廖楠，張金蓮，汪茜，譚裕模，龍艷艷，李冬萍，陸祖軍，陳廷速*

甘蔗根系內(nèi)生真菌

廖楠1，3，張金蓮1，汪茜1，譚裕模2，龍艷艷1，李冬萍1，陸祖軍3，陳廷速1*

（1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，南寧530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，南寧530007；3.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，桂林541004）

在酸性赤紅壤條件下，通過(guò)對(duì)大田甘蔗施用不同的化肥量和接種AM菌劑的試驗(yàn)，分析不同施肥水平對(duì)甘蔗根系內(nèi)生真菌的影響。結(jié)果表明：甘蔗根系內(nèi)同時(shí)存在兩種內(nèi)生真菌，即叢枝菌根（AM）真菌和深色有隔內(nèi)生真菌（DSE）。通過(guò)對(duì)甘蔗根系進(jìn)行染色觀察后發(fā)現(xiàn)，凡是施復(fù)合肥的處理，在甘蔗根系中除了存在叢枝菌根（AM）真菌，還檢測(cè)到較多的深色有隔內(nèi)生真菌（DSE）的菌絲和微菌核。大田甘蔗施用AM菌劑影響土著AM真菌種群。

甘蔗根系；內(nèi)生真菌；叢枝菌根真菌；深色有隔內(nèi)生真菌

我國(guó)甘蔗種植區(qū)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期濫用化肥、農(nóng)藥和除草劑，土壤退化非常嚴(yán)重。許多蔗區(qū)土壤貧瘠，種植條件惡化[1]。蔗田土壤養(yǎng)分嚴(yán)重失衡，已無(wú)法通過(guò)增加施肥來(lái)提高產(chǎn)量，成為制約目前甘蔗產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要因素。叢枝菌根（arbuscularmycorrhizal，AM）是自然界中最普遍的一種菌根類(lèi)型，它們能夠促進(jìn)宿主植物對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收和利用，增強(qiáng)抗逆性，提高作物產(chǎn)量。甘蔗根際土壤AM真菌資源豐富[2]，AM真菌被譽(yù)為“生物化肥”，它不僅能提高土壤pH值，而且增加甘蔗的株高和有效莖數(shù)，提高甘蔗產(chǎn)量[3]。深色有隔內(nèi)生真菌（dark septate endophytes，DSE）也是一類(lèi)定殖于植物根內(nèi)的小型土壤真菌，生態(tài)學(xué)功能與AM真菌類(lèi)似，在植物的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。因此，研究甘蔗根系內(nèi)生真菌，利用它們來(lái)改善甘蔗土壤生態(tài)，提高甘蔗抗逆性和化肥利用率具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試甘蔗品種:新臺(tái)糖22號(hào)。所用的叢枝菌根真菌菌株為Rhizophagus aggregatus（原聚叢球囊霉），為本課題組分離自甘蔗根際土壤。采用河沙為主要培養(yǎng)基質(zhì)，以玉米為宿主植物，接種R.aggregatus，生長(zhǎng)期間每周?chē)娏軡舛葹?5%～50%的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)4個(gè)月后，將孢子、宿主根系和培養(yǎng)基質(zhì)一起作為接種物（AM菌劑）。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2013—2014連續(xù)兩年分別在廣西隆安縣的國(guó)家甘蔗產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系甘蔗試驗(yàn)基地實(shí)施。共設(shè)6個(gè)處理：A.AM；B.AM+50%復(fù)合肥（375 kg/hm2，下同）；C.AM+復(fù)合肥（750 kg/hm2，下同）；D.空白對(duì)照；E.50%復(fù)合肥；F.復(fù)合肥。施用AM菌劑（3個(gè)處理）與不施AM菌劑（3個(gè)處理）之間，設(shè)立隔離區(qū)30m。每個(gè)處理3個(gè)小區(qū)，采用拉丁方設(shè)計(jì)。每個(gè)小區(qū)面積7m×5.5m。其中行距1.1m，共5行。每行7m，下種量50個(gè)雙芽苗，共100個(gè)芽。復(fù)合肥比例為N∶P∶K=15∶5∶15（拉多美復(fù)混肥料，廣東拉多美化肥有限公司）。

1.3檢測(cè)

1.3.1內(nèi)生真菌侵染檢測(cè)將甘蔗根樣置于20%的KOH溶液中90℃水浴透明90 min～120 min；用清水沖洗3～5次后，加入堿性H2O2（10%H2O210mL，氨水1 mL，蒸餾水189 mL）脫色60 min；用5%的乙酸酸化5 min后，用5%的墨水醋染液（Quink牌純黑墨水）為染液，66℃染色30 min，用清水（至少12 h以上）脫色后即可鏡檢。

1.3.2甘蔗根際土壤AM真菌孢子的檢測(cè)孢子的分離采用濕篩傾注-蔗糖離心法，稱(chēng)取20g土樣放入攪拌機(jī)內(nèi)并加入600mL水，快速攪拌旋轉(zhuǎn)3～5s，使土塊或根系中的孢子充分散落，靜置1～2s后通過(guò)3層不同孔徑（從上往下孔徑依次為：0.8mm，0.25mm，0.055mm）的土壤標(biāo)準(zhǔn)篩即可篩取出孢子，轉(zhuǎn)置表面皿上，用體視顯微鏡觀察孢子形態(tài)，測(cè)定孢子密度。每個(gè)處理重復(fù)3次。

2　結(jié)果與分析

2.1甘蔗根系內(nèi)生真菌

不同處理的甘蔗根系侵染結(jié)果如圖1。在甘蔗根系中，除了叢枝菌根真菌，還存在深色有隔真菌（DSE）。DSE的主要特點(diǎn)是菌絲為有隔菌絲，存在微菌核結(jié)構(gòu)。在6個(gè)不同的處理中，處理B和C的小區(qū)AM真菌的菌絲和泡囊結(jié)構(gòu)較為豐富。此外，在施用復(fù)合肥的小區(qū)（B，C，E，F(xiàn)）中，DSE的微菌核結(jié)構(gòu)出現(xiàn)頻率較高。AM真菌和DSE可同時(shí)存在同一甘蔗根系中，它們之間是否存在相關(guān)性（是協(xié)同還是拮抗）？有待進(jìn)一步研究。

圖1　不同施肥水平甘蔗根系內(nèi)生真菌（AM真菌及DSE真菌）Fig.1 The endophytic(AMF and DSE)in roo ts of sugarcane w ith diffe rent treatm ents

2.2甘蔗根際土壤AM真菌種群結(jié)構(gòu)

對(duì)不同處理的甘蔗根際土壤進(jìn)行AM真菌種群分析。所進(jìn)行試驗(yàn)的地塊存在5種不同類(lèi)型的AM真菌（包括接種的AM菌株）：R.Aggregatus、Acaulospora.sp.1、蜜色無(wú)梗囊霉（A.mellea）、地表球囊霉（G. versiforme）和G.sp.5。A、B、C均施用了AM菌劑，土壤中檢測(cè)不到G.sp.5，但存在A.sp.1和G.versiforme。此外，在施復(fù)合肥的處理中，不管是否施用AM菌劑，都沒(méi)有檢測(cè)到A.mellea。說(shuō)明大田甘蔗施用AM菌劑和化肥，影響了甘蔗根際土壤AM種群結(jié)構(gòu)。不同菌株的形態(tài)特征如下：

2.2.1A.sp.1的形態(tài)特征孢子果未知，孢子椒紅至棕紅色，近球形或橢圓形，50.57～109.00×66.28～147 μm，表面常有無(wú)色或淺黃色覆蓋物。孢子壁一層，層狀，外層顏色深，內(nèi)層棕黃色，壁上常有不規(guī)則淺溝和近圓形坑洞，坑洞縱向貫串孢子壁，而淺溝僅在外表面。

2.2.2蜜色無(wú)梗囊霉（A.mellea）的形態(tài)特征孢子：土壤中單生，側(cè)生于產(chǎn)孢子囊菌絲上，淺棕黃色至棕黃色，球形或近球形，有時(shí)橢圓形，直徑105～130×142～162μm。孢子壁3層（L1、L2和L3）：L1，易逝壁，無(wú)色，厚＜0.5μm，緊貼于L2，在Melzer’s試劑中呈淺黃色；L2，層狀壁，淺黃色至棕黃色，厚3.0～4.8μm，L1消解后表面光滑；L3，膜狀，無(wú)色，厚小于1μm。芽壁兩層（GW1，GW2）：GW 1，膜狀，無(wú)色，兩層（GWl-L1和GWl-L2），厚約1μm，孢子破裂后易皺。GW 2，兩層（GW 2-L1和GW 2-L2），GW 2-L1，厚約1μm，表面有珠狀紋飾，在Melzer’s試劑中呈淺黃色，GW2-L2，具可塑性，在Melzer’s中染成絳紫色。脫落痕，圓形至橢圓形，直徑8～11μm。

2.2.3聚叢球囊霉（R.Aggregatus）的形態(tài)特征孢子：淺灰色、淺黃色至淺棕色，在土壤中叢生或單生，球形或近球形，（30～45）～70μm，或橢圓至不規(guī)則形（30～72）×（42～100）μm。孢子壁：一層或兩層，（1.5）～（2.5～3）μm；如果兩層，外層較厚，淺黃色，層狀壁；內(nèi)壁比外壁薄，亮黃色，輕壓則內(nèi)外壁可分。連孢菌絲在連點(diǎn)處寬2.5～9μm，連點(diǎn)開(kāi)放或由細(xì)隔封閉，直立或在接近連點(diǎn)處突然彎曲。內(nèi)含物油滴狀，白色或淡銀灰色。

2.2.4地表球囊霉（G.versiforme）的形態(tài)特征孢子：土壤中單生，孢子果未知，孢子球形或近球形，黃至黃棕色，顯微鏡下沿孢壁有一圈深色，大小82～136μm。孢壁3層，L1無(wú)色透明易逝壁，約1μm，成熟時(shí)常脫落或只剩部分殘屑；L2淺黃至黃棕色層狀壁，厚2～4μm，厚度較均勻；L3單一壁，約1μm，不易與L2分離，亮金黃色。連孢菌絲：無(wú)色透明，寬4.3～6.8μm，成熟孢子中常萎縮或脫落。連點(diǎn)寬7.6～12.0μm，直或小喇叭形，開(kāi)放或由一內(nèi)壁形成的隔封閉。內(nèi)含物油滴狀。

2.2.5G.sp.5的形態(tài)特征孢子果未知，孢子深棕紅色，近球形，直徑約110μm。孢子壁一層，層狀，厚7.8～8.0μm，至連點(diǎn)處增厚至9.45μm，壁上有縱向裂紋，外層顏色較深，暗棕紅色；內(nèi)層棕黃色，表面飾有高4.42～6.09μm、基部直徑2.54～4.37μm乳狀突起。連點(diǎn)開(kāi)放，寬19.10μm。

3　討論

AM真菌是自然界分布最為廣泛的一種植物根系內(nèi)生菌根真菌，能與絕大多數(shù)植物根系形成穩(wěn)定的共生結(jié)構(gòu)。深色有隔內(nèi)生真菌（DSE）也是一類(lèi)定殖于植物根系的小型真菌，其一般特征是菌絲顏色較深、具明顯橫隔，廣泛存在于健康植物根的表皮、皮層甚至維管束組織的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙，能夠在植物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙形成“微菌核（microsclerotia）”。普遍存在于重金屬污染、寒冷或干旱等極端環(huán)境中[4]。本研究還發(fā)現(xiàn)，施復(fù)合肥處理的甘蔗根系能被DSE高度侵染，并能形成有隔菌絲、微菌核。這可能與所種植的地塊土壤理化性質(zhì)相關(guān)。所種植的地塊為強(qiáng)酸性赤紅壤，其pH僅為4.02。種植后期，僅施有AM菌劑的處理A的pH為5.03，而空白對(duì)照（D）的pH為4.49。施有AM菌劑且施復(fù)合肥的B和C，其pH分別為4.43和4.33，而僅僅施復(fù)合肥的E和F，其pH分別為4.06和4.22。在甘蔗根系的內(nèi)生真菌檢測(cè)中，在施用復(fù)合肥的小區(qū)（B、C、E，F(xiàn)）中，DSE的微菌核結(jié)構(gòu)出現(xiàn)頻率較高，也許與土壤pH過(guò)低相關(guān)。

關(guān)于DSE與AM真菌的相關(guān)性。有的研究認(rèn)為AM定殖結(jié)構(gòu)和DSE存在負(fù)相關(guān)[5]，也有研究認(rèn)為DSE有隔菌絲和總定殖率與AM定殖率存在顯著正相關(guān)，DSE和AM真菌之間可能存在協(xié)同共棲關(guān)系，兩者相互協(xié)調(diào)平衡，相輔相成，共同促進(jìn)根系吸收土壤礦物元素和水分[6]。有的研究認(rèn)為DSE的分泌物對(duì)AM菌絲的生長(zhǎng)具有一定的調(diào)節(jié)輔助作用[7]。在本研究中，雖然在施用復(fù)合肥的處理（B、C、E、F）中，DSE的微菌核結(jié)構(gòu)出現(xiàn)頻率較高，但E和F的微菌核結(jié)構(gòu)要多于施用AM菌劑的處理B和C。施用AM菌劑的處理（A、B、C），其根系內(nèi)AM泡囊、菌絲和菌絲圈多于對(duì)照（D、E、F）。但具體如何影響，有待進(jìn)一步探討。

甘蔗是旱地連作作物，利用根系內(nèi)生真菌來(lái)改善退化的土壤生態(tài)，減少化肥用量都具有很好的應(yīng)用前景。近年來(lái)，我們所開(kāi)展的AM菌劑在大田甘蔗的應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果表明，在施用AM菌劑后，能促進(jìn)甘蔗植株生長(zhǎng)，增加有效莖數(shù)，提高甘蔗產(chǎn)量。在一些試驗(yàn)地塊，即使復(fù)合肥減少50%，產(chǎn)量并沒(méi)有受到影響[3，8-9]。我們國(guó)家農(nóng)業(yè)土壤退化嚴(yán)重，國(guó)家農(nóng)業(yè)部提出了下一個(gè)五年計(jì)劃的化肥零增長(zhǎng)，提高化肥利用率40%以上的目標(biāo)。利用作物根系內(nèi)生真菌是很好的選擇。它們不僅能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高抗逆性，還能降低化肥的施用量，減少化肥對(duì)生態(tài)環(huán)境的污染，促進(jìn)我國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

[1]黃紹富，黃杰基.蔗區(qū)土壤肥力現(xiàn)狀與甘蔗測(cè)土配方施肥[J].廣西蔗糖，2006（4）：10-13.

[2]陳廷速，張金蓮，李松，等.廣西東南沿海蔗區(qū)根際土壤AM真菌多樣性研究[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012（1）：57-61.

[3]陳廷速，李松，王維贊，等.甘蔗大田接種AM菌劑效應(yīng)研究[J].甘蔗糖業(yè)，2013（3）：6-10.

[4]Derama A,Languereau-Lemanb F,Howsamc M,et al.Seasonal petterns of cadmium accumulation in Arrhenatherum elatius (poaceae):influence ofmycorrhizal and endophytic fungal colonization[J].Soil Biology&Biochemistry,2008,40(3):845-848.

[5]吳艷清，賀學(xué)禮，劉泗泗.荒漠環(huán)境檸條錦雞兒AM真菌空間分布[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31（4）：36-40.

[6]張娟，賀學(xué)禮，王曉乾，等.干旱環(huán)境下羊柴DSE與AM真菌和土壤因子關(guān)系研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，38（1）：72-77.

[7]Scervino JM,Gottlieb A,Silvani V A,et al.Exudates of dark septate endophytic modulate the development of the arbuscular mycorrhizal fungus Gigaspora rosea[J].Soil Biology&Biochemistry,2009,41:1753-1756.

[8]伍榮冬，譚彩麗，李廷化，等.大田接種叢枝菌根真菌對(duì)甘蔗品種“福農(nóng)41號(hào)”生長(zhǎng)的影響[J].甘蔗糖業(yè)，2015（4）：20-23.

[9]盧李威，盧文祥，汪茜，等.AM菌劑對(duì)甘蔗品種“柳城07-500”的大田生長(zhǎng)效應(yīng)分析[J].中國(guó)糖料，2016，38（2）：5-7.

The Endophytic Fungus in Sugarcane Root

LIAO Nan1,3,ZHANG Jin-lian1,WANG Qian1,TAN Yu-mo2,LONG Yan-yan1, LIDong-ping1,LU Zu-jun3,CHEN Ting-su1*
(1.Micobiology Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China;2.Resourses and Environment Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China;3.College of Life Science,GuangxiNormal University,Guilin 541004,China)

To investigate the influence of fertilizer on endophytic fungus of sugarcane root in acid red soil, sugarcane plants were grown on different level of fertilizer and inoculated with arbuscular mycorrhizal fungus (AMF).The results showed that there are two kinds of endophytic fungus in sugarcane root,the arbuscular mycorrhizal(AM)fungus and dark septate endophytes(DSE).Through the dyeing observation of the root sugarcane,more septate hypha and microsclerotia of DSE were found besides AM fungus in the soil applied complex fertilizer than the others.The communities of soil AMF were affected by AMF inoculants.

sugarcane root;endophytic fungus;arbuscularmycorrhizal fungus;dark septate endophytes

S435.661

A

1007－2624（2016）03－0006－04

10.13570/j.cnki.scc.2016.03.002

2015-10-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31360356）；國(guó)家甘蔗產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-20-3-5）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技項(xiàng)目（2014YP06，2015YT81，2015YZ10）。

廖楠（1991-），女，碩士研究生，研究方向：土壤AM真菌多樣性。E-mail：454749513@qq.com。

陳廷速（1966-），男，博士，研究員，研究方向：甘蔗根系內(nèi)生真菌資源。E-mail：chen20409@hotmail.com。