毛嬋娟 解洪杰 宋小玲 強(qiáng)勝

摘要：麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬都對草甘膦具有較高的天然耐藥性，其耐藥性的主要機(jī)制是由于EPSPS基因結(jié)構(gòu)差異、基因多拷貝以及高表達(dá)量，但是，靶標(biāo)機(jī)制并不能完全解釋闊葉土麥冬的耐藥性最高，麥冬的耐藥性最低，土麥冬居于中間。為了進(jìn)一步揭示其耐藥性的非靶標(biāo)機(jī)制，采用光鏡和掃描電鏡觀察了麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬的葉表皮顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬的氣孔主要分布于葉片下表皮，氣孔密度分別為37.6、36.15和23.92個(gè)/mm2。但是，土麥冬和闊葉土麥冬的氣孔在葉片上表皮也有分布，并且闊葉土麥冬上表皮的氣孔明顯多于土麥冬。麥冬草氣孔帶和非氣孔帶細(xì)胞在細(xì)胞長度、面積和長寬比等方面均存在差異。麥冬氣孔周圍的表皮細(xì)胞平周壁具明顯瘤狀突起，導(dǎo)致氣孔下陷；土麥冬氣孔周圍的表皮細(xì)胞平周壁呈波浪狀突起，使氣孔略下陷；闊葉土麥冬氣孔周圍的表皮細(xì)胞平周壁基本無突起，氣孔下陷不顯。這些結(jié)構(gòu)特征差異可能與麥冬草對草甘膦的耐藥性差異有一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：麥冬草；草甘膦耐性；氣孔密度；葉表皮；形態(tài)學(xué)

中圖分類號：S451文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1003-935X（2016）01-0001-07

Abstract：Three lilyturfs，Ophiopogon japonicas （OJ），Liriope spicata （LS） and Liriope platyphylla （LP） were reported to have evolved high natural tolerance to glyphosate. The main mechanism is attributed to a combination of unique EPSPS structure and increased EPSPS gene copy number and expression. This target-site mechanism，however，appears insufficient to explain the differences in glyphosate-tolerance among those three lilyturfs with the highest level observed in LP and the lowest in OJ （LS has intermediate tolerance）. To further investigate the non-target site mechanisms conferring glyphosate tolerance in the three lilyturfs，microscopic and submicroscopic structure of leaf epidermis were observed using LM and SEM. The stomata mainly distribute in the lower leaf epidermis of the three species with stomatal densities of 376，36.2 and 23.9 mm-2 in OJ，LS and LP，respectively. Furthermore，there were more stomata in the upper epidermis of LP than that of LS. There are also differences in cell length，area，and length-width ratio of stomatal and non-stomatal bands in the three lilyturfs. The periclinal wall of epidermis cells around stomata forming obviously strumous protuberances resulted in sunken stomata on leaves of OJ. The periclinal wall of LS had wavy protuberances and the stomata were only partially sunken. On the contrary，the periclinal wall of LP almost had no protuberances and the stomata were not sunken. These features may contribute to the different tolerance to glyphosate in three lilyturf species.

Key words：

lilyturf；glyphosate tolerance；stomatal density；leaf epidermis；morphology

草甘膦[N-（膦羧基甲基）甘氨酸]是一種非選擇性、廣譜、內(nèi)吸收傳導(dǎo)的莖葉處理除草劑，由于其具有廣譜、低毒、安全、無土壤殘留的特點(diǎn)，一直被認(rèn)為是迄今為止最為重要和最優(yōu)秀的除草劑[1]。自1974年美國孟山都公司開發(fā)草甘膦以來，由于其非選擇性的特點(diǎn)很長一段時(shí)間不能作為作物田的主要除草劑。但是，自1996開始，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物研制和商業(yè)化，使得草甘膦被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物田雜草的防除，草甘膦的用量迅猛增長，成為除草劑市場中的主導(dǎo)產(chǎn)品[2]，而且隨著全球抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)一步發(fā)展，草甘膦在全球除草劑市場中的主導(dǎo)地位將更為加強(qiáng)，隨之而來的是以草甘膦為主導(dǎo)的化學(xué)除草劑的單一化[3]。這加劇了人們對草甘膦抗性雜草問題的擔(dān)憂。

植物對草甘膦的抗藥性涉及到天然抗性和演化抗性[4]，前者是在沒有接觸過除草劑的情況下天生就有的在除草劑處理后能夠生存和繁殖的能力。de Gennaro等在沒有草甘膦使用歷史的地區(qū)發(fā)現(xiàn)了草甘膦抗性生物型的田旋花（Convolvulus arvensis）[5]；1990年Boerboom等證實(shí)了百脈根（Lotus corniculatus）對草甘膦存在耐藥性[6]；此后幾年又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了飯包草（Commelina benghalensis）[7]、亞洲鴨跖草（Commelina communis）[7]、狗肝菜（Dicliptera chinensis）[9]、藜（Chenopodium album）[10]以及茼麻（Abutilon theophrasti）[4]對草甘膦的耐性。這些種群會占據(jù)轉(zhuǎn)基因作物田中其他雜草的生態(tài)位，影響草甘膦除草效果，甚至對農(nóng)作的生產(chǎn)造成巨大的威脅[11]。

草甘膦作用于芳香族氨基酸合成過程中的一種重要酶——EPSP合成酶，莽草酸途徑存在于質(zhì)體中，負(fù)責(zé)芳香族氨基酸的合成。莽草酸是莽草酸-3-磷酸鹽的前體，也是EPSPS酶的底物。研究表明，草甘膦通過EPSPS的抑制引起莽草酸在組織中的積累，這可以用作標(biāo)記草甘膦藥害的一種手段[12]。經(jīng)草甘膦處理后，抗性和敏感性組織中莽草酸含量均有所提高，說明EPSPS對草甘膦敏感；Mueller等也得到類似的結(jié)論[13]。測定植物體內(nèi)莽草酸的累積量可以知道抗草甘膦酶活性的大小[14-16]。Feng等對抗性和敏感生物型小飛蓬的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)：敏感型莽草酸/草甘膦的比值越大說明EPSPS受抑程度越高；相反，抗性型兩者比值越小說明草甘膦對EPSPS的抑制程度越低[17]。草甘膦的非靶點(diǎn)抗性機(jī)制主要包括吸收傳導(dǎo)受阻、屏蔽作用和氧化代謝。假高粱（Sorghum halepense）的葉片吸收量減少導(dǎo)致對草甘膦產(chǎn)生抗性[18]；抗草甘膦生物型瑞士黑麥草（Lolium rigidum）體內(nèi)的草甘膦匯聚在植物的葉尖或根部[19-20]，同樣的抗性機(jī)制在幾個(gè)草甘膦抗性假高粱（Sorghum halepense）生物型中也得到證實(shí)[18，21]；草甘膦快速在液泡中隔離是小蓬草（Conyza canadensis）產(chǎn)生抗性的主要原因[22-23]；此外，小飛蓬（Conyza canadensis）還存在降低草甘膦的傳導(dǎo)以及將草甘膦代謝為其他化合物的機(jī)制[24]。氨基乙酸氧化酶（GO）也被證實(shí)能夠?qū)⒉莞熟⒀趸葾MPA和乙醛酸，但是，這一代謝途徑和GOX有所不同[25-26]。

在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)百合科植物麥冬、土麥冬和闊葉麥冬具有較高的草甘膦耐藥性，我們對它們的EPSPS基因進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)以及真核表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)EPSPS基因結(jié)構(gòu)差異、基因多拷貝以及高表達(dá)量共同導(dǎo)致了麥冬草對草甘膦的天然耐藥性[27]。但是，靶標(biāo)機(jī)制并不能完全解釋麥冬草的高草甘膦耐藥性的全部，因此，我們對麥冬草葉表皮形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，以期闡明麥冬草對草甘膦耐性的形態(tài)學(xué)機(jī)制。

1材料與方法

1.1植物材料的準(zhǔn)備

草甘膦耐藥性和莽草酸積累試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓溫室進(jìn)行。溫室溫度維持28～35 ℃，完全自然光照。12月至翌年1月挖取麥冬草的苗并且移栽至花盆中（直徑15 cm，高15 cm）。每種植物都是7個(gè)處理，每個(gè)處理4盆，每盆1株，重復(fù)3次。培養(yǎng)基質(zhì)為商品化的營養(yǎng)土，并且進(jìn)行適當(dāng)?shù)臐菜褪┓省⒗系娜~片剪去，長出的新葉用于草甘膦劑量響應(yīng)及莽草酸的含量測定試驗(yàn)。擬南芥的種子經(jīng)消毒后種于MS培養(yǎng)基上，1周后，待長出真葉，將幼苗移至盆中，培養(yǎng)基質(zhì)為營養(yǎng)土 ∶蛭石=3 ∶1，溫室溫度為23 ℃。

用于葉表皮形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察以及酶活測定的麥冬[Ophiopogon japonicus （Linn. f.） Ker-Gawl.，簡稱OJ]、土麥冬[Liriope spicata （Thunb.） Lour，簡稱LS]和闊葉土麥冬（Liriope platyphylla Wang et Tang，簡稱LP）采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，是人工種植的作為林陰下地表綠化植物的植株，生境一致。于2012年6同時(shí)采集麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬成熟、健康的葉片，每種植物隨機(jī)采集葉片20張。

1.2草甘膦劑量響應(yīng)試驗(yàn)

用不同濃度的草甘膦（農(nóng)達(dá)，41%異丙胺鹽水劑，孟山都公司生產(chǎn)）處理麥冬草幼苗，草甘膦濃度設(shè)置為0、375、750、1 500、3 000、6 000、12 000和 24 000 g a.i./hm2。由于敏感型麥冬草種群的缺失，采用擬南芥作為對照，草甘膦濃度梯度為0、40、120、240、400和600 g a.i./hm2。每種植物都是7個(gè)處理，每個(gè)處理4盆，每盆1株，重復(fù)3次。處理后3周采用五級目測法進(jìn)行藥害癥狀調(diào)查[28]。所得數(shù)據(jù)通過SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，用Logistic方程進(jìn)行回歸，得到回歸方程：Y=C+（D-C）/{1+exp[b×ln（X/ED50）]}。藥害綜合指數(shù)=1-[∑（該級別代表值×該級別的觀察株數(shù)）/（所有觀察株數(shù)×5）]。利用回歸方程計(jì)算ED50值。

1.3麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬葉表皮形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察

1.3.1葉表皮形態(tài)結(jié)構(gòu)的光學(xué)顯微鏡觀察參照邢全等的方法[29]用次氯酸鈉離析法制樣。取葉片中部中脈附近的部分，用FAA固定液固定24 h以上。在室溫條件下，用體積分?jǐn)?shù)20%的次氯酸鈉溶液離析3 d以上，至葉片變白為止；揭下葉表皮后制成水裝片，在Olympus光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。隨機(jī)選取3張經(jīng)過次氯酸鈉離析的葉表皮臨時(shí)裝片，在每張裝片的葉片上、下表皮隨機(jī)選5個(gè)視野，在10倍物鏡下拍照，計(jì)算氣孔密度；隨機(jī)選取3張經(jīng)過次氯酸鈉離析的葉表皮臨時(shí)裝片，在每張裝片的葉片上、下表皮的氣孔帶和非氣孔帶處隨機(jī)選5個(gè)視野，在40倍物鏡下拍照，每張照片統(tǒng)計(jì)約20個(gè)表皮細(xì)胞，利用JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算表皮細(xì)胞的面積及長寬比。氣孔密度=每個(gè)視野中的氣孔個(gè)數(shù)/視野面積。

1.3.2葉表皮形態(tài)結(jié)構(gòu)的常規(guī)掃描電鏡觀察參考Spector等的方法[30]進(jìn)行葉片常規(guī)掃描電鏡制樣。取葉片中部中脈附近的部分，置于體積分?jǐn)?shù)2%的戊二醛固定液（用0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液配制，pH值7.2）中，抽氣使其下沉，于0e～4e條件下固定3 d；用0. 1 mol/L磷酸鈉緩沖液清洗3次，每次約20 min；分別用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、90%和95%乙醇溶液及無水乙醇進(jìn)行系列脫水，每次約20 min，其中用無水乙醇脫水3次；使用醋酸異戊酯代換3次，每次約20 min；最后用CO2臨界點(diǎn)法進(jìn)行干燥。上述步驟完成后，用雙面膠帶將葉片的上、下表面粘在樣品臺上，用離子濺射儀鍍金膜，最后在XL-30型環(huán)境掃描電鏡（荷蘭飛利浦公司生產(chǎn)）下觀察并拍照。

2結(jié)果與分析

2.1草甘膦對麥冬草的藥效結(jié)果

溫室麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬對草甘膦的劑量反應(yīng)生測結(jié)果列于表1。藥后1周，6 000 g a.i./hm2及以下濃度草甘膦處理麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬沒有發(fā)現(xiàn)明顯的抑制作用（表1）；但是2個(gè)最高濃度 12 000 g a.i./hm2 [JP]以及24 000 g a.i./hm2處理產(chǎn)生極顯著抑制作用。不過，隨著處理時(shí)間的延長，抑制現(xiàn)象會加重，抑制的處理濃度下移。藥后3周，3 000 g a.i./hm2 及以下濃度處理對麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬沒有明顯的抑制；但是麥冬草對 6 000 g a.i./hm2 草甘膦濃度處理均產(chǎn)生顯著受害反應(yīng)，且三者之間的受抑制程度不存在顯著差異，植株大部分仍存活。12 000 g a.i./hm2濃度草甘膦處理時(shí)對3種植物的抑制率在62.5%以上。在 24 000 g a.i./hm2 處理下麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬基本全部死亡，說明24 000 g a.i./hm2濃度已經(jīng)超出了麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬的最大耐藥范圍。

對麥冬、土麥冬以及闊葉土麥冬噴施草甘膦后3周抑制率進(jìn)行Logistic方程回歸分析，進(jìn)一步由此方程計(jì)算出它們的ED50值（圖1）。麥冬、土麥冬以及闊葉土麥冬對草甘膦的ED50值分別為7 000、7 360和8 230 g a.i./hm2（圖1），說明麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬已經(jīng)具有較高的耐藥性。

2.2麥冬草葉表皮形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

2.2.1光學(xué)顯微鏡下3種植物葉表皮形態(tài)結(jié)構(gòu)的比較觀察結(jié)果表明，麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬的葉片氣孔均位于葉脈之間，呈帶狀分布。其中，麥冬的氣孔只分布在下表皮上，土麥冬和闊葉土麥冬的氣孔在葉片上下表皮均有分布，但下表皮氣孔明顯較多，闊葉土麥冬上表皮的氣孔明顯多于土麥冬。土麥冬上表皮氣孔帶處的表皮細(xì)胞呈長方形，排列較規(guī)則，而下表皮細(xì)胞多數(shù)呈多邊形，闊葉土麥冬上下表皮氣孔帶細(xì)胞都呈多邊形（圖2）。

麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬葉片上的氣孔均呈條帶狀分布，與葉片平行脈走向相同，處于2條平行葉脈的中間。3種植物的氣孔器都是由2個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞組成，保衛(wèi)細(xì)胞中含有葉綠體。麥冬氣孔周圍有瘤狀突起，由6個(gè)左右的瘤狀突起組成花環(huán)狀（圖3）。3種植物葉片的氣孔密度有一定的差異，麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬的葉片下表皮氣孔密度分別為37.6、36.15和23.92個(gè)/mm2（圖4）。

麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬下表皮氣孔帶細(xì)胞大小相似，麥冬下表皮非氣孔帶的細(xì)胞面積顯著小于土麥冬和闊葉土麥冬。麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬葉片氣孔帶處表皮細(xì)胞的長度、面積和長寬比均小于非氣孔帶處的表皮細(xì)胞，表明土麥冬和闊葉土麥冬葉片氣孔帶處的表皮細(xì)胞較小且相對較寬；闊葉土麥冬上下表皮的氣孔帶細(xì)胞面積大小相似，土麥冬下表皮的氣孔帶細(xì)胞面積顯著小于上表皮（圖5）。

2.2.2葉表皮形態(tài)結(jié)構(gòu)的常規(guī)掃描電鏡觀察麥冬葉片下表皮氣孔帶處的表皮細(xì)胞平周壁向外突起形成明顯的瘤狀突起物，尤其在氣孔周圍更明顯，使氣孔下陷；氣孔帶處表皮細(xì)胞的輪廓無法識別，但可以觀察到豐富的蠟質(zhì)紋絲（圖6-A、D）。土麥冬葉片下表皮氣孔帶處的表皮細(xì)胞平周壁局部向外呈波浪狀突起，尤其在氣孔周圍波浪狀突起非常明顯，使氣孔相對下陷，但遠(yuǎn)不如麥冬明顯；氣孔帶處表皮細(xì)胞的輪廓勉強(qiáng)可見，蠟質(zhì)較豐富（圖6-B、E）。闊葉土麥冬葉片下表皮氣孔帶處的表皮細(xì)胞平周壁基本沒有突起，氣孔下陷不明顯，氣孔帶處表皮細(xì)胞的輪廓很清楚，氣孔器和表皮細(xì)胞的表面蠟質(zhì)也較豐富（圖6-C、F）。

3討論

迄今，世界上已經(jīng)報(bào)道了一系列具有天然草甘膦耐性事例的植物，其耐藥性程度不同[4-6，8，10，31-32]。草甘膦天然抗性鴨跖草（Commelina communis）在840 g a.i./hm2處理下得以存活而敏感種群全部死亡[4]；另一種草甘膦天然抗性狗肝菜種群在3.3 kg a.i./hm2草甘膦處理下能夠存活，溫室試驗(yàn)也說明了其GR50值是其他種群的2～7倍[9]；4種草甘膦耐型藜種群的GR50值是1.48～322 kg a.i./hm2，而敏感型種群的GR50值是 0.57 kg a.i./hm2[10]。雖然不同國家和地區(qū)由于雜草種類及分布以及草甘膦使用歷史不同，草甘膦的大田使用劑量有所不同，但是大致的推薦劑量是在900～1 500 g a.i./hm2。因此，麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬對草甘膦的耐藥程度約為大田用量的5倍（圖1），具有較高的耐性，高于其他已報(bào)道天然草甘膦耐性植物。

我們在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，麥冬草存在3處特異的氨基酸，分別是71Met、112Ile和201Met，土麥冬EPSPS的IC50值、Km值和Ki（草甘膦）值都顯著高于野生型擬南芥，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將土麥冬EPSPS基因轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥對草甘膦的耐受性提高3.6倍[27]，而草甘膦生物測定結(jié)果為麥冬草對草甘膦的耐藥程度約為大田用量的5倍。由此說明麥冬草的特異EPSPS結(jié)構(gòu)貢獻(xiàn)了大部分對草甘膦的耐藥性，但是并未完全解釋麥冬草對草甘膦的耐藥性。并且，3種麥冬草對草甘膦耐藥性程度也存在差異，闊葉土麥冬的耐性最高，麥冬的耐性最低，土麥冬居于中間（圖1），說明非靶標(biāo)機(jī)制尤其是對草甘膦吸收傳導(dǎo)的阻礙或許也在麥冬草中存在作用。

近年來，在假高粱（Sorghum halepense）、瑞士黑麥草（Lolium rigidum）以及小飛蓬（Conyza canadensis）等植物中都發(fā)現(xiàn)存在降低對草甘膦的吸收傳導(dǎo)的機(jī)制[18，20，24]。草甘膦是莖葉吸收型的除草劑，而葉片是最直接最主要的吸收草甘膦的器官。葉片的大小及厚度、氣孔、表皮細(xì)胞及附屬物、柵欄組織、海綿組織、厚角組織和葉脈等形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)的變異，葉片在不同選擇壓力下形成了各種適應(yīng)類型，其結(jié)構(gòu)特征最能體現(xiàn)出環(huán)境因子的影響或植物對環(huán)境的適應(yīng)[33]。施用莖葉處理的除草劑時(shí)，藥液在植物葉面的附著性能是影響藥效的重要因素，尤其是對于內(nèi)吸性莖葉處理的農(nóng)藥而言，葉面附著是藥效發(fā)揮的必要條件，會直接影響除草劑的作用效果[34]。葉片對除草劑的吸收經(jīng)2種途徑進(jìn)行，即氣孔吸收與角質(zhì)層吸收。氣孔的分布特征、密度和面積等因素都影響除草劑的吸收。

麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬葉片的氣孔主要分布在葉片下表皮（圖2、圖3、圖6），會顯著減少葉片對草甘膦的吸收。氣孔下陷會增加草甘膦在葉面的停留，從而更利于對草甘膦的吸收。麥冬葉片表皮細(xì)胞平周壁瘤狀外突、氣孔下陷最為明顯（圖6-A、D），可能最有利于對草甘膦的吸收；土麥冬葉片表皮細(xì)胞平周壁也向外波浪狀突起，也導(dǎo)致氣孔一定程度的下陷（圖6-B、E），也會有利于對草甘膦的吸收；而闊葉土麥冬葉片表皮細(xì)胞平周壁突起不明顯、氣孔下陷也不明顯（圖6-C、F），表面更加光滑，導(dǎo)致藥液在葉表面存留減少，最終會導(dǎo)致對草甘膦吸收減少。這些結(jié)構(gòu)特征差異與3種麥冬草對草甘膦的耐藥性水平差異一致，或許可以作為解釋麥冬和土麥冬對草甘膦的耐受性低于闊葉土麥冬的形態(tài)學(xué)原因。

參考文獻(xiàn)：

[1]Duke S O，Powles S B. Glyphosate：a once-in-a-century herbicide[J]. Pest Management Science，2008，64（4）：319-325.

[2]Powles S B. Evolved glyphosate-resistant weeds around the world：lessons to be learnt[J]. Pest Management Science，2008，64（4）：360-365.

[3]強(qiáng) 勝，宋小玲，戴偉民.抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物面臨的機(jī)遇與挑戰(zhàn)及其發(fā)展策略[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，18（1）：114-125.

[4]Owen M D，Zelaya I A. Herbicide-resistant crops and weed resistance to herbicides[J]. Pest Management Science，2005，61（3）：301-311.

[5]de Gennaro F P，Weller S C. Differential susceptibility of field bindweed （Convolvulus arvensis） biotypes to glyphosate[J]. Weed Science，1984，32：472-476.

[6]Boerboom C M，Wyse D L，Somers D. Mechanism of glyphosate tolerance in birdsfoot trefoil （Lotus corniculatus）[J]. Weed Science，1990，38：463-467.

[7]Culpepper A S，F(xiàn)landers J T，York A C，et al. Tropical spiderwort （Commelina benghalensis） control in glyphosate-resistant cotton[J]. Weed Technology，2004，18：432-436.

[8]Culpepper A S. Glyphosate-induced weed shifts[J]. Weed Technology，2006，20（2）：277-281.

[9]Yuan C，Mou-Yen C，Yih-Ming C. Triple mechanisms of glyphosate-resistance in a naturally occurring glyphosate-resistant plant Dicliptera chinensis[J]. Plant Science Journal，2002，163：543-554.

[10]Westhoven A M，Kruger G R，Gerber C K，et al. Characterization of selected common lambsquarters （Chenopodium album） biotypes with tolerance to glyphosate[J]. Weed Science，2008，56：685-691.

[11]Nandula V K，Reddy K N，Duke S O，et al. Glyphosate-resistant weeds：current and future outlook[J]. Outlooks on Pest Manag，2005，16：183-187.

[12]Lydon J，Duke S O. Glyphosate induction of elevated levels of hydroxybenzoic acids in higher plants[J]. Food Chemistry，1988，36：813-818.

[13]Mueller T C，Massey J H，Hayes R M，et al. Shikimate accumulates in both glyphosate-sensitive and glyphosate-resistant horseweed （Conyza canadensis L. Cronq.）[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51（3）：680-684.

[14]宋小玲，馬波，皇甫超河，等. 除草劑生物測定方法[J]. 雜草科學(xué)，2004（3）：1-6.

[15]Pline W A，Wu J R，Hatzios K K. Effects of temperature and chemical additivies on the response of transgenic herbicide-resistant soybeans to glufosinate and glyphosate applications[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，1999，65：119-131.

[16]Fuchs M A. Mechanisms of glyphosate toxixity in velvet leaf （Abutilon thephrasti Medikus）[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，2002，74：27-39.

[17]Feng P C，Tran M，Chiu T，et al. Investigations into glyphosate-resistant horseweed （Conyza canadensis）：retention，uptake，translocation，and metabolism[J]. Weed Science，2004，52（4）：498-505.

[18]Vila-Aiub M M，Balbi M C，Distéfano A J，et al. Glyphosate resistance in perennial Sorghum halepense （Johnsongrass），endowed by reduced glyphosate translocation and leaf uptake[J]. Pest Management Science，2012，68（3）：430-436.

[19]Lorraine-Colwill D F，Powles S B，Hawkes TR，et al. Investigations into the mechanism of glyphosate resistance Lolium rigidum[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，2002，74：62-72.

[20]Yu Q，Abdallah I，Han H P，et al. Distinct non-target site mechanisms endow resistance to glyphosate，ACCase and ALS-inhibiting herbicides in multiple herbicide-resistant Lolium rigidum[J]. Planta，2009，230（4）：713-723.

[21]Powles S B，Yu Q. Evolution in action：plants resistant to herbicides[J]. Annual Review of Plant Biology，2010，61（61）：317-347.

[22]Ge X，DAvignon D A，Ackerman J J，et al. Rapid vacuolar sequestration：the horseweed glyphosate resistance mechanism[J]. Pest Management Science，2010，66（4）：345-348.

[23]Ge X，DAvignon D A，Ackerman J J，et al. Glyphosate-resistant horseweed made sensitive to glyphosate：low-temperature suppression of glyphosate vacuolar sequestration revealed by P-31 NMR[J]. Pest Management Science，2011，67（10）：1215-1221.

[24]González-Torralva F，Gil-Humanes J，Barro F，et al. Target site mutation and reduced translocation are present in a glyphosate-resistant Lolium multiflorum Lam. biotype from Spain[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2012，58：16-22.

[25]Job V，Marcone G L，Pilone M S，et al. Glycine oxidase from Bacillus subtilis. Characterization of a new flavoprotein[J]. Journal of Biological Chemistry，2002，277（9）：6985-6993.

[26]Pollegioni L，Schonbrunn E，Siehl D. Molecular basis of glyphosate resistance-different approaches through protein engineering[J]. FEBS Journal，2011，278（16）：2753-2766.

[27]Mao C J，Xie H J，Chen S G，et al. Multiple mechanism confers natural tolerance of three lilyturf species to glyphosate[J]. Planta，2015，243：321-335.

[28]Song X L，Wu J J. Zhang H J，et al. Occurrence of glyphosate-resistant horseweed （Conyza canadensis） population in China[J]. Agricultural Sciences in China，2011，10：1049-1055.

[29]邢全，石雷，劉保東，等. 蒙古莢蒾葉片解剖結(jié)構(gòu)及其在城市景觀和環(huán)境保護(hù)中的生態(tài)學(xué)意義[J]. 植物學(xué)通報(bào)，2004，21（2）：195-200.

[30]Spector D L，Goldman R D，Leinwand L A.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南（下冊） [M]. 北京：科學(xué)出版社，2001：1206-1225.

[31]Huang Z F，Zhang C X，Huang H J，et al. Molecular cloning and characterization of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene from convolvulus arvensis L[J]. Molecular Biology Reports，2014，41：2077-2084.

[32]Yuan C，Chen Y M，Chaing M Y. Responses of dicliptera chinensis to glyphosate[J]. Bull Plant Prot Bull，2001，43：29-38.

[33]李芳蘭，包維楷. 植物葉片形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)對環(huán)境變化的響應(yīng)與適應(yīng)[J]. 植物學(xué)通報(bào)，2005，22（增刊1）：118-127.

[34]劉支前. 表面活性劑對草甘膦葉面吸收的影響[J]. 農(nóng)藥，1998，37（4）：31-34.