陳婷婷 胡云龍 劉兵 李琴 賈鐵留 郭德銀 靳廣毅

[摘要] 目的 研究Toll樣受體7小分子激動(dòng)劑SZU-101（T7）偶聯(lián)H1N1流感病毒滅活疫苗對小鼠的免疫原性及安全性評價(jià)。 方法 將SZU-101與流感疫苗共價(jià)偶聯(lián)形成SZU-101偶聯(lián)流感疫苗（Flu-T7）；體外評價(jià)Flu-T7的對脾臟淋巴細(xì)胞免疫誘導(dǎo)活性；體內(nèi)評價(jià)Flu-T7對特異性抗體的誘導(dǎo)效果及特性，將BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為生理鹽水組、T7組、單獨(dú)疫苗（Flu）組、Flu-T7組，采用腹腔注射免疫小鼠，3次免疫后檢測血清中Flu特異性IgG及其分型，并考察每組小鼠的生長狀況。 結(jié)果 體外實(shí)驗(yàn)顯示Flu-T7組比Flu組刺激產(chǎn)生更多的IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-6細(xì)胞因子（P < 0.05），體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示Flu-T7誘導(dǎo)的Flu特異性IgG的血清抗體效價(jià)顯著增高，同時(shí)利用IgG2a/IgG1的比例表明Flu-T7促進(jìn)小鼠特異性Th1型免疫反應(yīng)。各組小鼠脾臟指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 Flu-T7具有良好的有效性及安全性，有望成為新型高效的流感滅活疫苗。

[關(guān)鍵詞] Toll樣受體7小分子激動(dòng)劑；流感疫苗；佐劑，免疫反應(yīng)

[中圖分類號] R186 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（c）-0026-05

[Abstract] Objective To evaluate the immunogenicity and safety of Toll-like receptor agonist （SZU-101， T7） conjugated with inactivated H1N1 influenza vaccine in mice. Methods T7 was covalent conjugated with Flu by chemical synthesis （Flu-T7）. Then the cellular immune responses were evaluated by determining cytokine levels of IFN-γ， IL-6， IL-12， TNF-α in mouse lymphocyte from splenocytes exposed to vaccines at indicated concentrations and in vivo experiments to evaluate the specific antibody induction effect and characteristics of Flu-T7. BALB/c mice were randomly divided into four groups （n=8） and intraperitonealy immunized normal saline， Flu， Flu-T7 and T7. ELISA assay was employed to test the serum specific IgG level and IgG subclasses after 3 times of immunization. The body weights of the four groups were also observed. Results Chemical conjugation of Flu-T7 significantly increased the release of IFN-γ， IL-12， IL-6 and TNF-α in mouse lymphocytes in vitro （P < 0.05）， and significantly increased the IgG antibody titer. Immunization with Flu-T7 elicited a more potent Th1-polarized immune response， represented by higher IgG2a titers. No significant differences were observed in the spleen index of mice in various groups （P > 0.05）. Conclusion The new synthetic Toll-like receptor 7 agonist conjugated with inactivated H1N1 influenza vaccines shows high effectiveness and safety， which can be used as a new and promising alternative inactivated H1N1 influenza vaccines.

[Key words] TLR7 agonist； Influenza vaccine； Adjuvant； Immune response

流感病毒引起的急性呼吸系統(tǒng)疾病傳播迅速，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)[1]。根據(jù)核蛋白（NP）和基質(zhì)蛋白 （M1）的不同可分為甲型、乙型和丙型[2]。上個(gè)世紀(jì)曾經(jīng)暴發(fā)過多次全球性流感大流行，最為嚴(yán)重的一次是發(fā)生于1918～1919年的西班牙流感，該流感的流行毒株為最常見的甲型H1N1，至少2千萬人死亡[3]。目前，預(yù)防流感病毒最有效、最經(jīng)濟(jì)的手段是接種流感疫苗[4]。然而，疫苗的有效性受多種因素影響并且每年不同[5]。流感疫苗主要基于表面糖蛋白抗原血凝素（HA）的保守區(qū)域[6]。HA的抗原漂移具有高塑性，因此需要開發(fā)新的抗原，利用佐劑增強(qiáng)疫苗自身的免疫原性[7]。普通流感疫苗雖然能夠激發(fā)有效針對病毒的抗體，但是對于免疫系統(tǒng)不完善的幼兒、免疫力低下的人及老年人，長期反復(fù)的感染常常導(dǎo)致嚴(yán)重的、不可逆轉(zhuǎn)的呼吸器官損傷，誘發(fā)呼吸系統(tǒng)功能衰竭，后果嚴(yán)重。因此，快速清除感染細(xì)胞并終止病毒連續(xù)復(fù)制對于上述感染人群非常重要。CD4+效應(yīng)T細(xì)胞和細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)殺死細(xì)胞內(nèi)病毒并且在抗流感病毒免疫反應(yīng)中起到重要作用[6]。因此，Toll樣受體（TLRs），一類先天免疫系統(tǒng)識(shí)別受體，可以作為一種理想的佐劑。已有文獻(xiàn)報(bào)道TLRs 7小分子激動(dòng)劑可以誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和免疫激活反應(yīng)[8]。

TLRs是一種模式識(shí)別受體，它們可以特異性識(shí)別微生物的保守分子模式[9]。目前在脊椎動(dòng)物鑒定出13種TLRs，人體存在10種。TLRs屬于穿膜信號蛋白，分別表達(dá)在細(xì)胞膜上和內(nèi)涵體膜上。功能上TLRs可以激發(fā)固有免疫、連接獲得性免疫[10-11]。TLRs 7、8和9表達(dá)在內(nèi)涵體上且均識(shí)別核酸類似物，其中TLRs7/8可以被人工合成的小分子激動(dòng)劑活化，研究顯示這些小分子激動(dòng)劑是有效的疫苗佐劑和抗病毒/抗腫瘤藥物[12-13]。但是由于TLRs7/8激動(dòng)劑小分子的特點(diǎn)，使得它們代謝快速、起效窗口較短，往往造成藥效不一致[14]。在新型TLRs7/8激動(dòng)劑的開發(fā)中，發(fā)現(xiàn)運(yùn)用偶聯(lián)型TLRs7/8形成的蛋白-TLRs7/8復(fù)合體疫苗具有突出的免疫誘導(dǎo)效果[14]，它們顯示長時(shí)間局部的免疫誘導(dǎo)效應(yīng)，可以誘導(dǎo)強(qiáng)有力的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，且循環(huán)細(xì)胞因子誘導(dǎo)效果極低，保證偶聯(lián)疫苗高效的同時(shí)具有很好的循環(huán)安全性[15]。

本研究利用自主研發(fā)的新型TLRs7小分子激動(dòng)劑SZU-101（T7）與流感病毒偶聯(lián)形成Flu-T7疫苗，這種新型疫苗可以有效地增強(qiáng)H1N1流感病毒滅活疫苗的免疫誘導(dǎo)效果，并且對小鼠低毒性。因此，SZU-101可以作為H1N1流感病毒滅活疫苗的一種安全有效的佐劑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級Balb/c小鼠，雌性，4～6周，體重13～15 g，體毛整潔、光亮，健康狀況良好，購于廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號：SCXK（粵）2013-0002]。

1.2 主要試劑

H1N1流感病毒滅活疫苗由北京科興生物制品有限公司惠贈(zèng)（生產(chǎn)批號：A1-1307-039）。小分子化合物SZU-101（T7）由深圳大學(xué)深圳市合成生物學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室（以下簡稱“本實(shí)驗(yàn)室”）合成純化。Flu-T7由本實(shí)驗(yàn)室偶聯(lián)合成[16]。

1.3 免疫方式

雌性4～6周齡的Balb/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只：①生理鹽水組；②T7組（1 mg/mL）；③Flu組（3 μg）；④Flu-T7組（3 μg）。分別于第0、14、28天免疫3次，每次經(jīng)腹腔注射，0.1 mL/只。量效實(shí)驗(yàn)分別在第7、21、35天采集小鼠尾巴靜脈血，分離血清，檢測抗體效價(jià)。

1.4 血清中IgG的檢測

用ELISA法檢測特異性IgG抗體[17]。首先向96孔酶標(biāo)板各孔中加入100 μL包被液（含1 μg/mL的Flu），4°C過夜。取出酶標(biāo)板，棄孔中包被液后，向孔中加入300 μL PBST洗滌3次。血清樣品1∶500稀釋，室溫孵育2 h。堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG、IgG1、IgG2a抗體，100 μL/孔，室溫孵育1 h。加入p-NPP底物溶液顯色，100 μL/孔，每孔加50 μL 3 mol/L NaOH終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定OD405值。

1.5 細(xì)胞因子的檢測

利用深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司研制的小鼠淋巴細(xì)胞分離液，提取小鼠脾臟中的淋巴細(xì)胞，1×105個(gè)淋巴細(xì)胞/孔種在24孔板中，淋巴細(xì)胞分別孵育1、5、10 μg/mL的Flu或者Flu-T7，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。收集上清，利用ELISA試劑盒（美國eBioscience公司）檢測IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α細(xì)胞因子水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0軟件對各試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Flu-T7激活T細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生

已有研究顯示T7誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞的成熟以及抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)[8]。因此，本研究首先評價(jià)T7作為流感疫苗佐劑的體外活性。圖1顯示T7由本實(shí)驗(yàn)室自行合成，并與H1N1流感疫苗化學(xué)偶聯(lián)；然后將小鼠的脾淋巴細(xì)胞與不同濃度的Flu或者Flu-T7共同孵育，通過細(xì)胞因子的分泌來評價(jià)免疫誘導(dǎo)效應(yīng)。Flu-T7對比于單獨(dú)Flu組，產(chǎn)生更多的IL-12（圖1B）、IFN-γ（圖1C）、TNF-α（圖1D）、IL-6（圖1E）的表達(dá)（P < 0.05）。這些結(jié)果說明，F(xiàn)lu-T7促進(jìn)了Th1型和Th2型免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)了細(xì)胞免疫和體液免疫相關(guān)細(xì)胞因子的發(fā)生。見圖1。

2.2 免疫小鼠的血清抗體反應(yīng)

為了評價(jià)T7作為流感疫苗的佐劑效果，Balb/c分別于第0、14、28天腹腔免疫3 μg的Flu或者3 μg的Flu-T7，并分別于第7、21、35天尾靜脈采血。從圖2A顯示，從第2次免疫開始，F(xiàn)lu-T7的抗體效價(jià)高于Flu對照組。IgG根據(jù)結(jié)果和功能的不同包含不同的亞類，IgG1和IgG2a為最主要的IgG亞類[18]，而特異性IgG2a滴度代表Th1型免疫反應(yīng)的，同時(shí)檢測了IgG2a/IgG1的比例，結(jié)果顯示，F(xiàn)lu-T7 主要偏屬于Th1型，產(chǎn)生更多的特異性IgG2a型抗體。見圖2。

2.3 T7作為流感疫苗佐劑的安全性

免疫后第35天，對各組小鼠的脾臟和體重進(jìn)行稱量，計(jì)算各組小鼠脾重與體重的比值。各組小鼠脾重與體重的比值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），表明以T7為佐劑的疫苗對小鼠機(jī)體刺激性較少，對其生長并無顯著影響，顯示出T7良好的安全性。見圖3。

3 討論

目前防止流感最有效的手段就是接種流感疫苗。但是，當(dāng)流感大規(guī)模暴發(fā)時(shí)，傳統(tǒng)的流感疫苗無法滿足在短時(shí)間內(nèi)提供足夠多的疫苗給免疫易感人群，抗原血凝素HA的遺傳變異常常使流感逃脫免疫反應(yīng)。因此，佐劑作為一種抗原輔助劑，與疫苗共同使用可以明顯提高疫苗的免疫效果。現(xiàn)階段應(yīng)用于流感疫苗中較為常見的佐劑有鋁鹽佐劑、水包油乳劑、病毒顆粒等。新一代的疫苗常常利用小分子Toll樣受體和其他天然免疫受體作為佐劑[19]。

TLRs家族是一類進(jìn)化保守的模式識(shí)別受體，可感知病原體的存在并啟動(dòng)機(jī)體防御相關(guān)基因的表達(dá)[20]。越來越多的TLRs被用作佐劑。CD4+和CD8+在流感病毒感染的調(diào)控以及長期保護(hù)性免疫方面起到了重要的作用[21]。病毒感染主要激活未成熟的CD4細(xì)胞，誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)，促進(jìn)CD8 T細(xì)胞的維護(hù)和B細(xì)胞反應(yīng)。CD8細(xì)胞以接觸依賴的方式殺死病毒感染的細(xì)胞[22]。TNF-α與IFN-γ協(xié)同抗病毒感染[23]。有研究指出SZU-101的活化誘導(dǎo)TNF-α、IFN-γ、IL-12以及Th2型細(xì)胞因子IL-6等促炎因子高表達(dá)[8]。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)T7化學(xué)偶聯(lián)Flu合成為Flu-T7，與單獨(dú)Flu組比較，可以顯著增加TNF-α、IFN-γ、IL-12和IL-6細(xì)胞因子的表達(dá)水平。并且，越來越多的研究表明，感染流感病毒的老年人Th1型CD4+的反應(yīng)降低，殺死病毒感染的細(xì)胞能力減弱[24]。細(xì)胞因子反應(yīng)在癥狀形成的早期和決定階段以及流感病毒感染的宿主防御階段都起到了重要作用[25]。這些結(jié)果都表明，F(xiàn)lu-T7在增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)、提高清除感染細(xì)胞的效率方面顯示出更好的療效，因?yàn)門h1型的IFN-γ細(xì)胞因子可以增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[25]。

IgG是血液和細(xì)胞外液中最主要的抗體，調(diào)控人體組織的感染。大多數(shù)疫苗通過產(chǎn)生血清IgG，對多種病原體介導(dǎo)體液保護(hù)[26]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)lu-T7與Flu單獨(dú)組比較，誘導(dǎo)多樣的免疫反應(yīng)。Flu-T7不顯著降低Flu特異性IgG1水平，同時(shí)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的Flu特異性IgG2a，IgG2a是Th1型免疫反應(yīng)的代表型抗體，它具有更高的親和力和殺傷效果，可以有效地介導(dǎo)機(jī)體對病毒的內(nèi)吞消化[18]。而IgG2a/IgG1比值也顯示出Flu-T7誘發(fā)的免疫反應(yīng)偏向于Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)，細(xì)胞免疫是機(jī)體實(shí)現(xiàn)免疫監(jiān)視、清除胞內(nèi)感染的關(guān)鍵，該作用提示Flu-T7疫苗存在打破流感病毒免疫耐受的潛力。在副作用評價(jià)上，脾臟指數(shù)可以作為參考指標(biāo)，F(xiàn)lu-T7的脾臟指數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表示Flu-T7毒副作用較低，可以作為流感疫苗的一種安全佐劑。

病毒抗體只是消除細(xì)胞外的病毒，無法清除進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的病毒。所以，只有快速、早期清除感染的細(xì)胞才能終止病毒復(fù)制。在本研究中，IgG的亞型、脾細(xì)胞因子的分泌，表明SZU-101不僅可以增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答，同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的H1N1流感疫苗的交叉保護(hù)性免疫能力。普通的流感無佐劑疫苗加本實(shí)驗(yàn)室自行合成的T7所設(shè)計(jì)的疫苗組合是抗擊流感疫苗一種更有效的方法，值得推廣。

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（收稿日期：2015-11-04 本文編輯：趙魯楓）