclusion This study indicates that there is a certain correlation between the Reprimo gene 3'-untranslated region 839 G>C polymorphism and lung cancer.

[Key words] Lung cancer； Reprimo； Polymorphism； Hardy-Weinberg equilibrium

肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程受遺傳和環(huán)境兩方面的共同影響。Liu等[1]發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)肺癌形成過程，遺傳傾向可起到關鍵性作用。Fasching等[2]報道，遺傳多態(tài)性存在于人類許多基因，在個體腫瘤易感性方面起關鍵決定性作用。肺癌的基因易感性主要包括基因多態(tài)性（代謝酶、抑癌、修復酶基因）和某些基因的突變?nèi)笔3-4]。本研究主要討論Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點G>C多態(tài)性與肺癌易感性的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2006年1月～2010年12月柳州市柳鐵中心醫(yī)院手術或纖維支氣管鏡（簡稱“纖支鏡”）取得的肺（癌）組織標本，質地良好均一，立即用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋處理，室溫保存。其中，肺癌組織（肺癌組）及癌旁正常組織標本（對照組）各36例。對照組是同一肺癌患者遠端配對正常肺組織（距腫瘤邊界灶≥3 cm）。

1.2 基因檢測

1.2.1 標本DNA提取 使用TaKaRa DEXPATR試劑。肺癌標本切片厚度為5 μm，加入TaKaRa DEXPATR試劑提取液0.3 mL，恒溫加熱器100℃，10 min，低溫離心機（4℃，12 000 r/min）立即離心10 min，提取液分3層，吸取中層清晰液體得到PCR擴增用DNA。詳細操作請參照說明書進行。

1.2.2 擴增試劑 采用TaKaRa的MightyAmp DNA Polymerase試劑進行擴增Reprimo基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，堿基序列為R1：5'-GCGCAGAACTTTGGAAGCTGC-3'，R2：5'-GCGCAGAACTTT GGAAGCTGG-3'，R3：5'-AGGAGAAGAGTGGGAGCG C-3'；R1R3負責839位點的G片段，擴增產(chǎn)物為235 bp；R2R3負責839位點的C片段，擴增產(chǎn)物為235 bp。

1.2.3 PCR反應體系 25 μL反應體系：2×PCR Buffer 12.5 μL，模板DNA 4 μL，酶（5 U/μL）0.5 μL，引物0.5 μL×2，重蒸水7 μL。體系反應條件：98℃預變性5 min，擴增溫度98℃ 10 s、60℃ 1 s、68℃ 1 min，擴增循環(huán)40次，68℃延伸4 min；選取10 μL PCR擴增產(chǎn)物進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增目的基因。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；使用在線軟件（http：//ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl）進行Armitage's趨勢檢驗、哈迪-溫伯格平衡檢驗，計算比值比（OR）及95%可信區(qū)間（CI）。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 研究對象一般資料

收集36例臨床肺癌患者資料，病理分型：鱗癌7例，大細胞癌10例，腺癌9例，小細胞癌10例；其中，女10例，平均年齡為（54.40±9.58）歲，男26例，平均年齡為（58.81±10.42）歲。

2.2 Reprimo產(chǎn)物電泳基因分型

Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839 G>C位點各基因型在瓊脂糖凝膠電泳顯示的條帶分別為GG：235 bp，CC：235 bp。見圖1。

2.3 肺癌組和對照組哈迪-溫伯格平衡檢驗

結果顯示，對照組和肺癌組在Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點基因型和等位基因頻率分布不符合哈迪-溫伯格平衡規(guī)律（P < 0.05）；在肺癌病理分型中腺癌、大細胞癌、鱗癌符合哈迪-溫伯格平衡規(guī)律（P > 0.05），小細胞癌組接近符合該規(guī)律（P=0.045）。見表1。

2.4 Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點多態(tài)性與肺癌易感性的Armitage's趨勢檢驗

攜帶G等位基因的患者比C等位基因的患者肺癌發(fā)病率更高；攜帶GG基因型的患者比CC、GC及GC+CC基因型的患者肺癌發(fā)病率明顯升高，且Armitage's 趨勢檢驗差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表2。

3 討論

近50年來許多國家都報道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，其中在男性中占所有惡性腫瘤的第一位[5]。最新統(tǒng)計預測，美國2015年將會有16萬人死于肺癌，肺癌新發(fā)病例數(shù)為22萬例[6]。中國肺癌發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，年平均增長1.63%[7]。不過令人遺憾的是，80%肺癌患者就診時已屬于中晚期，存活率低，但肺癌早期診治的5年生存率可高達90%[8-9]。因患者肺癌早期癥狀無特異性，肺癌早期診治仍待醫(yī)學界解決。

Reprimo基因為抑癌基因，含有109個氨基酸（相對分子量為12 000），定位在人類染色體的2q23，是一種胞漿糖蛋白[10]，它是p53基因的下游靶基因，可通過控制Cdc2/cyclinB1和Cdc2活性核轉位的機制抑制細胞周期[11]。國內(nèi)外研究Reprimo基因甲基化與腫瘤關系（尤其胃癌方面）的報道很多，其與腫瘤診治、發(fā)生發(fā)展方面具有一定的相關性[12-18]。而Reprimo基因多態(tài)性與腫瘤方面的報道較少，Ye等[19]報道Reprimo基因在839位點存在基因多態(tài)性，并用哈迪-溫伯格平衡檢驗高加索人群，證明該位點符合哈迪-溫伯格平衡規(guī)律。Beasley等[20]報道Reprimo基因824位點G>C多態(tài)性與大腸癌關系時，大腸癌組和健康組在該位點也符合哈迪-溫伯格平衡規(guī)律，憩室病組在該位點不符合該規(guī)律。

本研究顯示，對照組和肺癌組在Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點基因型和等位基因頻率分布不符合哈迪-溫伯格平衡規(guī)律（P < 0.05）；在肺癌病理分型中腺癌、大細胞癌、鱗癌符合哈迪-溫伯格平衡規(guī)律（P > 0.05），小細胞癌接近符合該規(guī)律（P=0.045）。不符合哈迪-溫伯格平衡規(guī)律的原因可能為基因分型不明確；基因突變/缺失；樣本量不足。

Beasley等[20]在研究Reprimo基因824位點G>C多態(tài)性與大腸癌的關系時，發(fā)現(xiàn)兩者不存在相關性。本研究結果表明，Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點基因改變，G等位基因的患者肺癌發(fā)病率高于C等位基因的患者，但差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；攜帶GG基因型的患者比CC、GC及GC+CC基因型的患者肺癌發(fā)病率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），顯示Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點基因變化，患者肺癌發(fā)生趨勢可呈線性升高。

總而言之，Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點G>C單核苷酸多態(tài)性與肺癌的發(fā)生具有一定相關性，尤其是攜帶G等位基因、GG基因型的患者更有可能發(fā)展成肺癌。本文不足：該位點基因研究不能解釋Reprimo基因所有位點的功能特性，且實驗過程中標本數(shù)量有限，在以后相關研究中需增加標本數(shù)量和其他位點功能研究，以明確Reprimo基因單核苷酸多態(tài)性在肺癌診治中的作用。

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（收稿日期：2015-12-20 本文編輯：程 銘）