吳玉鵬，趙曉梅

（1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉831100；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物質(zhì)能源研究所，新疆烏魯木齊830091）

庫爾勒香梨萼端黑斑病發(fā)病規(guī)律及生理變化的研究

吳玉鵬1，趙曉梅2，*

（1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉831100；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物質(zhì)能源研究所，新疆烏魯木齊830091）

為了提高庫爾勒香梨對萼端黑斑病的抗病性，先采用0.014%Ca、2.0 μL/L 1-MCP、0.014%Ca和2.0 μL/L 1-MCP相結(jié)合的方法處理庫爾勒香梨果實，提高其抗病性；再反接入萼端黑斑病病原菌，研究常溫條件下病斑的發(fā)病情況及生理活性的變化。試驗結(jié)果表明，采前噴施0.014%液鈣能夠抑制庫爾勒香梨果實萼端黑斑病病原菌的橫向生長；采后2.0 μL/L 1-MCP處理可抑制果實呼吸強(qiáng)度，提高果實的PAL活性；（采前0.014%鈣+采后2.0 μL/L 1-MCP）能夠可以提高果實中的總酚含量，抑制縱向生長和果實乙烯的釋放，延緩果實衰老；對照能使果實保持較高的β-1，3葡聚糖酶活性。

庫爾勒香梨；萼端黑斑??；發(fā)病規(guī)律；生理變化

庫爾勒香梨采后萼端黑斑病和黑心病是因為果實品質(zhì)下降和缺鈣引起的生理病害［1］，鈣［2］和1-MCP［3］在提高果實品質(zhì)、延緩果實衰老方面具有重要的作用。本試驗在此基礎(chǔ)上，先采用一定濃度的鈣處理、1-MCP處理以及鈣和1-MCP組合處理正常果實，再在這些處理和對照果實上反接入庫爾勒香梨萼端黑斑病病原菌，研究常溫條件下病斑直徑、病斑深度的發(fā)病情況及呼吸強(qiáng)度、乙烯釋放量、總酚含量，PAL和β-1，3葡聚糖酶活性的變化，分析果實感病后生理活性的變化規(guī)律，從而篩選出抗病的處理條件，旨為庫爾勒香梨的貯藏保鮮提供豐富的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

1.1.1試驗材料

在巴州輪臺縣新疆農(nóng)科院輪臺國家果樹資源圃王德福果園進(jìn)行。在庫爾勒香梨座果2周～6周內(nèi)，每隔1周采用0.014%液鈣肥噴灑樹體葉片1次，以清水為對照，噴施3次。單株小區(qū)，重復(fù)3次。

1.1.2試驗試劑

乙醇、硼砂、硼酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、乙二胺四乙酸（EDTA）、β-巰基乙醇、L-苯丙氨酸、濃鹽酸、冰醋酸、無水醋酸鈉：均為分析純試劑；

液鈣肥：由北京雷力有限公司提供；1-MCP：由武漢遠(yuǎn)城發(fā)展有限公司提供；MAP采用聚乙烯（PE）材料：由新疆巨合科技有限責(zé)任公司提供。

1.1.3儀器設(shè)備

移液槍、Telaire 7001二氧化碳分析儀：北京寶云興業(yè)科貿(mào)有限公司；FK-A組織搗碎機(jī)：常州翔天實驗儀器廠；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇金偉實驗儀器廠；CP214電子天平（Max：210 g，d=0.000 1 g）：奧豪斯儀器（上海）有限公司；電子天平（Max：10 kg，e=5 d，d=1 g）、80-1電動離心機(jī)、FCD-270SC N海爾冰柜、DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；78HW-1磁力攪拌器：常州翔天實驗儀器廠；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1810型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；氣象色譜儀（主機(jī)：日本島津2014C；工作站：GCsolution）。

1.2試驗處理

1.2.11-MCP處理

采前噴鈣和對照果實采摘后立刻運(yùn)回實驗室，剔除病果和爛果，挑選成熟度一致、大小一致的果實，預(yù)冷24 h。將噴鈣和對照果實（各15 kg）放入由PE膜（厚0.1 mm）制成的1 m3密封帳中，將2片1-MCP片劑放入50 mL燒杯中，放入PE帳內(nèi)，加入50 mL無離子水，輕搖，迅速密封PE帳，其產(chǎn)生的1-MCP量為2.0 μL/L，在25℃條件下，熏蒸7 h～8 h后，揭開PE帳，通風(fēng)30 min。

表1　試驗處理Table 1Experimental treatment

1.2.2各處理接種庫爾勒香梨采后萼端黑斑病病原菌

首先將庫爾勒香梨萼端黑斑病病原菌制成孢子懸浮液（1×106個孢子/mL），從4個處理中選取相同量的果實，分別用75%酒精擦洗3遍，然后用滅菌鐵釘沿果實赤道線對稱位置刺2個直徑3 mm、深度4 mm的小孔，用移液槍吸取30 μL菌液打入傷口，使用透明膠帶將孔的四周全部密封，形成一個密閉的內(nèi)環(huán)境。置于常溫（25℃，70%～80%RH）避光環(huán)境下，12 h后，進(jìn)行各指標(biāo)初值的測定。

每隔4天，測定果肉細(xì)胞的病斑直徑、病斑深度、呼吸強(qiáng)度、乙烯、總酚含量、PAL活性、β-1，3葡聚糖酶活性。

1.3測定指標(biāo)及方法

1.3.1病斑直徑及深度

用直尺在病斑處進(jìn)行十字交叉法測量病斑直徑，再沿著接種處將果實橫向切開，用直尺測量病斑深度，每個處理重復(fù)3次，單位cm。

1.3.2呼吸強(qiáng)度

用Telaire 7001二氧化碳分析儀測定果實呼吸強(qiáng)度，每處理重復(fù)3次。

1.3.3乙烯

1.3.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取300 mL樣品瓶，倒置，將氮氣導(dǎo)管伸入瓶中充分通氣，將瓶中空氣排出。經(jīng)長時間排氣后，用橡膠塞密封瓶口。再往樣品瓶中注射一定量的標(biāo)準(zhǔn)乙烯，分別配制含量為0、5、10、15、20（μL/L）的乙烯氣體，充分搖動。然后用注射器從容器橡膠塞上取1.0 mL氣體，在氣相色譜儀上進(jìn)樣測定，確定乙烯出峰時間，以峰面積為橫坐標(biāo)、乙烯濃度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.2色譜條件

氫火焰離子檢測器：FID；色譜柱：GSBP-inowaxms彈性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm）；進(jìn)樣口溫度：100℃，檢測器溫度：120℃，柱溫：40℃，進(jìn)樣量：1 mL。分流比：30∶1；H2流速：50 kp（kp即皮托管系數(shù)）；氣流（Air）流速：50 kp；N2流速：50 kp。

1.3.3.3氣體收集與測定

將玻璃容器打開，倒扣放置，使容器中氣體與空氣平衡。然后放入1 kg左右果實，在室溫下密閉1 h。用注射器從容器橡膠塞取氣口中頂空取1.0 mL氣體，在氣相色譜儀上測定。經(jīng)色譜儀檢測后得到色譜圖，加載標(biāo)準(zhǔn)曲線后（面積外標(biāo)法），經(jīng)過微機(jī)處理，即可得到進(jìn)樣氣體乙烯濃度（ppm；μL/L）。

式中：C為氣相色譜測定的樣品氣體中乙烯含量，μL/L；V為玻璃容器密閉空間的容積，mL；t為測定時間，h；W為果實重量，kg。

1.3.4總酚［4］

1.3.4.1酚類物質(zhì)的提取

取10個梨果實，在果實的相同部位取組織塊2.5g，共25 g，加入50 mL無水乙醇，加入25 mL 10%三氯乙酸，高速離心機(jī)10 000 r/min勻漿2 min，然后用10%三氯乙酸定容到100 mL，靜置24 h，8 000 r/min離心15 min，沉淀用1 mol/LNaOH洗滌3次，收集上清液混勻，用鹽酸調(diào)整溶液的pH到8.0，供非水溶性酚類物質(zhì)測定。

1.3.4.2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

取6支試管，分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL（100μg/mL）標(biāo)準(zhǔn)沒食子酸溶液，加水至1mL。加入3mL 0.1 mol/L的Folin試劑后混勻，再加入1 mL堿試劑，充分混勻，50℃水浴保溫15 min，然后在650 nm波長處比色，以沒食子酸含量為橫坐標(biāo)，以光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.3樣品測定

取適當(dāng)稀釋的樣品液1 mL，加入3 mL Folin試劑和1 mL堿液，測定過程與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作相同。

1.3.5苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性［4］

1.3.5.1酶液制備

稱取5.0 g果實組織樣品，置于研缽中，加入5.0 mL提取緩沖液，在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入到離心管中，于4℃、8 000 r/min離心30 min，收集上清液，即為粗酶提取液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.2活性的測定

取兩支試管，分別加入3.0 mL 50 mmol/L pH 8.8硼酸緩沖液、0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸。向一支管中加入0.5 mL酶提取液，另一支管中加入0.5 mL經(jīng)煮沸5 min失活酶液作為對照。然后，將兩支反應(yīng)管置于37℃保溫60 min。保溫結(jié)束時立即向兩支反應(yīng)管中分別加入0.1 mL 6 mol/L鹽酸溶液終止反應(yīng)。以蒸餾水為參比空白調(diào)零，分別測定樣品反應(yīng)管和對照反應(yīng)管中溶液在波長290 nm處的吸光度值（ODS和ODC）。重復(fù)3次。以每小時每克鮮重（FW）組織反應(yīng)體系吸光度值增加0.01時為1個PAL活性單位（U），表示為0.01△OD290·h-1·g-1FW。

式中：ODS為樣品管反應(yīng)溶液的吸光度值；ODC為對照管反應(yīng)溶液的吸光度值；V為樣品提取液總體積，mL；VS為測定時所取樣品提取液體積，mL；t為酶促反應(yīng)時間，h；W為樣品重量，g。

1.3.6β-1，3葡聚糖酶（GLU）活性［4］

1.3.6.1酶液提取

稱取10.0 g果實組織樣品，置于研缽中，加入10 mL經(jīng)預(yù)冷的提取緩沖液，在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入到離心管中，于4℃、8 000 r/min離心30 min，收集上清液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6.2活性測定

取兩支反應(yīng)管，分別加入100 μL 0.4%的昆布多糖溶液。然后，向一支管中加入100 μL酶液，向另一支管中加入100 μL經(jīng)煮沸5 min的酶液作為對照，混勻。將反應(yīng)管置于37℃保溫40 min。保溫后向反應(yīng)管中加入1.8 mL蒸餾水和1.5 mL DNS試劑，在沸水浴中加熱3 min。再用蒸餾水將顯色的反應(yīng)液稀釋至25 mL，混勻。測定混合液在540 nm處的吸光度值。重復(fù)3次。

式中：C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的葡萄糖量，mg；V為樣品提取液總體積，mL；VS為測定時所取樣品提取液體積，mL；t為酶促反應(yīng)時間，s；W為樣品重量，g；180為葡萄糖相對分子質(zhì)量。

1.4數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2010軟件制作曲線圖。

2　結(jié)果與分析

2.1果實病斑直徑的變化

病斑直徑能夠從橫切面角度反映出病斑面積的大小，因而可作為判斷病害危害程度的重要指標(biāo)，見圖1。

圖1　接種后庫爾勒香梨病斑直徑的變化Fig.1Changes of lesion diameter of Korla fragrant pear after inoculation

各處理庫爾勒香梨果實接種萼端黑斑病病原菌后，各處理的病斑直徑都呈不斷上升的變化趨勢，按照大小順序排列依次為：處理2＞處理3＞處理4＞處理1，說明處理1，即采前采用0.014%液鈣噴施庫爾勒香梨樹體，能更好地抑制果實萼端黑斑病病原菌的橫向生長。

2.2果實病斑深度的變化

病斑深度能夠從縱切面角度反映出病斑侵入果實內(nèi)部的深度，因而可作為判斷病害危害程度的重要指標(biāo)，見圖2。

圖2　接種后庫爾勒香梨病斑深度的變化Fig.2Changes of lesion depth of Korla fragrant pear after inoculation

隨著時間的延長，各處理庫爾勒香梨果實接種萼端黑斑病病原菌后，各處理的病斑深度逐漸增加，按照大小順序排列依次為：處理3＞處理4＞處理1＞處理2，處理2即采前采用0.014%液鈣噴施庫爾勒香梨樹體，結(jié)合采后2.0 μL/L 1-MCP處理，能更好地抑制果實萼端黑斑病病原菌縱向生長。

2.3果實呼吸強(qiáng)度的變化

呼吸作用是果蔬采收后進(jìn)行的生理活動，呼吸強(qiáng)度可反映呼吸作用的強(qiáng)弱，果實感病后呼吸強(qiáng)度會顯著增加，見圖3。

圖3　接種后庫爾勒香梨呼吸強(qiáng)度的變化Fig.3Changes of respiration rate of Korla fragrant pear after inoculation

處理1、處理2和處理3果實的呼吸強(qiáng)度都在第5天達(dá)到呼吸高峰，分別為15.90、10.56、7.19 mg/（kg·h），按照呼吸強(qiáng)度的高低排列：處理1＞處理2＞處理4＞處理3。

2.4果實乙烯釋放量的變化

乙烯能促進(jìn)果實的后熟衰老過程。通過收集各處理果實釋放的乙烯樣品，利用氣相色譜法測定乙烯濃度，計算乙烯釋放量，見圖4。

圖4　接種后庫爾勒香梨乙烯釋放量的變化Fig.4Changes of ethylene production of Korla fragrant pear after inoculation

各處理果實乙烯的釋放量變化一致，都在第1天下降，3天后急劇上升，第5天達(dá)到峰值，之后又開始迅速下降。按照乙烯釋放量大小的順序排列：處理4＞處理1＞處理3＞處理2。

2.5果實PAL活性的變化

苯丙氨酸解氨酶（PAL）在植物生長發(fā)育和抵御病害方面起著重要的作用，見圖5。

圖5　接種后庫爾勒香梨PAL活性的變化Fig.5Changes of phenylalamine ammonia lyase activity of Korla fragrant pear after inoculation

處理1和處理3果實的PAL活性變化一致，初期都是先逐漸下降，分別在第9天和13天達(dá)到最低值，之后又迅速上升；和處理2和處理4相比，處理1和處理3果實的PAL活性較高，其中處理3能更好地推遲谷值的來臨，使PAL活性保持在較高的水平，因而抗病性也較強(qiáng)。

2.6果實GLU活性的變化

當(dāng)植物體被外界微生物侵染時，β-1，3葡聚糖酶活性會顯著提高，用來增強(qiáng)植物體的抗逆性，見圖6。

圖6　接種后庫爾勒香梨GLU活性的變化Fig.6Changes of β-1，3-glucanase activity of Korla fragrant pear after inoculation

整個貯藏期內(nèi)，除處理3外，其它處理果實的β-1，3葡聚糖酶活性均呈現(xiàn)峰值的變化，并且都是在第9天達(dá)到高峰，按照活性高低的順序排列：處理4＞處理1＞處理3＞處理2，該順序與乙烯釋放量的一致，說明處理4果實對病害的抵抗能力較強(qiáng)。

2.7果實總酚含量的變化

植物多酚是植物體內(nèi)重要的次生代謝物質(zhì)。極端環(huán)境下，植物通過形態(tài)變化和次生代謝物質(zhì)等來抵御極端環(huán)境脅迫，見圖7。

圖7　接種后庫爾勒香梨總酚含量的變化Fig.7Changes of phenolic content of Korla fragrant pear after inoculation

各處理果實的總酚含量均呈現(xiàn)峰值的變化。處理2果實中的總酚含量是在第13天達(dá)到高峰，其它處理都在第9天達(dá)到高峰?？偡雍康母叩团判颍禾幚?＞處理3＞處理1＞處理4，說明采前噴施0.014%液鈣結(jié)合采后2.0 μL/L 1-MCP處理，能更好地提高次生代謝物質(zhì)-酚類物質(zhì)含量，使果實能夠增強(qiáng)抵御病害的能力。

3　討論

采前噴施0.014%液鈣能夠抑制果實萼端黑斑病病原菌的橫向生長；采前噴施0.014%液鈣，結(jié)合采后2.0 μL/L 1-MCP處理可抑制病原菌縱向生長及果實乙烯的釋放，提高貯藏后期果實的總酚含量；采后2.0μL/L 1-MCP處理能更好地抑制果實的呼吸強(qiáng)度，提高果實的PAL活性；而處理4（CK）果實中的β-1，3葡聚糖酶活性最高，抵抗病害侵染的能力較強(qiáng)。1-MCP處理能明顯抑制果實的呼吸作用，這與‘綠寶石’梨［5］、黃金梨［6］上的研究結(jié)果一致。1-MCP處理能明顯降低果實的呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量以及果皮和果肉組織的總酚含量，與1-MCP在酥梨［7］、黃金梨［6］、秀豐梨［8］、鴨梨［9］上的結(jié)論不完全一致。與吳愛現(xiàn)等［10］的1%和3%的浸鈣處理，均可降低豐水梨果實貯藏期間呼吸強(qiáng)度研究結(jié)果不一致。

4　小結(jié)

1）采前噴施0.014%液鈣能夠抑制庫爾勒香梨果實萼端黑斑病病原菌的橫向生長；

2）處理3（采前0.014%鈣+采后2.0 μL/L 1-MCP）可以提高果實中的總酚含量，抑制縱向生長和果實乙烯的釋放，延緩果實衰老；

3）采后2.0 μL/L 1-MCP處理可抑制果實呼吸強(qiáng)度，提高果實的PAL活性；

4）處理4（CK）能使果實保持較高的β-1，3葡聚糖酶活性。

［1］賈曉輝，王文輝，李世強(qiáng)，等.庫爾勒香梨萼端黑斑病發(fā)生的原因［J］.果樹學(xué)報，2010，27（4）：556-560

［2］陳婷，黃新忠，劉鑫銘，等.鈣處理對黃花梨主要貯藏品質(zhì)指標(biāo)的影響［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，27（7）：728-733

［3］王文生，陳存坤，馮炯琦，等.氣調(diào)貯藏對新疆厚皮甜瓜采后生理及貯藏效果的影響［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2008（4）：67-69

［4］曹建康，姜微波，趙玉梅.果蔬采后生理生化實驗指導(dǎo)［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2007：101-102

［5］孟坤，董宇，劉立芹，等.1-MCP對‘綠寶石’梨采后成熟衰老期間H2O2含量及其相關(guān)酶活性的影響［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，34（5）：27-31

［6］王文輝，王志華，佟偉，等.1-MCP處理對黃金梨采后生理及保鮮效果的影響［J］.保鮮與加工，2009（1）：30-34

［7］王寶亮，王文輝，姜云斌，等.1-MCP處理對不同產(chǎn)地酥梨低溫貯后貨架期防褐保鮮效應(yīng)的研究［J］.保鮮與加工，2014，14（5）：24-30

［8］王淑貞，楊雪梅，張元湖，等.1-MCP處理對梨貯藏品質(zhì)及抗氧化活性的影響［J］.中國食物與營養(yǎng)，2011，17（9）：47-50

［9］朱文嬙，張秀玲，王娟，等.1-MCP處理對鴨梨常溫貯藏品質(zhì)及生理指標(biāo)的影響［J］.食品工業(yè)科技，2014（2）：296-299

［10］吳愛現(xiàn)，周莎莎，張晶，等.不同濃度鈣處理對豐水梨保鮮效果的影響［J］.北方園藝，2010（1）：193-195

Study on the Occurrence Regularity of Calyx End Black Spot and Physiological Changes in Korla Fragrant Pear

WU Yu-peng1，ZHAO Xiao-mei2，*
（1.Xinjiang Vocational College of Agriculture，Changji 831100，Xinjiang，China；2.Research Institute of Bioenergy，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，Xinjiang，China）

In order to improve the disease resistance to calyx end black spot of Korla fragrant pear，the test used 0.014%Ca，2.0 μL/L 1-MCP and Ca 0.014%combined with 2.0 μL/L 1-MCP to deal with Korla fragrant pear for improving the disease resistance.It studied the onset of disease spot under the condition of normal temperature and the change of physiological activity when accessed the calyx end black rot pathogen again.The test results showed that spraying 0.014%calcium preharvest could inhibit the Korla fragrant pear fruit calyx end black rot pathogen lateral growth；2.0 μL/L 1-MCP postharvest treatment inhibited the fruit respiration intensity and improved the PAL activity of the fruit；（Spraying 0.014%calcium preharvest+2.0 μL/L 1-MCP postharvest treatment），could improve the total phenol content in fruit and inhibited the growth of longitudinal and ethylene release，fruit senescence；Contrast could make the fruit to keep high beta 1，3 glucanase activity.

Korla fragrant pear；calyx end black spot；occurrence regularity；physiological changes

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.043

2015-10-18

自治區(qū)財政林業(yè)科技專項資金項目“采前噴鈣對庫爾勒香梨黑心病控制技術(shù)的推廣與示范”

吳玉鵬（1979—），男（漢），講師，碩士，主要從事果樹、蔬菜栽培方面的研究。

趙曉梅（1980—），女，副研究員，博士，主要從事果樹學(xué)方面的研究。