翟好英，唐 衛(wèi)

(內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川內(nèi)江 641112)

肝素鈉是從豬或牛的腸粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，屬粘多糖類物質(zhì)。它作為世界上最有效和臨床用量最大的抗凝血藥物，主要應(yīng)用于心腦血管疾病和血液透析治療。此外，肝素鈉還有降血脂、抗中膜平滑肌細(xì)胞增生、促進(jìn)纖維蛋白溶解等多種生物活性和臨床用途。因此，對實(shí)際樣品中肝素鈉含量的分析研究有著較重要的意義。

目前測定肝素鈉的常見方法主要有分光光度法[1,2]、伏安法[3,4]、熒光法[5]、共振散射法[6，7]。本文研究發(fā)現(xiàn)，在pH=4.5的B-R緩沖液中，F(xiàn)e(Ⅲ)與磺基水楊酸反應(yīng)可生成紫紅色配合物，該體系中加入肝素鈉后在靜電引力作用下結(jié)合形成離子締合物，從而使得體系在257 nm和342 nm處的共振散射信號明顯降低。且隨著肝素鈉濃度的增大，體系的共振散射信號△I隨之減弱。據(jù)此建立了一種測定肝素鈉的共振散射法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4600型熒光分光光度計(日本,日立公司)，測定參數(shù)：激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5.0 nm，光電倍增管(PMT)電壓為400 V。pHS -3E型pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.1000 g肝素鈉，用超純水溶解，定容至100 mL容量瓶，得1.0 mg/mL 肝素鈉儲備液，使用時稀釋為50.0 μg/mL工作液。5-磺基水楊酸溶液：準(zhǔn)確稱取0.6350 g 5-磺基水楊酸，用超純水溶解定容至100 mL，得0.010 mol/L 5-磺基水楊酸溶液。B-R緩沖溶液：用0.040 mol/L磷酸、硼酸和乙酸配制而成，使用時用0.20 mol/L NaOH溶液在pH計上調(diào)至所需pH值。0.50 mg/mL Fe(Ⅲ)溶液。所有試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純(UP)水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

于10 mL比色管中，分別加入0.80 mL Fe(Ⅲ)溶液，0.30 mL 5-磺基水楊酸溶液，一定量的肝素鈉工作液及1.0 mL pH=4.5 B-R緩沖溶液，用超純水稀釋至5 mL，混勻，反應(yīng)20 min。用1 cm石英比色皿，在熒光分光光度計上同步掃描激發(fā)波長和發(fā)射波長，獲得體系的共振散射光譜；于最大散射峰波長342 nm處測定試樣溶液的共振散射強(qiáng)度Is和試劑空白的共振散射強(qiáng)度I0，并計算I=I0-Is。

2 結(jié)果與討論

2.1 共振散射光譜

在pH=4.5 B-R緩沖介質(zhì)中，F(xiàn)e(Ⅲ)與5-磺基水楊酸反應(yīng)生成紫紅色配合物，其在257 nm和342 nm產(chǎn)生2個共振散射峰。加入肝素鈉后，由于其在靜電引力作用下與Fe(Ⅲ)-磺基水楊酸配合物形成離子締合物，從而使得體系在257 nm和342 nm處的共振散射信號明顯降低。實(shí)驗(yàn)表明，隨著肝素鈉濃度的增加，體系的共振散射信號隨之降低(圖1)。且體系在342 nm處的共振散射信號與肝素鈉濃度之間有著良好的線性關(guān)系，故本文以342 nm為最佳測定波長。

2.2 反應(yīng)介質(zhì)的選取及酸度的影響

考察了反應(yīng)介質(zhì)HCl、H2SO4、H3PO4、NaAc-HAc、Walpole和B-R緩沖溶液對體系靈敏度和穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，B-R緩沖溶液較其它介質(zhì)好，故本文選用反應(yīng)介質(zhì)為B-R緩沖溶液。對B-R緩沖溶液的不同pH值進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，隨著pH值增大，體系的△I值亦隨之增大。當(dāng)pH值為4.5時，△I最大，之后又隨著pH值增大而減小。故本文選擇B-R緩沖溶液的最佳pH值為 4.5。對pH=4.5 B-R緩沖溶液的不同用量進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，當(dāng)其用量為1.0 mL時，體系的△I最大。

2.3 試劑加入順序的影響

對Fe(Ⅲ)、5-磺基水楊酸、 肝素鈉、B-R緩沖溶液的四種不同加入順序進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)以Fe(Ⅲ)+5-磺基水楊酸+肝素鈉+B-R緩沖液順序加入時，體系的信號強(qiáng)度及線性關(guān)系均較好。

2.4 Fe(Ⅲ)用量的優(yōu)化

試驗(yàn)了Fe(Ⅲ)用量對體系靈敏度和穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)e(Ⅲ)與5-磺基水楊酸之間發(fā)生配位反應(yīng)，其用量不足時，由于二者配位不完全使得體系的△I隨之增大而增大；當(dāng)其過量時，由于其與二者形成的配合物之間發(fā)生作用而使體系的△I又隨之減小。當(dāng)Fe(Ⅲ)的用量為0.8 mL時，體系△I最大且穩(wěn)定。故本實(shí)驗(yàn)選用Fe(Ⅲ)用量為0.8 mL。

2.5 5-磺基水楊酸用量的優(yōu)化

當(dāng)5-磺基水楊酸用量少時，其與Fe(Ⅲ)配位反應(yīng)不完全；若其用量過多時，會影響肝素鈉與Fe(Ⅲ)-磺基水楊酸配合物的結(jié)合。按照實(shí)驗(yàn)方法，考察了5-磺基水楊酸的用量對體系的△I的影響，結(jié)果表明，當(dāng)5-磺基水楊酸用量為0.3 mL時，體系的△I最大。故選用5-磺基水楊酸的最佳用量為0.3 mL。

2.6 反應(yīng)時間的影響

在優(yōu)化條件下，按照實(shí)驗(yàn)方法考察反應(yīng)時間的影響，結(jié)果表明試劑混合后即開始反應(yīng)，反應(yīng)20 min后，體系的共振散射信號基本不變。說明此體系的最佳反應(yīng)時間為20 min。

2.7 工作曲線與檢出限

按照實(shí)驗(yàn)方法，以△I對肝素鈉濃度作圖，繪制了工作曲線。在0.05～15.0 μg/mL范圍內(nèi)，體系的△I與肝素鈉濃度之間有較好的線性關(guān)系。其線性回歸方程為：△I=77.24c+3.458，線性相關(guān)系數(shù)為0.9976，檢出限為39.9 ng/mL。

2.8 共存物質(zhì)的影響

2.9 樣品分析

分別準(zhǔn)確移取3種不同批號的肝素鈉注射液(標(biāo)示效價12 500 IU/2mL)1.0 mL于100 mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻。再分別準(zhǔn)確移取各稀釋液1.0 mL，按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定，并做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。樣品的回收率在98.9%～102.2%之間,表明該方法有較好的重現(xiàn)性和可靠性。

表1 樣品分析結(jié)果

3 結(jié)論

本文探討了在B-R緩沖介質(zhì)中，F(xiàn)e(Ⅲ)與5-磺基水楊酸配位生成紫紅色配合物，繼而其在靜電引力作用下與肝素鈉結(jié)合形成離子締合物而使體系共振散射信號減弱的各種反應(yīng)條件。研究發(fā)現(xiàn)，體系的共振散射信號與肝素鈉的濃度之間存在較好的線性關(guān)系，從而建立了測定肝素鈉注射液中肝素鈉含量的新方法。