朱芳，鄭奎玲，韋萬麗，廖莉玲，*，王正武

（1.貴州師范大學化學與材料科學學院，貴州貴陽550001；2.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海200240）

明日葉總黃酮的純化工藝研究

朱芳1，鄭奎玲1，韋萬麗1，廖莉玲1，*，王正武2

（1.貴州師范大學化學與材料科學學院，貴州貴陽550001；2.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海200240）

采用靜態(tài)-動態(tài)吸附與解析相結合的方法，從12種樹脂中篩選出純化明日葉總黃酮最佳的樹脂并對其純化工藝條件進行探討。結果表明：HPD-600大孔樹脂對明日葉總黃酮有較好的吸附、解析效果。最佳純化條件為：上柱液中總黃酮質(zhì)量濃度控制在2 mg/mL～3 mg/mL之間，以3 BV/h的流速過柱，樹脂達吸附飽和的上樣量為2.7 BV；洗脫條件為：用蒸餾水沖洗至無色后，改用4 BV，50%乙醇以2 BV/h流速進行洗脫。經(jīng)HPD-600樹脂純化后，明日葉總黃酮的純度由14.46%提升至46.96%，提升近3.2倍。

明日葉；總黃酮；純化；大孔樹脂

明日葉又名長壽菜，屬原生芹科多年生草本植物，原產(chǎn)于日本八丈島［1］。它是一種藥食兼用的植物，在臨床上常用來治療泌尿和便秘［2］。研究表明，明日葉富含查爾酮、類黃酮、香豆素、有機鍺、維生素B12等多種有效成分［3］。查爾酮具有抗癌、抗糖尿病、降血脂、抗血管疾病等功效，類黃酮具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤活性的功效［4］，因此研究明日葉中總黃酮的分離、純化有重要意義。

迄今為止，對明日葉的提取已有較多的研究報道［5-7］，但明日葉總黃酮的純化研究卻鮮見報道。大孔樹脂在天然產(chǎn)物活性成分的分離方面因具有操作簡便、價格低廉、易吸附、解析、再生效果好等優(yōu)點而備受青睞［8］，為了尋求更適合純化明日葉總黃酮的樹脂，本文采用靜態(tài)-動態(tài)吸附與解析相結合的方法，從12種樹脂中篩選出純化明日葉總黃酮的最佳樹脂，并對該樹脂純化明日葉黃酮的條件進行研究，為明日葉的開發(fā)和應用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

蘆丁：貴州迪大科技有限責任公司；明日葉：貴州健康茶科技有限公司；D301、NKA-9、S-8、ADS-7、HP-20、X-5、HPD-600、HPD-826、聚酰胺（60目～100目）、聚酰胺（30目～60目）：滄材料州寶恩吸附材料有限公司；FL-1、FL-2：天津歐瑞生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

L5s分光光度計：上海儀電；RE-52型旋轉蒸發(fā)器：上?？茖С晝x器有限公司；A200S型電子天平：sartorius公司。

1.2方法

1.2.1標準曲線的確定

采用NaNO2-Al（NO3）3比色法測定［10］，以蘆丁為標準品，在200 nm～700 nm波長范圍掃描，確定其最大吸收波長為513 nm。在513 nm處測定標準系列的吸光度，以吸光度對濃度作圖。得回歸方程為：Y=11.223X-0.000 7，R2=0.999 6。

1.2.2明日葉粗提取液的制備

按照文獻［6］將明日葉粉末與30%的乙醇按1∶15（g/mL）的料液比在超聲波條件下，提取兩次，每次40 min，提取溫度50℃。合并兩次提取液，抽濾，旋蒸至無乙醇味備用。

1.2.3樹脂的預處理

先用蒸餾水把樹脂充分泡漲后，加無水乙醇浸泡24 h，然后用蒸餾水沖洗至無乙醇味；改用3%HCl溶液浸泡5 h之后用蒸餾水沖至中性；再用3%NaOH溶液浸泡5 h后用蒸餾水沖洗至中性，處理好的樹脂用蒸餾水浸泡待用。

1.2.4大孔樹脂篩選

1.2.4.1靜態(tài)吸附-解析試驗

準確稱量2g處理好的樹脂放于250mL錐形瓶中，加入50mL明日葉提取液（總黃酮濃度為1.145mg/mL），放入恒溫水浴振蕩器上振蕩12 h，使其達到飽和吸附，取上清液，按1.2.1方法顯色測其吸光度，計算各樹脂的吸附率。分離吸附飽和的樹脂，用蒸餾水洗滌，再加入95%的乙醇50 mL解吸，同樣條件下置于恒溫振蕩器上振蕩12 h，測其上清液中黃酮的濃度，計算各樹脂的解吸率。以吸附量、吸附率和解吸率為指標，考察各樹脂的性能，選出適宜的樹脂進行動態(tài)吸附。

式中：C0為黃酮類化合物起始濃度，mg/mL；C1為吸附平衡后黃酮類化合物的濃度，mg/mL；C2為解析液中黃酮類化合物的濃度，mg/mL；V1為吸附原液體積，mL；V2為解吸液體積，mL；W為樹脂質(zhì)量，g。

1.2.4.2動態(tài)吸附-解析試驗

通過靜態(tài)吸附試驗挑選出4種性能較好的樹脂，進一步比較樹脂的動態(tài)吸附和解吸性能。采用濕法裝柱，分別將處理好的FL-1、HP-20、HPD-600、X-5 4種樹脂裝入（1.5 cm×40 cm）玻璃層析柱中，裝柱體積為30 mL。各取200 mL（總黃酮濃度為1.81 mg/mL）明日葉提取液上柱，流速控制在2 BV/h，過柱液每10 mL收集1管，測其黃酮濃度。以總黃酮濃度對累積體積數(shù)作圖，制作不同樹脂的泄露曲線。用蒸餾水沖洗柱子至流出液無色，分別用100mL0%、10%、30%、50%、70%、90%的乙醇梯度洗脫，每25 mL收集1管測黃酮濃度，制作洗脫曲線。

1.2.5HPD-600純化黃酮的單因素試驗

1.2.5.1上樣濃度對動態(tài)吸附的影響

將處理好的樹脂裝入層析柱中，裝柱體積為30mL，取質(zhì)量濃度分別為1.00、2.09、3.03、4.08、5.19 mg/mL的提取液各200 mL過柱，流速為2 BV/h，收集過柱液，測其吸光度，計算出不同濃度下樹脂的吸附率。以吸附率對濃度作圖，選出最佳上樣濃度。

1.2.5.2上樣流速對動態(tài)吸附的影響

濕法裝柱，裝柱30 mL，各取150 mL提取液（黃酮濃度為2.77 mg/mL）以2、3、4 BV/h的流速過柱，10 mL收集1管，以流出液黃酮濃度對上樣體積作圖得到不同的泄露曲線。

1.2.5.3洗脫量對動態(tài)吸附的影響

裝柱30 mL，取80 mL上樣液（黃酮濃度為2.462 mg/mL），以3 BV/h的流速過柱，收集過柱液，測其吸光度計算樹脂吸附量。用蒸餾水沖至流出液無色，改用50%乙醇洗脫，洗脫流速控制在2 BV/h，每15 mL收集1管洗脫液，測其吸光度計算每管黃酮的含量，以總黃酮的含量對累積50%乙醇洗脫液體積作圖，繪制洗脫曲線。確定最佳洗脫量。

2　結果與分析

2.1大孔樹脂對總黃酮的靜態(tài)吸附與解吸

不同樹脂對明日葉總黃酮靜態(tài)吸附、解析結果如表1所示。

表1　不同樹脂對明日葉總黃酮靜態(tài)吸附、解析結果Table 1The result of static adsorption and desorption on different types of macroporous resin

續(xù)表1不同樹脂對明日葉總黃酮靜態(tài)吸附、解析結果Continue table 1The result of static adsorption and desorption on different types of macroporous resin

由表1可以看出D301、NKA-9、S-8、ADS-7幾種樹脂的吸附率較高，但解析效果差。FL-2樹脂容易解析，但吸附的少。綜合考慮選擇吸附率和解析率都較好的4種樹脂F(xiàn)L-1、HP-20、HPD-600、X-5繼續(xù)做動態(tài)試驗考察。

2.2動態(tài)吸附試驗篩選結果

2.2.14種樹脂的動態(tài)泄露曲線

以柱流液黃酮濃度達上樣液黃酮濃度的10%作為樹脂吸附飽和點，作樹脂的動態(tài)泄露曲線，如圖1所示。

圖1　樹脂的動態(tài)泄露曲線Fig.1Dynamic leak curve of resin

由圖1可以看出，在相同濃度（1.81 mg/mL）下，不同的樹脂對明日葉總黃酮的吸附量不同，F(xiàn)L-1和HP-20兩種樹脂均在3.3 BV（100 mL）達吸附飽和，X-5樹脂泄露較快，在2 BV（60 mL）達到吸附飽和，吸附量較少不予考慮。HPD-600在4.3 BV（130 mL）達吸附飽和，吸附量最大，所以對明日葉總黃酮純化最佳樹脂是HPD-600。

2.2.2洗脫曲線

樹脂的洗脫曲線如圖2所示。

圖2　洗脫曲線Fig.2The eluting curve

由圖2可見，3種樹脂的洗脫曲線大體一致，總黃酮主要在30%和50%乙醇洗脫部分，可以看出30%乙醇洗脫不完全，所以選用50%的乙醇洗脫。經(jīng)計算FL-1的總解析率為75.51%，HP-20的總解析率為77.37%，HPD-600的總解析率為82.94%，結合動態(tài)穿透曲線和洗脫曲線，HPD-600不僅吸附量大，洗脫率也比其他兩種高，所以選HPD-600純化明日葉總黃酮。

2.3HPD-600動態(tài)吸附單因素試驗結果

2.3.1上樣濃度對樹脂吸附率的影響

上樣濃度對總黃酮吸附率的影響如圖3所示。

圖3　上樣濃度對總黃酮吸附率的影響Fig.3The effect of initial concentration on kinetic absorption capacity

由圖3可見，上樣濃度對樹脂的吸附有明顯的影響，隨著上樣濃度的增加，樹脂對黃酮的吸附能力降低。上樣濃度在1.00 mg/mL時吸附率最高，達86.75%，但濃度過低，增加上柱時間；濃度超過3.03 mg/mL時，吸附率明顯下降。綜合考慮，最佳上樣濃度應控制在2 mg/mL～3 mg/mL之間。

2.3.2上樣流速對吸附率的影響

上樣流速對總黃酮吸附率的影響如圖4所示。

由圖4可見，以相同的濃度（2.77 mg/mL）上柱，流速為2、3 BV/h時，相同體積的流液中黃酮濃度相差不大，到2.7 BV（80 mL）時，樹脂達吸附飽和。當流速為4 BV/h時，流出液中黃酮濃度明顯高出2、3 BV/h流速，吸附量減少，而流速過慢，生產(chǎn)時間延長。綜合考慮吸附量及生產(chǎn)時間，以3 BV/h為佳。

圖4　上樣流速對總黃酮吸附率的影響Fig.4Effect of sample flowing rate on the adsorption capacity

2.3.3洗脫劑用量試驗的影響

洗脫劑用量曲線圖如圖5所示。

圖5　洗脫劑用量曲線圖Fig.5Determination of optimum elution volume

由圖5可看出當洗脫量為3 BV（90 mL）時，洗脫液中黃酮含量很少，為了保證充分洗脫，洗脫量以4 BV（120 mL）為宜，此時洗脫率達87.12%。

2.4驗證試驗

取80 mL 2.453 mg/mL的明日葉提取液，以3 BV/h過柱，用蒸餾水沖洗柱子至流出液為無色，改用120 mL 50%的乙醇溶液洗脫，洗脫流速控制在2 BV/h收集洗脫液測其吸光度，測定洗脫液濃度為1.095 mg/mL，總黃酮量為131.4 mg?；厥章蔬_67%。將洗脫液旋干成粉末準確稱取40.4 mg溶于25 mL容量瓶中，測黃酮含量，計算得樣品中黃酮的純度為46.96%，比郭曉青［9］等報道的純化后明日葉黃酮純度29.2%高出17.76%。將濃度為2.453 mg/mL的提取液旋干成粉末，準確稱取42.1 mg溶于25 mL容量瓶中，測黃酮含量，計算其純度為14.56%。經(jīng)大孔樹脂HPD-600純化后，明日葉中總黃酮純度提升近3.2倍。

3　結論

1）12種樹脂的靜態(tài)吸附-解析試驗表明FL-1、HP-20、HPD-600、X-5 4種樹脂的吸附解析效果都比較好。

2）通過動態(tài)吸附-解析試驗以樹脂最大吸附量以及解析率為指標篩選出最佳樹脂為HPD-600。

3）HPD-600樹脂純化明日葉黃酮最佳的工藝條件為上樣濃度在2 mg/mL～3 mg/mL，上樣流速控制在3 BV/h，上樣量2.7 BV，用蒸餾水沖至無色后，改用4 BV 50%乙醇進行洗脫。在最佳純化工藝條件下，明日葉總黃酮的純度由14.46%提升至46.96%，提升近3.2倍。

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Studies on Purification of Flavonoids from Angelica Keiskei

ZHU Fang1，ZHENG Kui-ling1，WEI Wan-li1，LIAO Li-ling1，*，WANG Zheng-wu2
（1.School of Chemistry and Materials Science，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，Guizhou，China；2.School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China）

In this paper，12 types of macroporous resins were tested by Static and dynamic adsorption and desorption experiments for purifying flavonoids from Angelica keiskei，and purifying conditions by the best resin were investigated.The results showed that：HPD-600 was the best resin；adsorption conditions were as follows：3 BV/h adsorption velocity，concentration of sample 2 mg/mL-3 mg/mL，2.7 times volume of resin as sample volume；desorption conditions were as follows：rinsing the resins with deionized water until the effluent was colorless and then eluting under 2 BV/h adsorption velocity，using 50%ethanol，4 times volume of resin as eluent. the purity of flavonoids purified with HPD-600 macroporous resin was improved from 14.46%to 46.96%，which was approximately 3.2 times higher than the original sample.

angelica keiskei；flavonoids；purification；macroporous resin

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.019

2015-10-14

貴州省科學技術廳中藥現(xiàn)代化攻關項目（黔科合ZY字［2012］3012號）；貴陽市科技局現(xiàn)代藥業(yè)計劃項目（筑科合同［2012204］號）

朱芳（1989—），女（漢），碩士，研究方向：分析化學。

廖莉玲，教授，碩士。