賈曉康 黃云梅 李超雄 林煜 林向全 黃美雅 吳銀生

[摘要] 目的 觀察健骨顆粒對成骨細(xì)胞G1/S期調(diào)控的影響，探討健骨顆粒促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。 方法 制備健骨顆粒血清組、模型血清組和雌二醇血清組。采用酶消化法培養(yǎng)SD大鼠成骨細(xì)胞，健骨顆粒含藥血清干預(yù)，以模型血清和雌二醇血清為對照。運用流式細(xì)胞術(shù)檢測成骨細(xì)胞增殖周期，熒光定量PCR法檢測成骨細(xì)胞G1/S期調(diào)控蛋白Cyclin E、CDK2、p21和轉(zhuǎn)錄因子E2F-1 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 15%的雌二醇血清與健骨顆粒血清干預(yù)48 h，成骨細(xì)胞增殖速度均明顯快于模型血清組（P < 0.01）；G0/G1期成骨細(xì)胞比例明顯降低（P < 0.01），S期、G2/M期細(xì)胞比例及增殖指數(shù)則明顯高于模型血清組（P < 0.01）；與模型血清組比較，雌二醇血清組與健骨顆粒血清組能提高成骨細(xì)胞Cyclin E、CDK2及轉(zhuǎn)錄因子E2F-1 mRNA的表達(dá)（P < 0.01），而降低p21的表達(dá)（P < 0.01）。 結(jié)論 健骨顆粒通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞G1/S期調(diào)控機(jī)制，推進(jìn)成骨細(xì)胞順利通過G1/S檢測點，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。

[關(guān)鍵詞] 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥；成骨細(xì)胞；細(xì)胞周期；G1/S期；健骨顆粒

[中圖分類號] R285.5；R681 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（c）-0009-05

[Abstract] Objective To observe the effects of Jiangu Granules on the G1/S phase cell-cycle regulated proteins of osteoblasts， so as to reveal the mechanism of Jiangu Granules in promoting osteoblasts proliferation. Methods The Jiangu Granules-serum group， model-serum group and estradiol-serum group were prepared. Osteoblasts of SD rats were cultivated by enzymatic digestion and intervened with Jiangu Granules-serum， model-serum and estradiol-serum （as control） respectively. The cell cycles were analyzed by flow cytometry， while the fluorescence quantitative PCR was applied to measure cyclin E， CDK2， p21 and E2F-1 mRNA. Results The cell proliferation rates of osteoblasts intervened with estradiol serum and Jiangu Granules-serum for 48 hours were faster than that with the same concentration model-serum （P < 0.01）. Compared with the model-serum group， the proportion of osteoblasts in the G0/G1 phase were significantly reduced after intervention with 15% of estradiol serum and Jiangu Granules-serum for 48 hours （P < 0.01）， while the proportion of cells in S phase， G2/M phase and proliferation index was much higher （P < 0.01）. The expression of cycling E， CDK 2 and transcription factor E2F-1 mRNA of osteoblasts in the Jiangu Granules-serum group and the estradiol-serum group was higher than that of model-serum group （P < 0.01）， while the expression of p21 mRNA was lower than the model-serum group （P < 0.01）. Conclusion Jiangu Granules-serum can adjust the G1/S phase cell-cycle regulated mechanism in osteoblast， so as to push the cells passing G1/S checkpoint and accelerate the proliferation of osteoblast.

[Key words] Postmenopausal osteoporosis； Osteoblast； Cell cycle； G1/S phase； Jiangu Granules

骨質(zhì)疏松癥形成的主要原因是骨形成、骨吸收偶聯(lián)的破壞，使骨形成減少、骨量降低。成骨細(xì)胞在骨代謝、骨形成和維持成年骨骼系統(tǒng)正常中有著主要作用[1]，而成骨細(xì)胞增殖周期的進(jìn)程受周細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控，其中G1/S期檢測點是細(xì)胞周期進(jìn)程中最重要的檢測點[2]，主要受Cyclin E、CDK2、p21和轉(zhuǎn)錄因子E2F等G1/S期調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控。前期研究表明，健骨顆?？梢源龠M(jìn)成骨細(xì)胞增殖，對防治骨質(zhì)疏松癥有積極的作用[3-4]。本研究以成骨細(xì)胞G1/S期調(diào)控為切入點，觀察補(bǔ)腎健脾中藥健骨顆粒對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞G1/S期調(diào)控蛋白Cyclin E、CDK2、p21和轉(zhuǎn)錄因子E2F mRNA的影響，探討健骨顆粒促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，對于進(jìn)一步認(rèn)識成骨細(xì)胞增殖的機(jī)制，治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

健骨顆粒由煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、山藥、黨參等藥物組成，原藥材購自福建省醫(yī)藥公司，由福建中醫(yī)藥研究院中試車間負(fù)責(zé)加工制備，每克健骨顆粒含原生藥2.9 g。戊酸雌二醇（德國BAYER公司生產(chǎn)，批號：199A2），購自福州回春醫(yī)藥連鎖有限公司。

1.2 實驗動物

6 月齡清潔級雌性SD大鼠30只[購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，實驗動物合格證號：SCXK（滬）2007-0005，編號：2007000514856]，大鼠體重（250±20）g。醫(yī)學(xué)實驗動物環(huán)境設(shè)施為福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心鼠類實驗室，清潔級[許可證號：SYXK（閩）2009-0001]。新生24 h內(nèi)的SD大鼠4只[購自福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（閩）2004-00023]，以酶消化法分離其顱蓋骨成骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。

1.3 實驗試劑

Ⅰ型膠原酶、0.25%胰蛋白酶、MTT噻唑藍(lán)（Sigma公司）；胎牛血清、青鏈霉素雙抗溶液、低糖DMEM 培養(yǎng)基（新西蘭Hyclone公司）；細(xì)胞堿性磷酸酶（CAKP）染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）；TRIZOL（美國Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR GREENⅠ 熒光定量試劑盒（TaKaRa公司）；PCR引物合成（上海生工生物技術(shù)有限公司）；CycleTESTTM Plus DNA Reagent Kit（美國Becton Dickinson公司）。

1.4 儀器與設(shè)備

AIR TECH無菌操作臺（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（BB16/BB5060型，德國Heraus公司）；超低溫冰箱MDF-U4086s型（日本三洋公司）；Olympus倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；紫外分光光度計Du650型、低溫高速離心機(jī)64R型（美國BECKMAN公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國MILIPORE公司）；流式細(xì)胞儀FACSCalibur（美國Becton Dickinson公司）；7500型實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.5 方法

1.5.1 含藥血清制備 30只6月齡SD雌性大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成模型血清組、雌二醇血清組和健骨顆粒血清組，每組各10只。各組大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)并于術(shù)后第13周開始灌胃，雌二醇血清組、健骨顆粒血清組分別給予戊酸雌二醇100 μg/（kg·d）或健骨顆粒2 g/（kg·d），模型血清組喂服生理鹽水2 mL/d。各組動物灌胃12周，于最后1次灌胃1 h后腹主動脈無菌取血，離心分離血清，滅火、過濾除菌后，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 成骨細(xì)胞培養(yǎng) 取新生SD大鼠4只，采用酶消化法分離收集顱骨成骨細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，差速貼壁法進(jìn)行純化。

1.5.3 MTT法檢測成骨細(xì)胞增殖 取第3代細(xì)胞以2×103/孔接種于96孔板中，分別加入含5%、10%、15%、20%、25%、30%健骨顆粒血清、雌二醇血清或模型血清的DMEM培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)6孔，干預(yù)48 h后MTT法檢測比較不同濃度含藥血清和模型血清對細(xì)胞增殖的影響，并得出最佳含藥血清濃度。

1.5.4 成骨細(xì)胞的分組干預(yù) 取第3代細(xì)胞以1×105/mL傳代接種于培養(yǎng)瓶中，根據(jù)不同的分組分別加入不同含藥血清，各組分別加入含最佳濃度健骨顆粒血清的DMEM培養(yǎng)基、相應(yīng)濃度模型血清或雌二醇血清培養(yǎng)基，每組設(shè)6孔，于干預(yù)培養(yǎng)48 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)分析成骨細(xì)胞的細(xì)胞周期，采用實時熒光定量PCR SYBR GREEN法檢測Cyclin E、CDK2、p21和轉(zhuǎn)錄因子E2F-1 mRNA的表達(dá)。

1.5.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測 按試劑說明書提供的實驗步驟進(jìn)行上機(jī)前處理，上流式細(xì)胞儀檢測，應(yīng)用CellQuest軟件獲取細(xì)胞100個，ModFit軟件分析DNA數(shù)據(jù)，讀取G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞數(shù)，計算細(xì)胞增殖指數(shù)（proliferation index，PI）。

1.5.6 實時熒光定量PCR法檢測Cyclin E、CDK2、E2F-1、p21 mRNA表達(dá) 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供實驗步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成Cyclin E、CDK2、E2F-1、p21擴(kuò)增引物，根據(jù)兩步法標(biāo)準(zhǔn)Real Time PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增，用參照基因β-actin對所有樣品進(jìn)行校正，7500型實時定量PCR儀軟件分析時，以模型血清組中某一樣本mRNA的表達(dá)量作為“1”，計算出各組其他樣本的相對表達(dá)量（即RQ值），利用各組樣本的RQ值進(jìn)行統(tǒng)計，比較組間mRNA相對含量[5]。

Cyclin E、CDK2、E2F-1、p21引物序列見表1。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)運用SPSS 15.0軟件包進(jìn)行處理分析，實驗數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間數(shù)據(jù)比較采用One-way ANOVA（單向方差分析）法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度含藥血清干預(yù)后成骨細(xì)胞增殖情況

采用MTT檢測成骨細(xì)胞增殖，給予不同濃度模型血清、雌二醇血清和健骨顆粒血清干預(yù)48 h后，模型血清組、雌二醇血清組和健骨顆粒血清組成骨細(xì)胞增殖速度因干預(yù)濃度的不同而差異明顯。在血清濃度低于20%前，成骨細(xì)胞隨血清濃度的增加而增殖加快；當(dāng)血清濃度達(dá)到20%時，各組成骨細(xì)胞增殖最快；血清濃度繼續(xù)升高則細(xì)胞增殖逐漸降低。其中，雌二醇血清組和健骨顆粒血清組細(xì)胞增殖速度明顯快于同濃度模型血清組，以15%濃度時增殖速度與模型血清組差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；健骨顆粒血清組成骨細(xì)胞增殖速度與雌二醇血清組相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。取15%血清作為干預(yù)成骨細(xì)胞的最佳濃度，進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 不同含藥血清干預(yù)48 h前后成骨細(xì)胞鏡下觀察

不同含藥血清干預(yù)前后成骨細(xì)胞的鏡下觀察，可見干預(yù)前成骨細(xì)胞排列不整齊，細(xì)胞數(shù)量少，且細(xì)胞間隙大，見圖1A。而干預(yù)后三組細(xì)胞數(shù)量都有增加，但模型血清組干預(yù)48 h后的，細(xì)胞間隙較大，見圖1B。而健骨顆粒血清組與雌二醇血清組干預(yù)48 h后細(xì)胞形態(tài)較一致，排列較整齊，細(xì)胞間隙較窄，同視野下細(xì)胞數(shù)量明顯比模型血清組密度大，見圖1C～D。

2.3 不同含藥血清干預(yù)后成骨細(xì)胞細(xì)胞周期的分布

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與模型血清組比較，15%的雌二醇血清與健骨顆粒血清干預(yù)48 h后，G0/G1期成骨細(xì)胞比例明顯降低（P < 0.01），而S期、G2/M期細(xì)胞比例及PI則明顯高于模型血清組（P < 0.01）；雌二醇血清組與健骨顆粒血清組二組的成骨細(xì)胞周期分布情況相近，二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。此外，模型血清組細(xì)胞周期分布圖中G0/G1期之前出現(xiàn)明顯的凋亡峰，而雌二醇血清組與健骨顆粒血清組細(xì)胞凋亡峰明顯降低，甚至消失。見圖2、表3。

2.4 不同含藥血清干預(yù)后成骨細(xì)胞G1/S期調(diào)控蛋白mRNA表達(dá)

2.4.1 成骨細(xì)胞Cyclin E mRNA的表達(dá) 以15%濃度的不同血清干預(yù)成骨細(xì)胞48 h后，熒光定量PCR檢測顯示，與模型血清組比較，雌二醇血清組與健骨顆粒血清組成骨細(xì)胞Cyclin E mRNA表達(dá)（RQ值）升高，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；雌二醇血清組與健骨顆粒血清組Cyclin E mRNA表達(dá)相近，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表4。

2.4.2 成骨細(xì)胞CDK2 mRNA的表達(dá) 熒光定量PCR檢測15%血清干預(yù)48 h后模型血清組、雌二醇血清組和健骨顆粒血清組成骨細(xì)胞CDK2 mRNA結(jié)果顯示，與模型血清組比較，雌二醇血清組與健骨顆粒血清組成骨細(xì)胞CDK2 mRNA表達(dá)大大增加，組間比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；而雌二醇血清組與健骨顆粒血清組CDK2 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表5。

2.4.3 成骨細(xì)胞p21 mRNA的表達(dá) 熒光定量PCR檢測成骨細(xì)胞p21 mRNA結(jié)果顯示，15%模型血清、雌二醇血清和健骨顆粒血清分別干預(yù)模型血清組、雌二醇血清組和健骨顆粒血清組成骨細(xì)胞48 h后，雌二醇血清組與健骨顆粒血清組成骨細(xì)胞 p21 mRNA表達(dá)情況相近（P > 0.05），均明顯低于模型血清組（P < 0.01）。見表6。

2.4.4 成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子E2F-1 mRNA 的表達(dá) 以15%濃度的不同血清干預(yù)成骨細(xì)胞模型血清組、雌二醇血清組和健骨顆粒血清組48 h后，熒光定量PCR檢測顯示，健骨顆粒血清組成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子E2F-1 mRNA表達(dá)明顯高于模型血清組，但遜于雌二醇血清組，組間比較差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表7。

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎虧脾虛是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病基礎(chǔ)[6-7]，腎虛為骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的根本，而脾虛是骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)生的重要病機(jī)，在治療上以補(bǔ)腎健脾之法作為開藥法則，可有效防止人體骨量的丟失[8]。用補(bǔ)腎方藥探討骨質(zhì)疏松癥分子生物學(xué)機(jī)制為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的熱點[9-11]。復(fù)方中藥能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，提高骨密度[12]，針對“腎虧脾虛”的病機(jī)特點，補(bǔ)腎健脾中藥健骨顆粒以“補(bǔ)先后天”的理論為組方原則，選用煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、黨參、山藥等藥，以補(bǔ)腎健脾，強(qiáng)筋壯骨。前期研究表明，健骨顆粒能通過調(diào)節(jié)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠垂體-腎上腺軸的功能[13]，明顯提高去卵巢大鼠血清E2水平[14]；提高體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞G1期調(diào)節(jié)蛋白正性調(diào)節(jié)因子Cyclin D1、CDK4蛋白的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖周期G1期進(jìn)程[15]。

本研究用成骨細(xì)胞為新生SD大鼠顱骨培養(yǎng)，純度較高，生物學(xué)特征穩(wěn)定，成骨活性和細(xì)胞增殖良好。鏡下觀察48 h血清干預(yù)后，健骨顆粒血清組與雌二醇血清組增殖明顯優(yōu)于模型血清組。MTT法檢測不同濃度含藥血清對成骨細(xì)胞增殖的影響，雌二醇血清組和健骨顆粒血清組細(xì)胞增殖速度明顯快于同濃度模型血清組，以15%濃度時增殖速度與模型血清組差異最顯著（P < 0.01）；健骨顆粒血清組成骨細(xì)胞增殖速度與雌二醇血清組相近（P > 0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與模型血清組比較，15%的雌二醇血清與健骨顆粒血清干預(yù)48 h后，G0/G1期成骨細(xì)胞比例明顯降低（P < 0.01），而S期、G2/M期細(xì)胞比例及PI則明顯高于模型血清組（P < 0.01）；雌二醇血清組與健骨顆粒血清組的成骨細(xì)胞周期分布情況相近，二者比較無顯著性差異（P > 0.05）。研究表明，雌激素缺乏導(dǎo)致了骨代謝中骨形成及骨吸收的失衡，最終造成骨質(zhì)疏松的發(fā)生[16-17]。雌激素具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用，這是通過激活G1/S期的調(diào)節(jié)蛋白促進(jìn)細(xì)胞周期的G1進(jìn)程來實現(xiàn)的[18-19]。本研究采用不同含藥血清干預(yù)后成骨細(xì)胞G1/S期調(diào)控蛋白 mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)：用雌二醇作用于體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，能使成骨細(xì)胞Cyclin E、CDK2和轉(zhuǎn)錄因子E2F-1 mRNA的表達(dá)明顯提高，而p21 mRNA的表達(dá)降低，提示雌二醇能大量激活Cyclin E、CDK2，活化轉(zhuǎn)錄因子E2F-1，促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)換，推動細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖；并能抑制G1/S期負(fù)性調(diào)節(jié)因子p21表達(dá)，減少成骨細(xì)胞G1周期阻滯，進(jìn)而抑制成骨細(xì)胞G1期凋亡，這可能是雌激素保護(hù)成骨細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制之一[20]。而健骨顆粒在促成骨細(xì)胞增殖和保護(hù)成骨細(xì)胞凋亡上，均能發(fā)揮與雌二醇相近的作用。健骨顆粒在推進(jìn)成骨細(xì)胞增殖周期G1期進(jìn)程后，能進(jìn)一步激活Cyclin E、CDK2，活化轉(zhuǎn)錄因子E2F-1，促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)換，使細(xì)胞增殖進(jìn)入S期，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖；同時抑制p21，減少成骨細(xì)胞G1周期阻滯，進(jìn)而抑制成骨細(xì)胞G1期凋亡。健骨顆粒的這一作用可能與其能提高E2水平有關(guān)，通過調(diào)控G1/S期相關(guān)蛋白來促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。

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（收稿日期：2015-10-28 本文編輯：張瑜杰）