張璇 鄭兆浠 鄭劍斌 李慧 周薇

[摘要] 目的 建立LC-MS/MS法檢測(cè)小鼠血漿內(nèi)FG-4592的濃度，研究FG-4592在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)。 方法 KM小鼠腹腔注射FG-4592 5 mg/kg，不同時(shí)間點(diǎn)采集血漿，樣品經(jīng)甲醇沉淀。選用Agilent Zorbax SB-Aq-C18色譜柱（2.1 mm× 100 mm，3.5 μm），柱溫25℃，流動(dòng)相為甲醇-水（含5 mmol/L甲酸銨，0.1%甲酸）（90∶10），流速0.35 mL/min。采用ESI離子源，正離子模式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，離子通道分別為m/z 353.1→ m/z 278.1（FG-4592）和m/z 294.9→m/z 235.0（內(nèi)標(biāo)物）。 結(jié)果 測(cè)定血漿中FG-4592的線性范圍為1～1000 ng/mL，日內(nèi)及日間精密度均<10%，準(zhǔn)確度在90%～105%范圍內(nèi)，方法學(xué)考察均符合生物樣品的分析要求。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Cmax為（22.80±0.36）μg/mL，AUC（0-72）為（31.64±0.97）（μg·h）/mL，t1/2為8.81 h。 結(jié)論 本研究建立的FG-4592血藥濃度測(cè)定方法可行，該藥物在血液中吸收良好，測(cè)定結(jié)果可為藥物的基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] FG-4592；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；藥代動(dòng)力學(xué)

[中圖分類號(hào)] R969.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）03（c）-0014-05

[Abstract] Objective To develop a LC-MS/MS method for the quantitative analysis of FG-4592 in mice plasma and to study the pharmacokinetic profile of FG-4592 with this method. Methods KM mice were intraperitoneally administered 5 mg/kg FG-4592. The plasma samples were collected at different time points and precipitated by methanol. An Agilent Zorbax C18 （2.1 mm×100 mm， 3.5 μm） chromatographic column with the column temperature of 25℃ was used. The mobile phase consisted of methanol-water （contained 5 mmol/L ammonium formate and 0.1 % formic acid） （90∶10）. The flow rate of mobile phase was 0.35 mL/min. The analyte was monitored by positive electrospray ionization （ESI） in multiple reaction monitoring mode. The mass transition pairs was m/z 353.1→ m/z 278.1 （FG-4592） and m/z 294.9→ m/z 235.0 （internal standard） respectively. Results The calibration curve was established in concentration range of 1-1000 ng/mL. The intra-and inter-day RSDs were both less than 10%. The method recoveries were within 90%-105% and met for the requirements of biological sample analysis. The pharmacokinetic parameters were as follows： Cmax was （22.80±0.36） μg/mL， AUC（0-72） was （31.64±0.97） （μg·h）/mL， t1/2 was 8.81 h. Conclusion This method is reliable. FG-4592 is well absorbed in mice blood and the results can provide the basis for fundamental research.

[Key words] FG-4592； LC-MS/MS； Pharmacokinetic

Roxadustat（FG-4592）是一種脯氨酸羥化酶（PHD）的小分子抑制劑，屬于4-羥基異喹啉類衍生物[1]，目前正處于治療慢性腎病患者貧血癥狀的三期臨床試驗(yàn)階段。2013年阿斯利康與FibroGen公司合作，計(jì)劃使FG-4592于2017年上市，彌補(bǔ)現(xiàn)有紅細(xì)胞生成刺激劑（ESA）治療貧血癥狀的不足[2-3]。FG-4592 通過抑制PHD穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子調(diào)控下游相關(guān)靶基因，主要參與血管生成、葡萄糖代謝、細(xì)胞遷移和胞外基質(zhì)重塑等生理生化過程[4-7]。

最新研究表明長(zhǎng)期給予PHD抑制劑可以提高健康小鼠的認(rèn)知功能，增強(qiáng)突觸可塑性[8]。FG-4497可減輕缺血性中風(fēng)小鼠的腦組織損傷和水腫癥狀，具有神經(jīng)保護(hù)作用[9]，為有效治療中風(fēng)帶來新的希望[10-11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)癡呆小鼠模型中，F(xiàn)G-4592具有顯著的癥狀改善作用，為進(jìn)一步研究該藥物癥狀改善機(jī)制，亟需了解FG-4592在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)情況，以便優(yōu)化日后的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排，為后續(xù)的研究工作提供依據(jù)。因此，建立一種可快速、靈敏地檢測(cè)小鼠體內(nèi)FG-4592濃度的方法必不可少。本研究采用LC-MS/MS法測(cè)定小鼠血漿中FG-4592的藥物濃度，并將此方法應(yīng)用到藥代動(dòng)力學(xué)研究中。

1 儀器與試藥

1.1 藥品與試劑

FG-4592（美國(guó)Selleck Chemical，批號(hào)：S100703，純度99.39%）；內(nèi)標(biāo)物（IS）由西北大學(xué)費(fèi)因伯格醫(yī)學(xué)院鄭劍斌博士合成，純度98%以上，是合成FG-4592的中間產(chǎn)物。甲酸、甲醇（美國(guó)Tedia公司）均為色譜純，水為實(shí)驗(yàn)室自制，其他試劑均為化學(xué)純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 6410質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司），配有ESI-電噴霧離子源，MassHunter數(shù)據(jù)采集處理工作站；Agilent 1200液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)安捷倫科技公司），配有G1311A四元梯度泵，G1322A在線真空脫氣機(jī)，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱；XS 105dual range分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；-80℃冰箱（美國(guó)Thermo Fisher scientific公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；渦旋振蕩器（美國(guó)Scientific industries公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡健康昆明小鼠，雌雄各半，體重20～25 g，許可證號(hào)：SCXK（滬）2004-0001，由上海交大醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本實(shí)驗(yàn)由上海交大醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定條件

2.1.1 色譜條件 選用Zorbax SB-Aq-C18 column（2.1 mm×100 mm，3.5 μm；Agilent Technologies，美國(guó)）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇與水（內(nèi)含5 mmol/L甲酸銨，0.1%甲酸）混合，比例為90∶10。柱溫25℃，流速0.35 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，采用正離子模式掃描；離子源電壓4 kV；干燥氣流速為8 L/min，噴霧氣壓力為25 psi，干燥氣溫度350℃。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)的各參數(shù)見表1。FG-4592及IS化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 FG-4592小鼠給藥溶液的配制 精密稱取適量FG-4592，以丙二醇∶PBS=15∶85作溶劑配制5 mg/mL溶液，臨用前用PBS稀釋1/10，給藥劑量5 mg/kg。

2.2.2 FG-4592標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)IS溶液的配制 精密稱取FG-4592和IS各1 mg，用甲醇（含0.1%甲酸）分別溶解，制得1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 血漿樣品的處理

2.3.1 空白血漿樣品的制備 在小鼠清醒狀態(tài)下臉頰刺血約0.1 mL至包被肝素的EP管中，4℃ 4000 r/min離心10 min，吸取上清加入0.1%甲酸，-80℃保存。

2.3.2 樣品的處理與測(cè)定 取空白血漿或稀釋后的血漿樣品45 μL，加入甲醇（含0.1%甲酸）或FG-4592標(biāo)準(zhǔn)液5 μL混勻后，用200 μL含IS 20 ng/mL的甲醇（含0.1%甲酸）溶液沉淀蛋白，渦旋，14 000 r/min離心5 min，取上清150 μL于進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)樣量5 μL。

2.4 專屬性實(shí)驗(yàn)

取小鼠空白血漿45 μL，加入5 μL甲醇溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作，得空白血漿的色譜圖（圖2a）。將5 μL 1000 ng/mL FG-4592溶液加入45 μL空白血漿中，按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作得色譜圖（圖2c）。小鼠腹腔注射5 mg/kg FG-4592 10 min后的血漿處理進(jìn)樣，得色譜圖（圖2d）。結(jié)果表明FG-4592和IS的保留時(shí)間分別為1.2、1.1 min，二者出峰附近無雜質(zhì)峰干擾，峰形良好，說明方法有較高的特異性。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限

用甲醇稀釋1 mg/mL FG-4592標(biāo)準(zhǔn)液得到10、50、100、500、1000、5000、10000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取45 μL空白血漿中加入5 μL上述不同濃度的FG-4592標(biāo)準(zhǔn)品溶液，得到終濃度分別為1、5、10、50、100、500、1000 ng/mL的系列樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作。以樣品藥物濃度（X）與樣品峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）進(jìn)行回歸，得到回歸方程Y=0.020 625X-0.017 767，r=0.999，結(jié)果顯示血漿藥物濃度在1～1000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為1 ng/mL。見圖2b。

2.6 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)

用甲醇稀釋1 mg/mL FG-4592標(biāo)準(zhǔn)液得到25、1000、7500 ng/mL的溶液，取45 μL空白血漿中加入5 μL上述溶液，配制成濃度分別為2.5、100、750 ng/mL的FG-4592質(zhì)控樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作。每個(gè)濃度平行做5份，連續(xù)測(cè)定3 d。統(tǒng)計(jì)日內(nèi)、日間精密度和方法回收率。3種濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)、日間RSD值均≤2.09%，方法回收率在97.43% ～100.24%之間，精密度和準(zhǔn)確度均滿足生物樣品分析要求。見表2。

2.7 提取回收率與基質(zhì)性考察

FG-4592質(zhì)控樣品按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣得峰面積A1；45 μL空白血漿加入200 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋，14 000 r/min離心5 min，原管分別加入25、1000、7 500 ng/mL的FG-4592溶液5 μL，混勻離心后取上清進(jìn)樣，得峰面積A2；三蒸水45 μL加入200 μL甲醇，渦旋后分別加入25、1000、7500 ng/mL的FG-4592溶液5 μL，混勻后14 000 r/min離心5 min，取上清進(jìn)樣，得峰面積A3。每個(gè)濃度平行做5份。以A1/A2×100%計(jì)算得FG-4592的提取回收率，以A2/A3×100%計(jì)算得到基質(zhì)效應(yīng)。低、中、高濃度質(zhì)控樣品的提取回收率均>95%，基質(zhì)效應(yīng)在94% ～100%范圍內(nèi)，符合生物樣品的分析要求。見表3。

2.8 穩(wěn)定性考察及稀釋實(shí)驗(yàn)

取FG-4592質(zhì)控樣品分別考察室溫放置4 h、處理后樣品進(jìn)樣器內(nèi)放置6 h、反復(fù)凍融3次、-80℃冰箱保存2周的穩(wěn)定性，每個(gè)濃度檢測(cè)3份樣品，結(jié)果表明以上各條件下測(cè)定濃度與實(shí)際濃度的相對(duì)誤差均在15%內(nèi)，表明在此放置條件下FG-4592較穩(wěn)定?？瞻籽獫{稀釋FG-4592標(biāo)準(zhǔn)液得25 μg/mL的血漿樣品，再用空白血漿稀釋20倍，按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作，結(jié)果稀釋后測(cè)得藥物濃度的RSD<5%，RE<10%，表明此方法可應(yīng)用于高于標(biāo)準(zhǔn)濃度的FG-4592血漿樣品分析中。

2.9 小鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)

小鼠隨機(jī)分為每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6～8只，給藥前12 h禁食，腹腔注射5 mg/kg FG-4592后于0.08、0.17、0.33、0.5、0.67、1、1.5、2、3、5、8、12、24、48、72 h分別臉頰刺血約0.1 mL，4℃下4000 r/min離心10 min，取上清加入0.1%甲酸。用空白血漿稀釋20倍后，樣品按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的藥物濃度，繪制血藥濃度-時(shí)間曲線（圖3）。結(jié)果血藥濃度數(shù)據(jù)符合非房室模型，以WinNolin（Version 6.3）軟件進(jìn)行擬合，得藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：達(dá)峰時(shí)間（tmax）為0.17 h，達(dá)峰濃度（Cmax）為（22.80±0.36）μg/mL，半衰期（t1/2）為8.81 h，AUC（0-72）為（31.64±0.97）（μg·h）/mL，清除率為157.81 mL/（h·kg）。見圖3。

3 討論

本文建立了一個(gè)靈敏、簡(jiǎn)便、快速的LC-MS/MS方法，對(duì)小鼠血漿中FG-4592的濃度進(jìn)行檢測(cè)，并針對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行了考察。

FG-4592以正離子模式進(jìn)行全掃描，確定母離子及定量子離子。選用FG-4592的合成中間產(chǎn)物作為內(nèi)標(biāo)，該中間產(chǎn)物保留了FG-4592的酰胺鍵，結(jié)構(gòu)與其相似，質(zhì)譜特征相近，并且與FG-4592的出峰互不干擾，因此是理想的內(nèi)標(biāo)[12]。本方法采用4倍體積甲醇沉淀蛋白，充分稀釋基質(zhì)，最低定量限的信噪比仍可達(dá)到15，滿足定量分析要求。同時(shí)，蛋白沉淀這種方法更易實(shí)現(xiàn)高通量[13-15]，每批樣品（24個(gè)）處理不超過30 min。綜上，本實(shí)驗(yàn)建立的LC-MS/MS法可專一靈敏的檢測(cè)小鼠血漿內(nèi)FG-4592的濃度，樣品處理方法簡(jiǎn)單，可有效地運(yùn)用到藥代動(dòng)力學(xué)的研究中。

對(duì)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)G-4592在小鼠的血漿中半衰期較短，如需長(zhǎng)期給藥，需每日2～3次，藥物在血漿中達(dá)峰較快，AUC較大，說明此藥物在小鼠體內(nèi)吸收快且吸收量大。若將該藥物運(yùn)用到治療癡呆的小鼠模型中，仍需關(guān)注腹腔給藥后外周血漿和中樞腦內(nèi)的濃度比值，如外周濃度較高，則需注意在治療癡呆的治療劑量時(shí)，外周有無副作用發(fā)生[16-18]，后期將進(jìn)一步考察小鼠的腦藥濃度并對(duì)給藥方式進(jìn)行改良。清除率157.81 mL/（h·kg），給藥72 h后血漿中幾乎檢測(cè)不到藥物的存在，表明需要在后期實(shí)驗(yàn)中對(duì)藥物的有效濃度和停藥后的藥效做進(jìn)一步研究[19-26]，為以后的臨床研究打下扎實(shí)的基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Besarab A，Chernyavskaya E，Motylev I，et al. Roxadustat （FG-4592）：correction of anemia in incident dialysis patients [J]. Journal of the American Society of Nephrology，2015：ASN.2015030241.

[2] Flight MH. Deal watch：AstraZeneca bets on FibroGen's anaemia drug [J]. Nature Reviews Drug Discovery，2013，12（10）：730.

[3] Bouchie A. First-in-class anemia drug takes aim at Amgen's dominion [J]. Nature biotechnology，2013，31（11）：948-949.

[4] Bruick RK，McKnight SL. A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that modify HIF [J]. Science，2001，294（5545）：1337-1340.

[5] Smith TG，Talbot NP. Prolyl hydroxylases and therapeutics [J]. Antioxidants & redox signaling，2010，12（4）：431-433.

[6] Myllyharju J. HIF prolyl 4-hydroxylases and their potential as drug targets [J]. Current pharmaceutical design，2009，15（33）：3878-3885.

[7] Metzen E，Ratcliffe PJ. HIF hydroxylation and cellular oxygen sensing [J]. Biological chemistry，2004，385（3-4）：223-230.

[8] Adamcio B，Sperling S，Hagemeyer N，et al. Hypoxia inducible factor stabilization leads to lasting improvement of hipp-ocampal memory in healthy mice [J]. Behavioural brain research，2010，208（1）：80-84.

[9] Reischl S，Li L，Walkinshaw G，et al. Inhibition of HIF prolyl-4-hydroxylases by FG-4497 reduces brain tissue injury and edema formation during ischemic stroke [J]. PLoS One，2014 Jan 7；9（1）：e84767.

[10] Yamashita T，Abe K. Recent progress in therapeutic strategy for ischemic stroke [J]. Cell transplantation，2016.

[11] Jones SM，Novak AE，Elliott JP. The role of HIF in cobalt-induced ischemic tolerance [J]. Neuroscience，2013，252：420-430.

[12] 徐新軍，劉皋林，張正行，等.藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究中分析方法建立時(shí)應(yīng)注意的一些問題[J].藥物分析雜志， 2001， 21（4）：302-305.

[13] 李章萬，徐秀榮.色譜分析中生物樣品的前處理方法[J].藥物分析雜志，1996，16（1）：55-59.

[14] 鄧陽，張畢奎，顏苗，等.LC-MS/MS測(cè)定大鼠血漿中16種膽汁酸及在甘草減毒研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2015，50（3）：263-268.

[15] 熊志立，俞嘉，何積芬，等.LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中加巴噴丁的濃度及其藥動(dòng)學(xué)研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011， 46（10）：1246-1250.

[16] 陳原鄰，劉喜明.阿爾茨海默病的中西醫(yī)治療進(jìn)展[J].世界中醫(yī)藥，2014，9（1）：113-116.

[17] 段磊，司繼剛，劉萍.阿爾茨海默病藥物治療研究進(jìn)展[J]. 河北醫(yī)藥，2015，37（7）：1077-1080.

[18] 李德慶，張浩巖.治療阿爾茨海默病的膽堿酯酶抑制劑的藥動(dòng)學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2007，4（30）：5-6.

[19] 許珍晶.阿爾茨海默病臨床研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2014，26（2）：194-196.

[20] 程勇，宋友華.阿爾茨海默病的藥物治療[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，1999，15（4）：295-298.

[21] 王悅，童建.高效液相質(zhì)譜法測(cè)定大鼠血漿中布洛芬濃度[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)裝備，2014，11（B12）：105.

[22] 趙光，李珺，杜雪靜.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析木瓜中綠原酸與抗癌活性成分的相關(guān)性研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)裝備，2014，11（5）：4-6.

[23] 宋學(xué)英，楊華，趙逸松，等.高效液相色譜儀的應(yīng)用分析[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)裝備，2015，12（1）：29-31.

[24] 張曉旭，王洪平，楊陽，等.超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法快速鑒別生曬參中的皂苷類成分[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，12（9）：130-136.

[25] 張小俊，趙志鴻，王桂芳，等.頂空固相微萃取與其他方法提取艾葉揮發(fā)性成分比較[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015， 12（9）：137-141.

[26] 蘇玲，謝鳳鳳，唐玉榮，等.瑤藥大腸風(fēng)與小腸風(fēng)揮發(fā)油成分氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，11（36）：83-87.

（收稿日期：2015-11-01 本文編輯：趙魯楓）